梁樂欣，黃曉辰，黃曉婷

（肇慶學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，廣東肇慶 526061）

紫蘇葉具有獨(dú)特的氣味，是我國南方常見的調(diào)味品。同時(shí)，紫蘇也是我國傳統(tǒng)的中草藥之一，已被我國衛(wèi)生部列為藥食兩用的中藥之一[1]，具有很高的研究價(jià)值。經(jīng)現(xiàn)代藥理學(xué)研究，紫蘇已經(jīng)分離鑒定出酚酸類、脂肪酸類、甾醇類、揮發(fā)油類、黃酮類化合物等化學(xué)成分100余種，具有多方面的生物活性，如解熱鎮(zhèn)靜、抗炎、抗過敏、抗氧化、促進(jìn)記憶等[2]。有研究表明，紫蘇多糖具有改善游泳行為和單胺類神經(jīng)遞質(zhì)異常的作用，同時(shí)還能吞噬金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和部分革蘭氏陽性及革蘭氏陰性細(xì)菌[3]。

常見的多糖提取方法有超聲提取法、熱水直接浸提法、酶提取法、微波提取法等。紫蘇葉細(xì)胞壁的主要成分是纖維素，利用纖維素酶水解細(xì)胞壁，使更多胞內(nèi)多糖溶出[3]。超聲波則是利用空化作用、熱效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)等加快有效物質(zhì)溶于溶劑，使多糖的提取率提高[4]。結(jié)合纖維素酶法和超聲提取法，以紫蘇干葉為原料提取紫蘇葉粗多糖，并利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化多糖提取的工藝參數(shù)，使多糖浸出率提高，為對紫蘇葉粗多糖的進(jìn)一步研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫蘇干葉，康美藥業(yè)股份有限公司提供；纖維素酶，上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供；乙酸鈉、冰乙酸、鹽酸、過硫酸鉀、三氯乙酸、氯化鈉等，均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

V-1100D型紫外-可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司產(chǎn)品；KX-1613T型超聲波清洗機(jī)，北京科璽世紀(jì)科技有限公司產(chǎn)品；DS-Y500A型高速多功能粉碎機(jī)，上海頂帥電器有限公司產(chǎn)品；HHS型電熱恒溫水浴鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；DHG-9145A型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；TG16-WS型高速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品。

1.3 工藝流程

紫蘇葉→洗凈、烘干→粉碎、過篩→纖維素酶處理→超聲處理→離心→上清液→濃縮→醇沉→離心沉淀→干燥→多糖粗品。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 紫蘇干葉粗多糖提取

稱取1 g經(jīng)粉碎過篩的紫蘇干葉，加入pH值4.8的緩沖溶液30 mL和一定量的纖維素酶，在一定的溫度和時(shí)間條件下酶解，在沸水浴中滅酶0.5 h。放入超聲清洗機(jī)中超聲一定的時(shí)間后，得到紫蘇葉粗多糖提取液。將提取液真空濃縮，加入80%乙醇醇沉后，以轉(zhuǎn)速4 000 r/s離心30 min，真空干燥后制得多糖粗品。

1.4.2 制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

利用蒽酮-硫酸法[5-6]，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。將編號為1～9的10 mL具塞試管中分別移取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9 mL，分別加水至2 mL，搖勻，加入6 mL蒽酮試劑（0.1 g蒽酮溶于100 mL 80%H2SO4），沸水浴15 min，冷水浴30 min，室溫下放置至常溫。用水作空白對照，于波長620 nm處測定吸光度。以質(zhì)量濃度和吸光度分別作為橫縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的回歸方程設(shè)為公式（1）。

1.4.3 樣品多糖含量的測定

將多糖粗品用蒸餾水定容至100 mL，從中吸取4 mL定容至100 mL作為待測樣液。從樣液中吸取2 mL，測定于波長620 nm處的吸光度，利用公式（2）計(jì)算換算系數(shù)f，

式中：W——紫蘇葉多糖的質(zhì)量，μg；

D——紫蘇葉多糖的稀釋倍數(shù)；

C——多糖溶液中葡萄糖的質(zhì)量濃度，μg/mL。再利用公式（3），計(jì)算多糖提取率：

式中：C——樣品溶液中葡萄糖質(zhì)量濃度，μg/mL；

D——樣品溶液稀釋倍數(shù)；

f——換算系數(shù)；

m——紫蘇葉干粉質(zhì)量，g。

1.4.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選取酶解時(shí)間、酶解溫度、加酶量和超聲時(shí)間4個(gè)因素，考查其對紫蘇多糖提取的結(jié)果影響。其中，酶解時(shí)間為20，30，40，50，60 min 5個(gè)水平；酶解溫度為35，40，45，50，55℃5個(gè)水平；加酶量為1 000，1 200，1 400，1 600，1 800 U/g 5個(gè)水平；超聲時(shí)間為20，30，40，50，60 min 5個(gè)水平，分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.4.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

運(yùn)用Box-behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對酶解時(shí)間、酶解溫度、加酶量和超聲時(shí)間4個(gè)影響因素進(jìn)行優(yōu)化，影響因素的低、中、高水平分別用-1，0，1表示，進(jìn)行響應(yīng)面分析。

1.4.6 羥基自由基清除率測定

移取0.5 mL樣品于試管中，加入濃度為100 mmol/L pH值7.4的PBS緩沖液2.5 mL，混勻后加入濃度為1 mmol/L的鄰二氮菲溶液1.5 mL，濃度為9 mmol/L的FeSO4溶液0.5 mL，立即混勻[7]。加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的H2O2溶液0.5 mL啟動(dòng)反應(yīng)，于37℃下保溫1 h，測定波長536 nm處的吸光度A。再以質(zhì)量濃度為2 g/L抗壞血酸溶液作對比試驗(yàn)，其中A管以不加H2O2的管調(diào)零，用PBS緩沖液調(diào)零A1和A2管。重復(fù)測定3次，計(jì)算清除率。下式中，A1為加入1.0 mL水代替提取液和雙氧水的管的吸光度；A2為加入0.5 mL水代替提取液的管的吸光度。以抗壞血酸作為對照組，清除率按公式（4）計(jì)算。

1.4.7 DPPH自由基清除率測定

用無水乙醇配制0.2 mmol/L的DPPH溶液，準(zhǔn)確吸取1.5 mL樣品待測溶液和0.2 mmol/L DPPH溶液0.5 mL，搖勻后在室溫下避光放置30 min，測量波長517 nm處的吸光度，每個(gè)樣品平行測定3次[8]。下式中，A0為DPPH溶液0.5 mL加蒸餾水1.5 mL的吸光度；A1為樣品溶液1.5 mL加DPPH溶液0.5 mL的吸光度；A2為樣品溶液1.5 mL加無水乙醇0.5 mL的吸光度。按照公式（5）計(jì)算各待測樣品對DPPH自由基的清除率，并用抗壞血酸做對照組。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

以葡萄糖質(zhì)量濃度、吸光度分別作為橫縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程Y=4.621 8X+0.055 3，R2=0.997 9。結(jié)果表明，無水葡萄糖在質(zhì)量濃度為0～0.5 mg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 酶解時(shí)間對多糖提取率的影響

在超聲時(shí)間50 min，加酶量1 000 U/g，酶解溫度40℃條件下，研究酶解時(shí)間20，30，40，50，60 min對多糖提取率的影響。

酶解時(shí)間對多糖提取率的影響見圖2。

圖2 酶解時(shí)間對多糖提取率的影響

由圖2可知，當(dāng)酶解時(shí)間為20～30 min時(shí)，提取率隨著時(shí)間增加而增加，說明酶與底物充分反應(yīng)，在30 min時(shí)多糖提取率最高，當(dāng)酶解時(shí)間為30～60 min時(shí)，提取出的多糖可能出現(xiàn)分解現(xiàn)象，使紫蘇葉多糖的提取率逐漸下降。

2.2.2 酶解溫度對多糖提取率的影響

在超聲時(shí)間50 min，加酶量1 000 U/g，酶解時(shí)間30 min條件下，研究酶解溫度20，30，40，50，60℃對多糖提取率的影響。

酶解溫度對多糖提取率的影響見圖3。

圖3 酶解溫度對多糖提取率的影響

由圖3可知，當(dāng)酶解溫度在30℃時(shí)，提取率最大；當(dāng)酶解溫度為30～60℃時(shí)，纖維素酶受熱，活性降低，催化能力減弱，提取率呈下降趨勢。由此可知，酶的最適溫度大約為30℃，此時(shí)酶的活性最大，水解反應(yīng)進(jìn)行得更順利。

2.2.3 加酶量對多糖提取率的影響

在超聲時(shí)間50 min，酶解時(shí)間30 min，酶解溫度30℃的條件下，研究加酶量0，500，1 000，1 500，2 000 U/g對多糖提取率的影響。

加酶量對多糖提取率的影響見圖4。

圖4 加酶量對多糖提取率的影響

由圖4可知，當(dāng)加酶量為0～1 500 U/g時(shí)，紫蘇葉多糖提取率隨加酶量的增加而提高；當(dāng)加酶量為1 500 U/g時(shí)，提取率最大；當(dāng)加酶量為1 500～2 000 U/g時(shí)，可能由于多余的纖維素酶沒有反應(yīng)底物，提取率隨加酶率增加不再提高。

2.2.4 超聲時(shí)間對多糖提取率的影響

在加酶量1 500 U/g，酶解溫度30℃，酶解時(shí)間30 min條件下，研究超聲時(shí)間20，30，40，50，60 min對多糖提取量的影響。

超聲時(shí)間對多糖提取率的影響見圖5。

圖5 超聲時(shí)間對多糖提取率的影響

由圖5可知，當(dāng)超聲時(shí)間為50 min時(shí)，多糖得率最高；當(dāng)超聲時(shí)間延長，超聲波的熱效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)會(huì)分解破壞多糖，使多糖提取率降低[9]。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 Box-behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

由單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，酶解時(shí)間為30 min，酶解溫度為30℃，加酶量為1 500 U/g，超聲時(shí)間為50 min時(shí)，多糖提取率接近最大值。以這些數(shù)值作為中間值，設(shè)定合理區(qū)域，利用Box-behnken響應(yīng)面法對提取工藝進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)水平見表1，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)水平

2.3.2 模型回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，此模型與該試驗(yàn)擬合良好，模型的p=0.046 7＜0.05，表明此試驗(yàn)?zāi)Ｐ筒町愶@著，失擬項(xiàng)p=0.289 4＞0.05，說明失擬項(xiàng)檢驗(yàn)不顯著，方程對試驗(yàn)的擬合度較好。

模型回歸系數(shù)顯著性見表3。

表3 模型回歸系數(shù)顯著性

2.3.3 因素相互影響的響應(yīng)面分析

根據(jù)數(shù)據(jù)模型所得響應(yīng)曲面可以直觀反映因素或因素之間的交互作用對紫蘇葉多糖得率影響的強(qiáng)弱，等高線呈橢圓形時(shí)因素之間交互作用強(qiáng)，等高線越圓交互作用越弱。響應(yīng)曲面越陡峭，則表示對提取率的影響越大。

酶解時(shí)間（A）與酶解溫度（B）對多糖提取率影響的響應(yīng)面圖見圖6，酶解時(shí)間（A）與加酶量（C）對多糖提取率影響的響應(yīng)面圖見圖7，酶解時(shí)間（A）與超聲時(shí)間（D）對多糖提取率影響的響應(yīng)面圖見圖8，酶解溫度（B）與加酶量（C）對多糖提取率影響的響應(yīng)面圖見圖9，酶解溫度（B）與超聲時(shí)間（D）對多糖提取率影響的響應(yīng)面圖見圖10，加酶量（C）與超聲時(shí)間（D）對多糖提取率影響的響應(yīng)面圖見圖11。

圖6 酶解時(shí)間（A）與酶解溫度（B）對多糖提取率影響的響應(yīng)面圖

圖7 酶解時(shí)間（A）與加酶量（C）對多糖提取率影響的響應(yīng)面圖

由圖6可知，因素A對多糖提取率的影響略大于因素B，而且因素A與因素B之間的交互影響也大。由圖7可知，因素A與因素C對多糖提取率的影響都比較大，且因素C大于因素A，兩者交互影響不大。由圖8可知，因素D對多糖提取的影響不顯著，小于因素A對多糖提取率的影響，因素D與因素A交互影響較大。由圖9可知，因素C對多糖提取率的影響大于因素B，且因素C與因素B交互影響小。由圖10可知，因素D對多糖提取率的影響小于因素B，且因素D與因素B交互影響小。由圖11可知，因素C對多糖提取率的影響大于因素D，且因素C與因素D交互影響大。

圖8 酶解時(shí)間（A）與超聲時(shí)間（D）對多糖提取率影響的響應(yīng)面圖

圖9 酶解溫度（B）與加酶量（C）對多糖提取率影響的響應(yīng)面圖

圖10 酶解溫度（B）與超聲時(shí)間（D）對多糖提取率影響的響應(yīng)面圖

綜合圖6～圖11可得，各因素對多糖提取率的影響程度為因素C＞因素A＞因素B＞因素D，且因素A與因素B、因素A與因素D、因素C與因素D之間交互影響大。

圖11 加酶量（C）與超聲時(shí)間（D）對多糖提取率影響的響應(yīng)面圖

2.3.4 最優(yōu)值預(yù)測及最優(yōu)工藝驗(yàn)證

經(jīng)Design Expert軟件分析，數(shù)學(xué)模型最優(yōu)提取率為4.539%，預(yù)測條件為加酶量2 000 U/g，酶解溫度20.4℃，酶解時(shí)間40 min，超聲時(shí)間60 min，在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)。

最優(yōu)工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 最優(yōu)工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果/%

由試驗(yàn)可得，多糖平均提取率為4.488 2%，實(shí)際值與最優(yōu)工藝預(yù)測值偏差為1.12%，表明Design Expert建立的數(shù)學(xué)模型可以用于優(yōu)化紫蘇葉多糖的提取工藝。因此，由Box-behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)得到的優(yōu)化的工藝條件準(zhǔn)確可靠。

2.4 紫蘇葉多糖抗氧化活性分析

2.4.1 紫蘇葉多糖溶液清除DPPH自由基的能力

紫蘇葉多糖溶液清除DPPH自由基的能力見圖12。

圖12 紫蘇葉多糖溶液清除DPPH自由基的能力

DPPH自由基能與抗氧化物提供的一個(gè)電子配對使其特征紫色消失，可根據(jù)其褪色程度來間接評價(jià)抗氧化物的抗氧化能力[10]。由圖12可知，紫蘇葉多糖對DPPH自由基的清除能力隨著多糖質(zhì)量濃度的增加逐漸增大，并呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系[11]，在質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到94.17%，略低于同質(zhì)量濃度抗壞血酸溶液的DPPH自由基清除率；當(dāng)質(zhì)量濃度高于0.2 mg/mL時(shí)，略高于同濃度抗壞血酸溶液的DPPH自由基清除率。

2.4.2 紫蘇葉多糖溶液清除羥基自由基的能力

紫蘇葉多糖溶液清除羥基自由基的能力見圖13。

由圖13可知，紫蘇葉多糖對羥基自由基有清除作用，當(dāng)紫蘇葉多糖質(zhì)量濃度為0.1～1.0 mg/mL時(shí)，隨著質(zhì)量濃度增加，紫蘇葉多糖清除羥基自由基的能力增強(qiáng)；當(dāng)多糖質(zhì)量濃度在0.2～1.0 mg/mL時(shí)，其對羥基自由基清除率都高于同質(zhì)量濃度抗壞血酸溶液對羥基自由基的清除率。

圖13 紫蘇葉多糖溶液清除羥基自由基的能力

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)面法對超聲波協(xié)同纖維素酶提取紫蘇葉多糖的條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了適當(dāng)有效的二次多項(xiàng)模型。優(yōu)化的最佳工藝條件為加酶量2 000 U/g，酶解溫度20.4℃，酶解時(shí)間40 min，超聲時(shí)間60 min，在此條件下紫蘇葉多糖的提取率為4.539%。對所提取紫蘇葉多糖的抗氧化試驗(yàn)顯示，隨著質(zhì)量濃度的增加，其清除DPPH自由基和羥自由基的能力逐漸增強(qiáng)，在質(zhì)量濃度0.1 mg/mL時(shí)其DPPH自由基清除率達(dá)到94.17%，在質(zhì)量濃度1.0 mg/mL時(shí)羥自由基清除率達(dá)到90.06%。超聲波法和纖維素酶法結(jié)合提取紫蘇葉多糖，具有高效、短時(shí)、作用條件溫和、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)[12]。