鮑遠 聶銘博 李孟偉 蔣永橋 康皓

創(chuàng)傷或衰老引起的組織損傷需要通過組織細胞再生來恢復(fù)結(jié)構(gòu)和功能。組織再生的機制包括兩種：一種是局部存在具有定向分化能力的干細胞，如皮膚；另一種是組織內(nèi)的終末分化細胞被重新激活，如肝臟[1]。然而很多人體組織不具備完全再生能力，這些組織損傷后，主要通過纖維化或瘢痕修復(fù)，從而造成組織、器官不同程度的功能障礙[1]。關(guān)節(jié)軟骨就是屬于這種不能再生的組織。以往治療關(guān)節(jié)軟骨損傷的方法包括骨髓刺激技術(shù)和自體軟骨移植，雖然在臨床上應(yīng)用已久，但并不能保證軟骨的有效修復(fù)，長期臨床效果并不理想[2-5]。因此，揭示組織再生修復(fù)的具體機制，對于研究非再生組織的損傷修復(fù)具有重要意義。

Hippo 通路是一個高度保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，它被認為是調(diào)節(jié)器官生長的主要機制。在哺乳動物中，其關(guān)鍵成員包括：MST1/MST2、LATS1/LATS2、SAV1 和MOB1A/MOB1B[6]。該通路的核心是激酶的級聯(lián)反應(yīng)，MST1/MST2和LATS1/LATS2 相繼激活后，使下游的yes 相關(guān)蛋白（yes-associated protein，YAP）和PDZ結(jié)合基序轉(zhuǎn)錄共激活因子（transcriptional co-activator with PDZ-binding motif，TAZ）發(fā)生磷酸化而失活，從而抑制YAP/TAZ的協(xié)同轉(zhuǎn)錄活性[7]。血管再生時，新生血管內(nèi)皮細胞中的YAP 表達量豐富，這意味著血管再生與YAP被激活有關(guān)[8-9]。在小鼠體內(nèi)過度激活YAP/TAZ 會導(dǎo)致多個器官的過度生長，如肝臟、心臟等[10-11]。因此，Hippo通路及其效應(yīng)蛋白YAP/TAZ的發(fā)現(xiàn)為組織損傷的再生修復(fù)提供了一種可能的干預(yù)機制。

淫羊藿苷（icariin）是一種異戊烯基黃酮醇苷類化合物，是我國傳統(tǒng)中藥淫羊藿的主要藥理學(xué)活性成分[12]。研究證實，淫羊藿苷通過誘導(dǎo)MC3T3-E1 細胞進入分裂期并下調(diào)周期抑制蛋白CDKN2B 的表達來促進其分裂增殖[13]。細胞增殖是組織再生的基礎(chǔ)，而YAP是參與組織器官生長的關(guān)鍵因子，因此，YAP有可能參與組織損傷后的細胞增殖過程。綜上，筆者推測淫羊藿苷可能通過調(diào)控YAP來促進細胞增殖。本研究探討淫羊藿苷是否能促進體外培養(yǎng)的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞的增殖，以及YAP在淫羊藿苷促進細胞增殖中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要實驗動物、試劑與儀器

關(guān)節(jié)軟骨細胞取自7 日齡Sprague-Dawley 大鼠的膝關(guān)節(jié)。大鼠來源于華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（鄂）2021-0009，實驗動物使用許可證號：SYXK（鄂）2021-0057。所有動物實驗操作均經(jīng)華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物倫理委員會批準。

主要試劑與儀器：胰蛋白酶-EDTA、胎牛血清、青霉素和鏈霉素（美國Gibco 公司），Ⅱ型膠原酶、DAPI 和Trizol 試劑（美國Invitrogen 公司），總RNA 提取試劑盒、cDNA 合成試劑盒和SYBR green（瑞典Azanno Biotech 公司），BCA 蛋白濃度檢測試劑盒、辣根過氧化物酶標記的二抗溶液和超敏ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），DMEM/F12（美國HyClone 公司），CCK8 試劑盒（日本Dojindo 公司），PVDF 膜（美國Millipore 公司），F(xiàn)ITC 偶聯(lián)的鬼筆環(huán)肽（美國Sigma-Aldrich 公司），PCNA、YAP、phospho-YAP、Ki67和CTGF抗體（美國CST公司），凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），免疫熒光顯微鏡（日本Nicon公司），酶標儀（美國BioTek公司）。

1.2 細胞分離和培養(yǎng)

采用頸椎脫臼法處死大鼠，然后用乙醇浸泡尸體消毒15 min。解剖大鼠四肢，切取關(guān)節(jié)軟骨放入培養(yǎng)皿中，用剪刀將軟骨剪成大小約0.5 mm3的小碎塊，加入0.25%的胰蛋白酶-EDTA消化15 min。去除胰蛋白酶溶液，加入0.1%的Ⅱ型膠原酶后，在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育8 h。然后在離心機內(nèi)以1200 r/min的速度離心5 min，去除上清液，收集軟骨細胞沉淀。軟骨細胞用含有10%胎牛血清、青霉素（100 IU/mL）和鏈霉素（0.1 mg/mL）的DMEM/F12吹打分散，并放入含5%CO2的37℃保溫箱中培養(yǎng)。

1.3 細胞增殖實驗

用CCK8 試劑盒來測定軟骨細胞增殖情況。以每孔3000個細胞的密度將軟骨細胞接種至96孔板中。24 h后，用不同濃度的淫羊藿苷（0、0.0001、0.001、0.01、0.1、1和10 μmol/L）分別干預(yù)1、2、3、4和5 d，每個濃度設(shè)置3 個復(fù)孔。每天更換新鮮的培養(yǎng)基和藥物。檢測時，去除孔內(nèi)舊的培養(yǎng)基，加入90 μL新鮮培養(yǎng)基和10 μL CCK8溶液，并在37℃下避光孵育1 h。最后用酶標儀測定在450 nm處的吸光度值。

1.4 Western Blot實驗

用1 μmol/L 的淫羊藿苷分別干預(yù)軟骨細胞0、4、8、12 和24 h。然后用Western Blot 檢測YAP 的表達量和磷酸化程度。干預(yù)方法為：0 h 組用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；4 h組用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)20 h后，加入1 μmol/L的淫羊藿苷繼續(xù)培養(yǎng)4 h；8 h組用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h后，加入1 μmol/L的淫羊藿苷繼續(xù)培養(yǎng)8 h；12 h 組用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后，加入1 μmol/L 的淫羊藿苷繼續(xù)培養(yǎng)12 h；24 h 組加入1 μmol/L 的淫羊藿苷培養(yǎng)24 h。用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA 溶液裂解軟骨細胞。在低溫（4℃）高速（12000g）離心機內(nèi)離心20 min 后提取上清液。用BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定上清液中的總蛋白濃度。通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離樣本中不同分子量的蛋白質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜后，把PVDF 膜放在5%的BSA 溶液中常溫封閉1 h，然后在4℃條件下將PVDF 膜放入含一抗的溶液中孵育過夜。次日將PVDF膜放入TBST溶液中漂洗3次，并在辣根過氧化物酶標記的二抗溶液中常溫孵育1 h。最后采用超敏ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒與凝膠成像系統(tǒng)檢測和分析目的蛋白印跡。

1.5 RT-qPCR實驗

用0.01、0.1、1 和10 μmol/L 的淫羊藿苷干預(yù)軟骨細胞，2 d 后檢測Ki67、PCNA、CyclinD1、YAP、Ankrd1和CTGF基因的表達情況。用1 μmol/L 的淫羊藿苷干預(yù)軟骨細胞，分別干預(yù)0、12、24、36 和48 h，然后檢測Ki67、PCNA和CyclinD1基因的表達情況。干預(yù)方法為：0 h組用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h；12 h 組用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)36 h 后，加入1 μmol/L 的淫羊藿苷繼續(xù)培養(yǎng)12 h；24 h 組用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，加入1 μmol/L的淫羊藿苷繼續(xù)培養(yǎng)24 h；36 h組用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后，加入1 μmol/L的淫羊藿苷繼續(xù)培養(yǎng)36 h；48 h組加入1 μmol/L的淫羊藿苷培養(yǎng)48 h。軟骨細胞在Trizol試劑中裂解后，用總RNA提取試劑盒提取細胞裂解中的總RNA。采用cDNA合成試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。實時定量PCR 在含有2×SYBR green、引物、cDNA 和雙蒸餾水的20 μL 反應(yīng)體積中進行。引物序列如下：PCNA forward 5’-AAGGGCTGAAGATAATGCTGATA-3’，PCNA reverse 5’-CATATACGTGCAAATTCACCAGAT-3’；Ki67 forward 5’-CGGAGCACTTTGAAACACCA-3’，Ki67 reverse 5’-TGTCACGGCAGAGAGTTCTT-3’；CyclinD1 forward 5’-TGCGTGCAGAGGGAGATTGT-3’，CyclinD1 reverse 5’-GCGGATAGAGTTGTCAGTGTAGATG-3’；YAP forward 5’-ACCCTCGTTTTGCCATGAAC-3’，YAP reverse 5’-CCTGCCGAAATAACTCCTGC-3’；Ankrd1 forward 5’-TGGCAGAATGGAACCAAAGC-3’，Ankrd1 reverse 5’-TCTCCCTATTTGGCTGGCAA-3’；CTGF forwards 5’-ACCAGTGTGAAGACCTACCG-3’，CTGF reverse 5’-GTCCCTTACTCCCTGGCTTT-3’；GAPDH forward 5’-CAAGTTCAACGGCACAGTCA-3’，GAPDH reverse 5’-CCCCATTTGATGTTAGCGGG-3’。

1.6 免疫熒光染色

用1 μmol/L的淫羊藿苷干預(yù)軟骨細胞后，通過免疫熒光染色檢測Ki67 在細胞內(nèi)的表達情況及YAP 的亞細胞定位。在室溫下軟骨細胞用4%的多聚甲醛固定15 min，然后用0.3%的Triton X-100處理10 min，以及用5%BSA封閉1 h。然后在4℃下用一抗溶液孵育過夜。棄去一抗溶液，用PBS 清洗3 遍，再加入熒光標記的二抗溶液，在避光和常溫條件下孵育1 h。肌動蛋白用FITC 偶聯(lián)的鬼筆環(huán)肽孵育30 min，細胞核用DAPI 孵育5 min。最后用免疫熒光顯微鏡檢測目標蛋白的顯色情況。

1.7 細胞轉(zhuǎn)染實驗

使用含有針對大鼠YAP mRNA的shRNA的慢病毒載體（pLKO.1）進行YAP 沉默實驗。設(shè)計的3 條shRNA 序列如下：GGTCAGAGATACTTCTTAAAT，GGGCCTCTTCCTGATGGATGG，GGCAATACGGAATATCAATCC。陰性對照序列為：GCAAGCTGACCCTGAAGTT。通過將包裝質(zhì)粒psPAX2、 pMD2. G 和shRNA pLKO. 1 載 體 共 轉(zhuǎn) 染HEK293-T 細胞產(chǎn)生慢病毒顆粒，并收集病毒上清液。軟骨細胞在稀釋的病毒上清液（1∶1）中培養(yǎng)8 h。棄去上清液，用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后，再用含有2 μg/mL 嘌呤霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞5 d，幸存的細胞即為轉(zhuǎn)染成功的細胞。通過實時定量PCR 和Western Blot 確定具有最佳沉默效果的shRNA。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)分析。計量資料采用均數(shù)±標準差表示，兩組間計量資料比較采用t檢驗，多組間計量資料比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 淫羊藿苷對關(guān)節(jié)軟骨細胞增殖的影響

如圖1A 所示，0.01、0.1、1 和10 μmol/L 的淫羊藿苷具有明顯的促進軟骨細胞增殖的作用（P＜0.05）。其中，在1 μmol/L的淫羊藿苷作用下，細胞數(shù)量最多，意味著細胞增殖最活躍。在0.01 ～10 μmol/L 的范圍內(nèi)，隨著淫羊藿苷濃度的增加，PCNA、Ki67和CyclinD1基因的表達先增加，在0.1 或1 μmol/L 時達到頂峰，隨后開始下降（見圖1B）。隨著干預(yù)時間的延長，PCNA和Ki67基因的表達逐漸增加，CyclinD1基因的表達總體呈上升趨勢（見圖1C）。免疫熒光染色結(jié)果顯示，淫羊藿苷干預(yù)后，軟骨細胞內(nèi)Ki67的表達明顯增多（見圖1D）。

圖1 淫羊藿苷對關(guān)節(jié)軟骨細胞增殖及其相關(guān)基因表達的影響：A.淫羊藿苷對細胞增殖的作用；B.在不同濃度的淫羊藿苷作用下，Ki67、PCNA和CyclinD1基因的表達情況；C.在淫羊藿苷干預(yù)的不同時間點，Ki67、PCNA和CyclinD1基因的表達情況；D.淫羊藿苷對Ki67蛋白表達的影響

2.2 淫羊藿苷促進YAP及其靶基因的表達

隨著淫羊藿苷濃度的增加，YAP及其靶基因的表達逐漸增加，當(dāng)濃度達到10 μmol/L 時，這些基因的表達下降（見圖2A）。隨著淫羊藿苷干預(yù)時間的延長，YAP及其靶基因的表達總體呈上升趨勢（見圖2B）。

圖2 淫羊藿苷對YAP及其靶基因表達的影響。A.在不同濃度的淫羊藿苷作用下，YAP及其靶基因（Ankrd1和CTGF）的表達情況；B.在淫羊藿苷干預(yù)的不同時間點，YAP及其靶基因（Ankrd1和CTGF）的表達情況。

2.3 沉默YAP基因后能抑制淫羊藿苷上調(diào)增殖相關(guān)基因表達的作用

預(yù)先設(shè)計3 種不同序列的shRNA（shYAP1、shYAP2和shYAP3），采用qPCR 和Western Blot 的方法篩選出最佳序列shYAP3（見圖3A），將其應(yīng)用于后續(xù)實驗。隨著YAP基因的沉默，靶基因（CTGF和Ankrd1）以及增殖相關(guān)基因（PCNA、Ki67和CyclinD1）的表達被顯著抑制，而且淫羊藿苷不再促進這些基因的表達（見圖3B、圖3C）。Western Blot 結(jié)果顯示由于YAP的沉默，CTGF 和PCNA 蛋白的表達被抑制，同時，淫羊藿苷不再促進CTGF 和PCNA蛋白的表達。

圖3 沉默YAP基因后，淫羊藿苷對YAP靶基因及增殖相關(guān)基因表達的影響：A.三條shRNA序列對YAP基因的沉默效果；B.沉默YAP基因后，YAP 及其靶基因（CTGF 和Ankrd1）的表達，以及淫羊藿苷對這些基因表達的作用；C.沉默YAP 基因后，增殖相關(guān)基因（PCNA，Ki67和CyclinD1）的表達，以及淫羊藿苷對這些基因表達的作用；D.沉默YAP基因后，PCNA和CTGF蛋白的表達，以及淫羊藿苷對這些蛋白表達的作用

2.4 淫羊藿苷能促進YAP去磷酸化并進入細胞核內(nèi)

Western Blot結(jié)果顯示，隨著干預(yù)時間延長，YAP的磷酸化程度降低（見圖4A）。免疫熒光結(jié)果顯示，在淫羊藿苷的作用下，YAP 主要集中在細胞核內(nèi)，而對照組中，YAP均勻分布在細胞內(nèi)（見圖4B）。

圖4 淫羊藿苷對YAP磷酸化程度及亞細胞定位的影響：A.在淫羊藿苷干預(yù)的不同時間點，YAP蛋白的磷酸化程度和總YAP蛋白的表達量；B.淫羊藿苷作用后，YAP蛋白的亞細胞定位

3 討論

關(guān)節(jié)軟骨損傷后難以完全再生，這可能與成熟軟骨中缺乏血管、軟骨細胞密度較低及增殖能力差等因素有關(guān)[14-15]。隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，基質(zhì)聯(lián)合自體軟骨細胞植入在治療關(guān)節(jié)軟骨缺損中具有顯著的潛力。然而組織工程支架的生物力學(xué)特性、細胞親和性等方面存在的問題，以及支架中軟骨細胞容易發(fā)生退變是限制軟骨組織工程發(fā)展的關(guān)鍵瓶頸[2]。如何提高軟骨細胞自身的增殖能力，啟動損傷部位軟骨的再生過程，對于軟骨損傷的修復(fù)具有重要意義。

在本研究中，采用不同濃度的淫羊藿苷（0.0001、0.001、0.01、0.1、1和10 μmol/L）去干預(yù)軟骨細胞，通過CCK8 試劑盒檢測發(fā)現(xiàn)0.0001 和0.001 μmol/L 的淫羊藿苷對軟骨細胞不具有明顯促進細胞增殖的作用（P＞0.05）。而在0.01 ～1 μmol/L 的濃度范圍內(nèi)，淫羊藿苷具有顯著促進細胞增殖的作用（P＜0.05），且隨著濃度的升高，細胞的增殖速度逐漸增加。當(dāng)淫羊藿苷濃度達到10 μmol/L時，細胞增殖速度雖然比對照組高，但比1 μmol/L組低，原因可能是高濃度的淫羊藿苷對細胞產(chǎn)生了一定的毒性。淫羊藿苷促進關(guān)節(jié)軟骨細胞增殖的有效濃度范圍與其他文獻中報道的促進骨髓間充質(zhì)干細胞增殖的有效濃度范圍一致[16]。PCNA是DNA聚合酶的輔助蛋白；Ki67在處于有絲分裂期的細胞中活躍表達；CyclinD1屬于細胞周期蛋白家族，能促進有絲分裂的進行，因此它們能作為評價細胞增殖的分子標志[17-18]。在0.01 ～1 μmol/L的淫羊藿苷作用下，軟骨細胞內(nèi)PCNA、Ki67 和CylinD1 的表達均明顯升高，進一步證實淫羊藿苷促進軟骨細胞增殖的作用。然而僅僅觸發(fā)終末分化細胞的增殖并不足以完成有效的再生過程[19]，組織的再生過程存在其他調(diào)控機制。

Hippo 信號通路及其效應(yīng)蛋白YAP/TAZ 被認為是胚胎組織器官生長發(fā)育的主要調(diào)節(jié)器。同時，它還參與器官和組織的再生修復(fù)，調(diào)節(jié)細胞的增殖、去分化，以及干細胞或祖細胞的擴增等過程[6-7]。出生后哺乳動物的心肌細胞一直被認為不具有再生能力。然而通過抑制Hippo 信號通路來提高YAP的活性，會導(dǎo)致小鼠的心肌細胞重新獲得增殖和再生的能力[11,20]。在心肌梗死的小鼠模型中，通過抑制Sav1或LAT1/LAT2基因來激活YAP/TAZ，能啟動心肌的再生修復(fù)，改善心臟功能，增加小鼠存活率[19,21]。這些研究結(jié)果提示，重新激活與胚胎細胞增殖和器官生長有關(guān)的YAP/TAZ可能會觸發(fā)非再生組織器官的細胞增殖和再生過程。本研究發(fā)現(xiàn)，沉默YAP基因的表達不但能夠抑制軟骨細胞增殖，而且能消除淫羊藿苷促進增殖的作用，進一步證明YAP在軟骨細胞增殖過程中的關(guān)鍵作用。此外，淫羊藿苷不僅能促進YAP 及其靶基因（Ankrd1和CTGF）的表達，還能使YAP去磷酸化而活化?；罨腨AP進入細胞核內(nèi)，能啟動增殖和再生過程。在淫羊藿苷的作用下，軟骨細胞中的YAP表達顯著升高并進入細胞核內(nèi)，該結(jié)果證實淫羊藿苷具有激活YAP活性的作用。由于活化的YAP能夠觸發(fā)非再生組織的細胞增殖和再生過程，筆者推測淫羊藿苷有可能通過激活YAP 來啟動成熟關(guān)節(jié)軟骨的再生過程，從而促進損傷軟骨的再生修復(fù)。