耿斐

(山東建筑大學(xué) 學(xué)報(bào)編輯部，山東 濟(jì)南250101)

0 引言

蛋白質(zhì)是生物體形態(tài)結(jié)構(gòu)和生命活動(dòng)依賴的物質(zhì)基礎(chǔ)，是一切生物體的重要組成成分，在生命的新陳代謝和自我復(fù)制過程中起著極其重要的作用[1]。蛋白質(zhì)是一類兩性物質(zhì)，可以與包括表面活性劑[2-3]、藥物[4-5]、染料[6-7]以及金屬離子[8-9]等在內(nèi)的許多種類的小分子結(jié)合。 蛋白質(zhì)的功能是由特定的三維空間結(jié)構(gòu)決定的，與小分子的相互作用會(huì)引起其分子中各級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，導(dǎo)致其化學(xué)性質(zhì)的變化和生物活性的喪失，最嚴(yán)重的還會(huì)引起變性。

乳清蛋白是一種重要的食品添加劑，已廣泛應(yīng)用于乳制品、肉制品和糕點(diǎn)等不同的領(lǐng)域。 β-乳球蛋白(β-lactoglobulin，β-Lg)是由乳腺上皮細(xì)胞合成的乳蛋白， 是主要的乳清蛋白之一[10]。JELIN′SKA 等[11]應(yīng) 用 泰 勒 分 散 分 析( Taylor Dispersion Analysis，TDA)研究了陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉對(duì)β-乳球蛋白的變性，根據(jù)不同表面活性劑濃度下形成的復(fù)合物的擴(kuò)散系數(shù)，分析了復(fù)合物的結(jié)構(gòu)變化，確定了改變蛋白質(zhì)天然構(gòu)象所需的表面活性劑的最低濃度。 MADADLOU 等[12]研究了乳清蛋白與低分子量表面活性劑吐溫(Tween)的絡(luò)合及形成的乳清-唾液蛋白聚集物的特性。Tween 將β-乳球蛋白二聚體分解為單體，降低了不溶性聚集體的大小。 此外，表面活性劑的絡(luò)合作用也降低了乳清蛋白的表面疏水性和蛋白質(zhì)分子間的相互作用。 DAN 等[13]研究了β-Lg 與陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉混合溶液在水/空氣和水/正己烷界面形成的吸附界面層的界面壓力，從而考察了蛋白質(zhì)/表面活性劑體系在界面上的相互作用。

現(xiàn)有關(guān)于β-Lg 相互作用的文獻(xiàn)多為β-Lg 與陰離子表面活性劑及嵌段共聚物的報(bào)道[14-17]，β-Lg與陽離子表面活性劑相互作用的研究較少見。 文章通過表面張力、電導(dǎo)率、圓二色光譜及內(nèi)源熒光光譜等手段考察了3 種咪唑類表面活性劑1-烷基-3-甲基溴化咪唑(C12mimBr、C14mimBr 及C16mimBr)與β-Lg相互作用過程中的作用方式以及β-Lg 結(jié)構(gòu)的變化，補(bǔ)充了β-Lg 的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

咪唑類表面活性劑1-烷基-3-甲基溴化咪唑的結(jié)構(gòu)式如圖1 所示。 C12mimBr、C14mimBr 及C16mimBr為依據(jù)文獻(xiàn)[18]合成的產(chǎn)品，其合成過程為:在氮?dú)獗Ｗo(hù)的條件下，控制溫度在75 ～80 ℃之間，甲基咪唑、過量的溴代烷烴以及乙腈攪拌回流反應(yīng)48 h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去過量的溴代烷烴和乙腈；減壓蒸餾以除去水，即得到最終產(chǎn)物。 產(chǎn)物經(jīng)過核磁共振圖譜確定其純度。 β-Lg 購自美國(guó)默克(Sigma-Aldrich)公司。

圖1 1-烷基-3-甲基溴化咪唑結(jié)構(gòu)示意圖

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

用3 次蒸餾水分別配制了3 種咪唑類表面活性劑/β-Lg(β-Lg 為0.18 g/L)體系的溶液，未加入緩沖溶液調(diào)節(jié)pH 值。 每次實(shí)驗(yàn)時(shí)，測(cè)量體系的pH 值均在7～7.2 之間。 因?yàn)棣?Lg 的等電點(diǎn)為5.3，所以實(shí)驗(yàn)時(shí)β-Lg 顯負(fù)電性。

表面張力數(shù)值是用吊環(huán)法在JYW-200B 型表面張力儀上通過單測(cè)的方法得到的，至少測(cè)量3 次，直到測(cè)得的差值＜0.2 mN/m。 實(shí)驗(yàn)溫度分別為25、35、45 ℃。

使用DDS-307 型電導(dǎo)率儀測(cè)量體系的電導(dǎo)率，實(shí)驗(yàn)溫度為25 ℃。

遠(yuǎn)紫外圓二色光譜通過JASCO J-810 圓二色光譜儀進(jìn)行測(cè)量。 使用1 mm 的圓形石英池，其帶寬為2 nm。 通過儀器自帶的Secondary structure 軟件計(jì)算不同表面活性劑濃度下β-Lg 中α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則蜷曲的量。 實(shí)驗(yàn)溫度為25 ℃。

使用Perkin Elmer LS-55 熒光光譜儀進(jìn)行內(nèi)源熒光的測(cè)量，固定激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，在295 ～440 nm范圍掃描表面活性劑/β-Lg 體系的熒光光譜圖。 實(shí)驗(yàn)溫度為25 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 咪唑類表面活性劑/β-Lg 體系的表面張力及電導(dǎo)率

分別測(cè)定了25、35、45 ℃下C12mimBr/β-Lg 體系的表面張力值，如圖2 所示。 圖2 中曲線出現(xiàn)了3 個(gè)較明顯的拐點(diǎn)，對(duì)應(yīng)的表面活性劑濃度分別稱為T1、T2及 臨 界 膠 束 濃 度( Critical Micelle Concentration，CMC)。 由圖2 可知，溫度的改變對(duì)T1及T2并沒有影響。 由于溫度對(duì)靜電相互作用的影響很小，可知C12mimBr 在濃度為T1及T2時(shí)，與β-Lg的相互作用以靜電作用為主[19]。 開始時(shí)，加入的C12mimBr 以極性咪唑頭基與β-Lg 帶負(fù)電的氨基酸殘基相結(jié)合，曲線出現(xiàn)第一個(gè)拐點(diǎn)T1。 隨著C12mimBr的逐漸加入，吸附在β-Lg 表面的表面活性劑分子增多，β-Lg 表面的吸附達(dá)到飽和。 由于β-Lg含有兩個(gè)二硫鍵，繼續(xù)加入的C12mimBr 導(dǎo)致β-Lg 的一對(duì)二硫鍵斷裂，暴露出了更多的極性基團(tuán)，新加入的C12mimBr 分子又能夠以其極性頭基吸附在這些暴露的氨基酸殘基上，表面張力曲線出現(xiàn)第二個(gè)拐點(diǎn)T2。 繼續(xù)加入C12mimBr 至濃度為CMC，其在β-Lg上的吸附達(dá)到飽和后，開始形成膠束。

圖2 C12mimBr/β-Lg 在不同溫度下的表面張力圖

測(cè)定了25 ℃下3 種表面活性劑/β-Lg 體系的表面張力值，如圖3 所示。 得到的T1、T2與CMC 的數(shù)值見表1。 與未加入β-Lg 相比，表面活性劑/β-Lg 體系的CMC 有顯著增大，說明表面活性劑在β-Lg 上先于膠束形成發(fā)生了強(qiáng)烈的吸附，之后再在水中形成聚集體。

表1 25 ℃時(shí)3 種表面活性劑/β-Lg 體系的T1、T2及CMC 數(shù)值表

圖3 25 ℃時(shí)3 種表面活性劑/β-Lg 體系表面張力圖

測(cè)定了3 種表面活性劑/β-Lg 體系的電導(dǎo)率，如圖4 所示。 雙折線的折點(diǎn)對(duì)應(yīng)著膠束的形成。 通過電導(dǎo)率曲線可以更清楚地得到β-Lg 存在時(shí)3 種表面活性劑的CMC。 C12mimBr/β-Lg、C14mimBr/β-Lg 及C16mimBr/β-Lg 體系中表面活性劑的CMC 分別為0.35、0.035 及0.04 mol/L，與表面張力法得到的CMC 處于同一數(shù)量級(jí)。

反離子解離度α=膠束形成后的直線斜率/膠束形成前的直線斜率，反離子結(jié)合度β=1-α。 由圖4 計(jì)算得到C12mimBr/β-Lg、C14mimBr/β-Lg 及C16mimBr/β-Lg體系的反離子結(jié)合度β分別為0.19、0.28及0.40。

圖4 3 種表面活性劑/β-Lg 體系電導(dǎo)率圖

2.2 咪唑類表面活性劑/β-Lg 體系的光譜學(xué)研究

2.2.1 遠(yuǎn)紫外圓二色

表面活性劑與BSA 的相互作用會(huì)導(dǎo)致BSA 的結(jié)構(gòu)發(fā)生一些變化，可以通過圓二色光譜檢測(cè)BSA二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。 在圓二色光譜上，α-螺旋結(jié)構(gòu)的特征峰表現(xiàn)為208 及222 nm 附近的兩個(gè)負(fù)槽，β-折疊結(jié)構(gòu)的特征峰表現(xiàn)為215 nm 附近的負(fù)槽。 因?yàn)棣?Lg 中β-折疊構(gòu)象的量遠(yuǎn)超過α-螺旋構(gòu)象的量，所以圓二色圖譜的負(fù)槽出現(xiàn)在215 nm 附近。

表面活性劑/β-Lg 體系隨表面活性劑濃度變化的遠(yuǎn)紫外圓二色光譜如圖5 所示。 在圖5(a)中，當(dāng)C12mimBr 濃度逐漸增加到3×10-5mol/L 時(shí)，β-Lg的β-折疊的量顯著降低，二級(jí)結(jié)構(gòu)完全被破壞。 在圖5(b)和(c)中，當(dāng)C14mimBr、C16mimBr 的濃度分別增加到1×10-4mol/L 時(shí)，完全破壞了β-Lg 的二級(jí)結(jié)構(gòu)。 結(jié)合表面張力結(jié)果可知，此時(shí)的表面活性劑濃度＞T1，β-Lg 的一個(gè)二硫鍵斷裂，三級(jí)結(jié)構(gòu)改變的同時(shí)二級(jí)結(jié)構(gòu)也遭到了破壞。 通過圓二色結(jié)果可知，咪唑類表面活性劑對(duì)β-Lg 的二級(jí)結(jié)構(gòu)有較大的破壞性，很低的濃度就能造成β-Lg 結(jié)構(gòu)的改變。

圖5 3 種表面活性劑/β-Lg 體系遠(yuǎn)紫外圓二色光譜圖

2.2.2 內(nèi)源熒光

表面活性劑/β-Lg 體系中β-Lg 的內(nèi)源熒光隨表面活性劑濃度的變化如圖6 所示。 色氨酸殘基的熒光光譜對(duì)微環(huán)境的變化很敏感，其峰位一般在325～350 nm 之間變動(dòng)。 由圖6 可以看出，β-Lg 的熒光發(fā)射峰位于350 nm 附近，是色氨酸殘基的特征熒光光譜。 β-Lg 的最大熒光發(fā)射峰峰位置并不隨著表面活性劑濃度的增加而改變，說明表面活性劑沒有造成色氨酸殘基周圍微環(huán)境的改變，沒有與色氨酸殘基發(fā)生結(jié)合。 C12mimBr/β-Lg 及C16mimBr/β-Lg 體系最大熒光發(fā)射峰峰值隨著表面活性劑的加入出現(xiàn)了先增大后減小的現(xiàn)象，說明色氨酸殘基的溶解度發(fā)生了變化。 當(dāng)加入的表面活性劑濃度較低時(shí)，造成色氨酸殘基溶解度變大，最大熒光發(fā)射峰峰值變大，隨著表面活性劑濃度的進(jìn)一步增大，色氨酸殘基溶解度變小，最大熒光發(fā)射峰峰值變小。C14mimBr/β-Lg體系最大熒光發(fā)射峰峰值隨著表面活性劑的加入逐漸變小，說明隨著C14mimBr 的加入，色氨酸殘基溶解度逐漸變小。

圖6 3 種表面活性劑/β-Lg 體系內(nèi)源熒光光譜圖

3 結(jié)論

通過上述研究，得到以下結(jié)論:

(1) 咪唑類表面活性劑1-烷基-3-甲基溴化咪唑與β-Lg 的作用方式與表面活性劑的濃度有關(guān)。當(dāng)表面活性劑濃度較低時(shí)，作用方式為靜電相互作用，表面活性劑的加入導(dǎo)致β-Lg 中的二硫鍵斷裂，表面活性劑進(jìn)一步與二硫鍵斷裂后暴露出的氨基酸殘基作用；當(dāng)表面活性劑濃度較高時(shí)，作用方式為疏水相互作用，且相互作用對(duì)CMC 的影響很大。

(2) C12mimBr/β - Lg、 C14mimBr/β - Lg 及C16mimBr/β-Lg體系的反離子結(jié)合度分別為0.19、0.28 及0.40。

(3) C12mimBr、C14mimBr、C16mimBr 分別在3×10-5、1×10-4、1×10-4mol/L 造成了β-Lg 二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，但表面活性劑不與β-Lg 上的色氨酸殘基直接作用。