程成鵬，賀稚非,2，唐春，李芳，廖林，李洪軍,2*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)2(重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶，400715) 3(四川高金實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司，四川 遂寧，629000)

豬大腸又叫豬臟、肥腸、葫蘆頭，是豬的內(nèi)臟器官，包括盲腸、結(jié)腸和直腸，管壁分為黏膜層、黏膜下層、肌肉層、漿膜層，是我國(guó)飲食體系中常見的食材。同時(shí)豬大腸在中醫(yī)體系中還有潤(rùn)燥、補(bǔ)虛、止渴止血等醫(yī)療養(yǎng)生價(jià)值[1]。但豬大腸存在口感堅(jiān)韌，久煮不爛的缺點(diǎn)。

嫩度是影響肉感官的重要因素之一[2-3]，其在消費(fèi)者的購(gòu)買決策中，尤其是重復(fù)性購(gòu)買中起著重大的作用。嫩度受到一系列生物和環(huán)境因素的影響，例如肌肉組成、脂肪含量、畜種和品種、鈣蛋白酶及鈣蛋白酶抑制蛋白、宰前和宰后的處理等[4]。目前物理嫩化方法主要有沖擊波法、超高壓法、滾揉法等。滾揉嫩化是通過(guò)機(jī)械作用對(duì)肉進(jìn)行翻滾、摔打從而使肉質(zhì)表面結(jié)構(gòu)松軟柔嫩，但這種方法存在交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)[5]。超高壓技術(shù)是通過(guò)高壓破壞肌漿網(wǎng)膜和溶酶體膜，激活鈣蛋白酶，增加胞漿內(nèi)組織蛋白酶數(shù)量，從而降解肌原纖維蛋白，肉品得到嫩化，但該方法可能對(duì)肉品的色澤、持水力和風(fēng)味造成一定的負(fù)面影響[6]。沖擊波是指在幾分之一毫秒產(chǎn)生的高達(dá)1 GPa的壓力波，具有低成本、效率高的優(yōu)點(diǎn)，該技術(shù)最先應(yīng)用于牛肉的嫩化，但其對(duì)產(chǎn)品包裝要求較高，商業(yè)化推廣具有一定的局限性[7]?；瘜W(xué)嫩化方法中常用嫩化劑主要有鹽類、有機(jī)酸、磷酸鹽等[8]。這些化學(xué)物質(zhì)主要是通過(guò)改變蛋白質(zhì)溶解度或影響蛋白酶作用從而提高食品嫩度[8]。生物嫩化方法主要是利用外源蛋白酶消化結(jié)締組織和肌肉蛋白質(zhì)[9]，降低肉的剪切力，從而達(dá)到嫩化的效果。目前，木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、獼猴桃蛋白酶的應(yīng)用較為廣泛，其中木瓜蛋白酶為含疏基肽鏈內(nèi)切酶，穩(wěn)定性高，對(duì)蛋白質(zhì)、多肽類、酯類等物質(zhì)有著較強(qiáng)的水解能力[10-11]，可以作用于膠原蛋白和彈性蛋白從而水解肌肉蛋白并增加肉的嫩度[12]。

本研究通過(guò)響應(yīng)面設(shè)計(jì)，以NaOH、木瓜蛋白酶為嫩化方法，對(duì)豬大腸進(jìn)行嫩化處理，以得率、蒸煮損失、剪切力和感官評(píng)分為評(píng)價(jià)手段，對(duì)比研究化學(xué)和生物方法對(duì)豬大腸嫩化的最佳條件，填補(bǔ)豬大腸嫩化研究的空白，以期為豬大腸嫩化方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

豬大腸由四川高鑫食品股份有限公司提供，于-18 ℃的環(huán)境下貯藏。

1.2 主要試劑

NaOH，重慶躍翔化工有限公司；NaHCO3(純度≥99%)、CaCl2(純度≥99%)，均為分析純，上海源葉生物科技有限公司，木瓜蛋白酶(5萬(wàn)U/g)、菠蘿蛋白酶(3萬(wàn)U/g)，河北萬(wàn)邦實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

FA214A分析天平，上海豪晟科學(xué)儀器有限公司；C-LM3B型數(shù)顯式肌肉嫩度儀，北京天翔飛域儀器設(shè)備有限公司；磁力攪拌水浴鍋，常州恩培儀器制造有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 單因素試驗(yàn)

研究不同NaOH質(zhì)量濃度(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/L)、時(shí)間 (20、25、30、35、40 min)和溫度(25、30、35、40、45 ℃)對(duì)豬大腸嫩化效果的影響。研究不同木瓜蛋白酶質(zhì)量濃度(1.6、1.8、2.0、2.2、2.4 g/L)、時(shí)間(70、80、90、100、110 min)和溫度(25、30、35、40、45 ℃)對(duì)豬大腸嫩化效果的影響。

1.4.2 樣品嫩化處理

將豬大腸置于4 ℃條件下解凍12 h，去除表面可見脂肪，清洗干凈，將其分為大小均勻,質(zhì)量約3.5 g的肉塊,每10 g豬大腸為1組。之后按照料液比1∶10(g∶mL)放入盛有嫩化劑的燒杯中，在恒溫水浴鍋中進(jìn)行浸泡處理，一定時(shí)間后將豬大腸取出。

1.4.3 制成率測(cè)定

先將豬大腸水分濾干，之后用濾紙吸干表面水分，準(zhǔn)確稱其質(zhì)量并記錄，制成率計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

1.4.4 剪切力的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[13-14]的方法，稍作修改，取適量豬大腸肉按照上述方法嫩化處理后，置于蒸煮袋中在90 ℃條件下進(jìn)行恒溫水浴加熱，20 min后取出樣品。將處理好的樣品切成1 cm×1 cm×5 cm的長(zhǎng)方體，用嫩度儀進(jìn)行測(cè)試,每個(gè)樣品測(cè)3次取其平均值。

1.4.5 蒸煮損失測(cè)定

參考李明奇等[13]的方法稍做修改，將處理后的肉進(jìn)行稱重，記為m1，然后置于蒸煮袋中，于90 ℃恒溫水浴鍋中蒸煮20 min后取出，用濾紙吸干表面水分并稱重，記為m2，每個(gè)樣品需平行測(cè)定3次。蒸煮損失計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

1.4.6 感官評(píng)定

參考SALLAM[15]的方法略作修改，經(jīng)過(guò)感官評(píng)定實(shí)驗(yàn)培訓(xùn)，選擇10名(5男5女)食品科學(xué)學(xué)院研究生組成感官評(píng)價(jià)小組，按照感官評(píng)定實(shí)驗(yàn)要求，對(duì)嫩化后的豬大腸色澤、咀嚼性、氣味、硬度和風(fēng)味進(jìn)行感官評(píng)定，感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standards

1.4.7 響應(yīng)面設(shè)計(jì)

以NaOH質(zhì)量濃度、時(shí)間和溫度為自變量進(jìn)行單因素試驗(yàn)，感官評(píng)分為響應(yīng)值，用Design-Expert 8.0.6.1進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。試驗(yàn)各因素水平見表2。

表2 感官評(píng)分響應(yīng)面優(yōu)化的因素水平表Table 2 Factors and levels of response surface optimization on sensory score

以木瓜蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)、時(shí)間和溫度為自變量進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以剪切力為響應(yīng)值，用Design-Expert 8.0.6.1進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。試驗(yàn)各因素水平見表3。

表3 剪切力響應(yīng)面優(yōu)化的因素水平表Table 3 Factors and levels of response surface optimization on shear force

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均采用Design-Expert.V8.0.6.1軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析, 單因素方差分析采用SPSS Statistics 19.0軟件進(jìn)行處理，采用Origin 2018繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同嫩化劑對(duì)豬大腸嫩化效果對(duì)比

由圖1可知，NaHCO3、菠蘿蛋白酶對(duì)豬大腸剪切力影響比NaOH和木瓜蛋白酶小，CaCl2使豬大腸剪切力增加。NaOH、木瓜蛋白酶能夠明顯降低剪切力，其中NaOH降低豬大腸剪切力效果最好，但蒸煮損失比木瓜蛋白酶大?？赡苁且?yàn)樨i大腸在堿液中表面膜和結(jié)締組織被部分破壞，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。木瓜蛋白酶水解膠原蛋白和彈性蛋白從而增加豬大腸的嫩度[8]。因此，綜合考慮選擇NaOH和木瓜蛋白酶這2種嫩化劑進(jìn)行工藝優(yōu)化。

圖1 不同嫩化劑對(duì)豬大腸的嫩化效果對(duì)比結(jié)果Fig.1 Comparison of tenderizing effect of different tenderizing agents on pig large intestine

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 NaOH質(zhì)量濃度對(duì)豬大腸品質(zhì)的影響

由圖2可知，隨著NaOH質(zhì)量濃度的增加，得率呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì)，當(dāng)NaOH質(zhì)量濃度達(dá)到1 g/L時(shí)，得率達(dá)到最大，此時(shí)豬大腸吸水最多。NaOH質(zhì)量濃度在0.5～2 g/L時(shí)，蒸煮損失顯著下降。當(dāng)達(dá)到2 g/L時(shí)，蒸煮損失達(dá)到最小。NaOH質(zhì)量濃度在0.5～1 g/L時(shí)，剪切力顯著下降，而感官評(píng)分顯著增加，達(dá)到最大值。之后隨著濃度的增加，剪切力和感官評(píng)分都有下降，但不顯著。這可能是因?yàn)檫m當(dāng)濃度的堿液能夠使蛋白質(zhì)溶解暴露親水基團(tuán)，從而提高吸水性和降低剪切力。當(dāng)堿的濃度過(guò)大，會(huì)破壞豬大腸結(jié)構(gòu)，吸水過(guò)多，從而降低口感[16]。

a-得率和蒸煮損失；b-剪切力和感官評(píng)分圖2 NaOH質(zhì)量濃度對(duì)豬大腸品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of NaOH concentration on the quality of pig large intestine

2.2.2 NaOH處理時(shí)間對(duì)豬大腸品質(zhì)的影響

由圖3可知，隨著處理時(shí)間的增加，得率和蒸煮損失都呈上升趨勢(shì)，說(shuō)明處理時(shí)間對(duì)得率和蒸煮損失都存在顯著影響。剪切力和感官評(píng)分在20～25 min時(shí)分別呈顯著下降和上升的趨勢(shì)，并且感官評(píng)分在25 min時(shí)達(dá)到最大值，之后逐漸下降。說(shuō)明在25 min時(shí)，豬大腸嫩度較好，感官品質(zhì)最佳。當(dāng)時(shí)間為35 min時(shí)，剪切力顯著下降，此時(shí)感官評(píng)分較低。說(shuō)明此時(shí)豬大腸內(nèi)部結(jié)構(gòu)已經(jīng)遭到破壞，咀嚼性差。

a-得率和蒸煮損失；b-剪切力和感官評(píng)分圖3 NaOH處理時(shí)間對(duì)豬大腸品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of NaOH treatment time on the quality of pig large intestine

2.2.3 NaOH處理溫度對(duì)豬大腸品質(zhì)的影響

由圖4可知，隨著溫度的增加，得率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)溫度40 ℃時(shí)達(dá)到最大值，吸水最多。蒸煮損失在35～40 ℃時(shí)，顯著下降，說(shuō)明此時(shí)豬大腸持水性較好。剪切力隨著溫度升高呈現(xiàn)一個(gè)先下降后上升的趨勢(shì)。當(dāng)溫度為40 ℃時(shí)，達(dá)到最低值。感官評(píng)分隨著溫度的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)溫度達(dá)到40 ℃時(shí)，感官評(píng)分最高。說(shuō)明溫度為40 ℃時(shí)，豬大腸品質(zhì)最佳。

a-得率和蒸煮損失；b-剪切力和感官評(píng)分圖4 NaOH處理溫度對(duì)豬大腸品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of NaOH treatment temperature on pig large intestine quality

2.2.4 木瓜蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)、處理時(shí)間和溫度對(duì)蒸煮損失和剪切力影響

由圖5-a可知，隨著木瓜蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加蒸煮損失和剪切力都呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)。質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到2%時(shí)剪切力達(dá)到最小值。木瓜蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)處于2%～2.2%時(shí)蒸煮損失處于最小值且變化不大。根據(jù)前人研究，木瓜蛋白酶是一種低特異性巰基酶，它能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)分子內(nèi)部的肽鏈—CO—NH—分解成多肽和氨基酸[17]。在適宜條件下，可以提高保水性，獲得更好的口感。當(dāng)木瓜蛋白酶添加過(guò)量時(shí)，剪切力和蒸煮損失都上升。這是因?yàn)槟竟系鞍酌高^(guò)量使用會(huì)導(dǎo)致蛋白水解過(guò)度，保水性和感官品質(zhì)下降[18]。如圖5-b所示，隨著酶處理的時(shí)間增加，蒸煮損失和剪切力都呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，并且都在100 min時(shí)達(dá)到最小值。豬大腸嫩化是一定程度的水解，當(dāng)木瓜蛋白酶處理時(shí)間適宜，可以有效降低豬大腸剪切力，提高嫩度。當(dāng)處理時(shí)間超過(guò)100 min，豬大腸過(guò)度水解，失水老化，嫩度降低[8]。木瓜蛋白酶有最適的反應(yīng)溫度，如圖5-c所示，當(dāng)溫度處于25～35 ℃時(shí)，豬大腸的剪切力隨著溫度的升高而逐漸降低，木瓜蛋白酶嫩化效果十分明顯；當(dāng)嫩化溫度大于35 ℃時(shí)，豬大腸的剪切力反而增加。因此，木瓜蛋白酶處理豬大腸最佳溫度為35 ℃，在此溫度條件下，豬大腸的嫩化和保水效果較好。

a-木瓜蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)；b-木瓜蛋白酶處理時(shí)間；c-木瓜蛋白酶溫度圖5 木瓜蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)、處理時(shí)間和溫度對(duì)蒸煮損失和剪切力影響Fig.5 Effects of papain mass fraction, treatment time and temperature on cooking loss and shear force

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化豬大腸的嫩化工藝

2.3.1 響應(yīng)面分析因素和水平選擇

響應(yīng)面優(yōu)化豬大腸嫩化工藝試驗(yàn)結(jié)果見表4和表5。

表4 感官評(píng)分Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 The design matrix and result of Box-Behnken experiments (sensory score)

表5 剪切力Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 The design matrix and result of Box-Behnken experiments (shear force)

運(yùn)用Design-Expert.V8.0.6.1軟件對(duì)表中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到堿處理后感官評(píng)分(Y1) 與3個(gè)嫩化因子A、B、C的關(guān)系如公式(3)所示:

Y1=7.68+0.45A-0.20B+0.25C+0.25AB-0.95AC-0.95BC-0.86A2-0.86B2-0.96C2

(3)

式中：Y1，感官評(píng)分；A，NaOH質(zhì)量濃度；B，堿處理時(shí)間；C，堿處理溫度。

得到木瓜蛋白酶處理后剪切力(Y2)與3個(gè)嫩化因子A、B、C的關(guān)系如公式(4)所示：

Y2=11.74-0.13A-0.15B-0.23C+0.022AB-0.16AC-0.030BC+2.03A2+0.29B2+0.71C2

(4)

式中：Y2，剪切力；A，木瓜蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)；B，時(shí)間；C，溫度。

回歸方程中每項(xiàng)系數(shù)絕對(duì)值的大小直接反映了各個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度，系數(shù)的正負(fù)則反映了影響的方向。

2.3.2 多元回歸模型分析

表6 感官評(píng)分多元回歸模型方差分析Table 6 Analysis of variance and multiple regression model on sensory scores

表7 剪切力多元回歸模型方差分析Table 7 Analysis of variance and multiple regression model (shear force)

2.3.3 響應(yīng)面模型中各因素的交互效應(yīng)分析

應(yīng)用Design-Expert.V8.0.6.1軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，各因素對(duì)響應(yīng)值的影響可以用等高線和響應(yīng)曲面來(lái)表示，結(jié)果如圖6與圖7所示。

圖6顯示了不同NaOH質(zhì)量濃度(A)、時(shí)間(B)、溫度(C)對(duì)豬大腸感官評(píng)分的影響，響應(yīng)面圖為曲面，說(shuō)明3個(gè)因素之間有一定的交互作用，其中AC、BC之間存在極顯著交互作用(P<0.001)，AB之間存在高度顯著作用(P<0.01)。由圖6-a可知，當(dāng)嫩化時(shí)間為24 min左右，NaOH質(zhì)量濃度為1.1 g/L左右時(shí)，豬大腸的感官評(píng)分最高，兩因素對(duì)比，NaOH質(zhì)量濃度對(duì)感官評(píng)分影響較大。在適宜NaOH濃度范圍內(nèi)，豬大腸的脂蛋白分解率會(huì)隨著NaOH質(zhì)量濃度提高而增加，擴(kuò)散到豬大腸內(nèi)部的水分增加，從而增加制成率、增加嫩度。但NaOH質(zhì)量濃度過(guò)高，會(huì)使豬大腸吸水過(guò)多，豬大腸的內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)遭到破壞，從而保水性、感官品質(zhì)變差[19]。由圖6-b可知，當(dāng)嫩化溫度在41 ℃左右，NaOH質(zhì)量濃度為1.1 g/L左右時(shí)，豬大腸的感官評(píng)分最高，且響應(yīng)曲面的等高線圖呈現(xiàn)橢圓形，說(shuō)明二者之間有顯著交互作用。這可能是因?yàn)檫m當(dāng)濃度的堿液和溫度能夠使蛋白質(zhì)溶解暴露親水基團(tuán)，提高吸水性和降低剪切力[18, 20-21]。由圖6-c可知，當(dāng)嫩化溫度為41 ℃左右，嫩化時(shí)間為24 min左右時(shí)，豬大腸的感官評(píng)分最高。

a-NaOH處理時(shí)間和質(zhì)量濃度；b-NaOH處理溫度和質(zhì)量濃度；c-NaOH處理溫度和處理時(shí)間圖6 各因素的交互效應(yīng)對(duì)感官評(píng)分的影響Fig.6 Effect of interaction of various factors on sensory score

a-木瓜蛋白酶處理時(shí)間和溫度；b-木瓜蛋白酶處理時(shí)間和酶用量；c-木瓜蛋白酶處理溫度和酶用量圖7 各因素的交互效應(yīng)對(duì)剪切力的影響Fig.7 Effect of interaction of various factors on shear force

圖7顯示了不同木瓜蛋白酶質(zhì)量(A)、時(shí)間(B)、溫度(C)對(duì)豬大腸感官品分的影響，響應(yīng)面圖為曲面，說(shuō)明3個(gè)因素之間有一定的交互作用，其中AC之間存在顯著交互作用(P<0.05)。由圖7-a可知，當(dāng)嫩化時(shí)間為102 min左右，嫩化溫度為36 ℃左右時(shí)，豬大腸的剪切力最低。肌內(nèi)結(jié)締組織的變化對(duì)肉的嫩度影響較大，其中肌束膜和肌內(nèi)膜中的膠原蛋白起關(guān)鍵作用[22]。隨著溫度升高到適宜范圍，膠原蛋白適當(dāng)變性，豬大腸的剪切力降低。由圖7-b可知，當(dāng)嫩化時(shí)間為102 min左右，酶用量為2.0%左右時(shí)，豬大腸的剪切力最高，由圖7-c可知，當(dāng)嫩化溫度為36 ℃左右，酶用量為2.0%左右時(shí)，豬大腸的剪切力最高。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)合回歸模型和響應(yīng)曲面圖，得到2種嫩化劑嫩化豬大腸的感官評(píng)分和剪切力最佳工藝條件是:以NaOH為嫩化劑時(shí)最佳參數(shù)組合為NaOH質(zhì)量濃度為1.08 g/L，時(shí)間為24.2 min，溫度為40.63 ℃，此時(shí)豬大腸的感官評(píng)分為7.750。以木瓜蛋白酶為嫩化劑時(shí)最佳參數(shù)組合為木瓜蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.01%，時(shí)間為101.69 min，溫度為36.32 ℃，此時(shí)豬大腸的剪切力為11.695 N。

為進(jìn)一步驗(yàn)證響應(yīng)面優(yōu)化的準(zhǔn)確性，根據(jù)實(shí)際操作對(duì)最優(yōu)條件進(jìn)行調(diào)整，在NaOH質(zhì)量濃度為1.1 g/L，時(shí)間為24 min，溫度為41 ℃的條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到嫩化后的豬大腸感官評(píng)分為7.4，與響應(yīng)面優(yōu)化的結(jié)果相對(duì)誤差為4.73%，響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果準(zhǔn)確可信。在木瓜蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%，時(shí)間為102 min，溫度為36 ℃的條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到嫩化后的豬大腸剪切力為12.36 N，與響應(yīng)面優(yōu)化的結(jié)果相對(duì)誤差為5.38%，響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果準(zhǔn)確可信。

3 結(jié)論

NaOH與木瓜蛋白酶來(lái)嫩化豬大腸制品，都可以顯著增加得率，降低剪切力。以NaOH為嫩化劑時(shí)最佳參數(shù)組合為NaOH質(zhì)量濃度為1.1 g/L，時(shí)間為24 min，溫度為41 ℃，此時(shí)豬大腸的感官評(píng)分為7.7。以木瓜蛋白酶為嫩化劑時(shí)最佳參數(shù)組合為木瓜蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%，時(shí)間為102 min，溫度為36 ℃，此時(shí)豬大腸的剪切力為11.70 N。說(shuō)明這2種嫩化劑對(duì)豬大腸的嫩化和品質(zhì)改善效果較好,有一定實(shí)用價(jià)值，可以為豬大腸的精深加工提供參考。