賈宏茹，王笑笑，胡景卉，劉金韻，黃京城，施斌斌，傅劍雄，孫駿，羅先富

鐵過載通過直接或者間接產(chǎn)生活性氧自由基，導致不同程度的細胞損傷和器官功能障礙[1]，尤其是在肝臟，嚴重的鐵過載可導致肝硬化，甚至肝癌[2]。肝臟鐵濃度(liver iron concentration，LIC)是身體鐵濃度的可靠指標[3]。經(jīng)皮肝穿刺活檢是定量LIC的定量的金標準，但其具有抽樣誤差，且有侵襲性、出血、感染等嚴重并發(fā)癥風險而不利于臨床推廣[4]。

鐵作為順磁性物質(zhì)，能夠縮短組織T1、T2和T2*馳豫時間[5]。馳豫法通過對磁共振成像信號損失的定量評估，來定量測量組織內(nèi)的鐵濃度，基于自旋回波序列計算T2常數(shù)，以及基于梯度回波序列計算T2*常數(shù)，兩者都可以通過在多個TE內(nèi)獲得的信號強度的衰減來計算。重度鐵過載時，受第一個TE長短的限制，無法精確捕獲信號衰減過程。超短回波序列(ultra-short echo time，UTE)通常指TE<1.00 ms。超短回波序列可用于骨關節(jié)系統(tǒng)的研究[6]。Doyle等[7]對UTE序列在3.0T場強下得到的R2*值與常規(guī)TE梯度回波序列(GRE)在1.5T場強下測得的R2*值進行比較，結(jié)果顯示UTE序列定量測量的肝鐵濃度范圍超出了常規(guī)TE梯度回波序列可測范圍，為重度鐵過載肝鐵定量分析開拓了新的視野。

本研究通過建立兔肝臟鐵過載模型，旨在探討UTE序列對肝臟鐵過載定量分析的準確性，尤其是對于重度鐵過載，同時分析了脂肪沉積對肝鐵定量測量的影響。

材料與方法

1.動物模型

本動物實驗經(jīng)本院倫理委員會及實驗動物委員會批準。63只雄性健康新西蘭大白兔，4周齡，平均體重(2.5±0.4) kg，被隨機分為單純鐵過載組(n=30)和鐵過載合并脂肪肝組(n=33)。

單純鐵過載組采用標準飼料喂養(yǎng)，經(jīng)耳緣靜脈注射濃度為100 mgFe/mL的右旋糖酐鐵溶液建立鐵過載動物模型[4]。30只實驗兔均分為6組，其中5組每只實驗兔的鐵注射量分別為0、200、800、1600和2400 mg，剩余的1組共5只兔子備用，以替代建模過程中的死亡動物。若在建模過程中無動物死亡，則對剩余每只兔子的鐵注射量為2400 mg。在注射鐵劑的過程中，為防止因一次性注射鐵劑過多而導致死亡，每只兔子每天最多注射含400 mg鐵的右旋糖酐鐵溶液。

鐵過載合并脂肪肝組采用高脂飼料(標準飼料+2%膽固醇+10%甘油三酯)喂養(yǎng)2～8周，將33只實驗兔均分為3組，分別采用高脂飼料喂養(yǎng)2、4和8周，用于獲得輕度、中度和重度脂肪肝動物模型[8]。在脂肪肝建模過程中，同時通過經(jīng)兔耳緣靜脈注射濃度為100 mgFe/mL的右旋糖酐鐵溶液建立鐵過載動物模型，每組中1只兔備用，其余均分為5個亞組，分別采用0、200、800、1600和2400 mg鐵注射量，每種劑量注射2只實驗兔。

2.MRI檢查方法

使用GE Discovery 750W 3.0T磁共振儀進行掃描和16通道表面柔線圈(GE Flex)。掃描前采用3%戊巴比妥鈉溶液對實驗兔進行麻醉，劑量1.0 mL/kg。采用肝臟脂肪抑制UTE序列，掃描參數(shù)：TR 63.4 ms，8個TE分別為0.03、0.08、0.13、0.23、0.43、0.73、1.03和2.03 ms，回波數(shù)8，矩陣88×88，層數(shù)8，層厚6.0 mm，視野18 cm×18 cm，采集時間18.0 s。

3.圖像分析

由2位醫(yī)師分別在每種TE的UTE序列圖像上選取呼吸偽影較小的3個層面，在每個層面的肝實質(zhì)內(nèi)勾畫一個圓形ROI(面積30～50 mm2)，記錄測得的信號強度(signal intensity，SI)值，并將其導入Matlab軟件，進行R2*值的計算[9]。為保證測量數(shù)據(jù)的準確性，每個ROI盡量避開肝臟大血管、肝內(nèi)膽管及肝臟邊緣。

4.肝鐵化學定量及組織病理學分析

采用電感耦合等離子體光譜儀(inductively-coupled plasma spectrometer，ICP)測量肝實質(zhì)的鐵濃度，具體步驟：取1～2 g的肝臟組織，放入60℃烤箱中烘48h，將水分烘干，用天平秤測量其干重，再放入高溫鍋爐中進行碳化，將碳化好的組織用王水(濃鹽酸和濃硝酸體積比為3:1)進行硝酸化，獲得鐵離子溶液，使用50 mL容量瓶對溶液進行配平后，使用ICP測量50 mL溶液中的鐵離子濃度，經(jīng)過換算，求得每克干重肝臟組織內(nèi)的鐵含量(mgFe/g)。根據(jù)臨床鐵含量分級標準，對每只兔的肝臟鐵濃度進行分級：0級，肝鐵含量正常(LIC<1.8 mgFe/g)；Ⅰ級，輕度鐵過載(LIC為1.8～3.2 mgFe/g)；Ⅱ級，中度鐵過載(LIC>3.2且<7.0 mgFe/g)；Ⅲ級，重度鐵過載(LIC為7.0～15.0 mgFe/g)；Ⅳ級，極重度鐵過載(LIC>15.0 mgFe/g)[4]。

對每只實驗兔的肝臟組織標本進行常規(guī)普魯士藍和HE染色。脂肪含量的評估：每只兔的肝組織病理切片由一位具有十五年肝臟病理檢查工作經(jīng)驗的醫(yī)師使用計算機定量輔助軟件Image J V1.48(National Institutes of Health,USA)對肝組織的脂肪含量(fat fraction，F(xiàn)F)進行評估，F(xiàn)F的計算方法為高倍鏡視野下單位面積內(nèi)脂肪所占百分比，并根據(jù)Brunt肝臟脂肪含量分級標準進行分級(分組)：正常， FF<5%；輕度脂肪肝，F(xiàn)F為5%～33%；中度脂肪肝，F(xiàn)F為34%～66%)；重度脂肪肝，F(xiàn)F>66%[10]。

5.統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0軟件(IBM)和GraphPad Prism 7.04軟件進行統(tǒng)計分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。采用Kolmogorov-Smirnov檢驗判斷計量資料分布的正態(tài)性，滿足者以均數(shù)±標準差來表示。采用組內(nèi)相關系數(shù)(intraclass correlation coefficient，ICC)評估2位醫(yī)師測量結(jié)果的一致性。采用Spearman相關性分析評估UTE-R2*值與ICP-LIC的相關性。為了評估脂肪含量對鐵含量的測量是否有影響，分別建立單純鐵過載組與鐵過載合并脂肪肝組R2*值與LIC的線性回歸方程，采用協(xié)方差分析評估脂肪含量對肝鐵定量測量的影響?；贗CP-LIC確定的肝臟鐵濃度分級，采用受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線分析R2*值對不同鐵濃度分級的診斷效能，根據(jù)約登指數(shù)(Youden index)計算各級的最佳R2*截斷值和曲線下面積(area under the curve，AUC)。

結(jié) 果

1.動物建模結(jié)果

63只新西蘭兔中最終存活49只(77.8%)并進行了MRI掃描，14只兔(22.2%)在建模過程中死亡，未行MRI掃描。單純鐵過載組與鐵過載合并脂肪肝組中分別存活30和19只兔。

病理檢查顯示，隨著注射鐵總量的增加，實驗兔肝組織內(nèi)鐵顆粒的沉積越來越明顯(圖1)。采用ICP測量的49只存活兔的LIC為0.9～27.4 mgFe/g。病理檢查測量的兔肝組織FF值為1.43%～68.46%，鐵過載合并脂肪肝組的實驗兔僅1只為正常組，余均發(fā)展為不同程度脂肪肝，單純鐵過載組脂肪含量均小于5%。根據(jù)肝臟脂肪分級標準，最終肝脂肪含量正常組及輕度脂肪肝、中度脂肪肝及重度脂肪肝組實驗兔數(shù)量分別為30、9、9和1只。根據(jù)臨床肝臟鐵含量分級標準及Brunt脂肪含量分級標準，單純鐵過載模組和鐵過載合并脂肪肝組最終動物模型建模結(jié)果見表1。

圖1 兔肝組織病理標本普魯士藍鐵染色病理圖像，顯示隨著鐵注射量的增加，肝組織內(nèi)鐵顆粒沉積越明顯(×200)。a)未注射右旋糖酐鐵；b)鐵注射量200mg；c)鐵注射量800mg；d)鐵注射量1600mg。

表1 鐵過載和脂肪肝動物模型建模結(jié)果 /只

2.肝臟R2*值及其與肝鐵濃度的相關性

鐵過載模型的MRI表現(xiàn)：隨著鐵注射量的增加，在UTE序列圖像上肝組織信號強度呈現(xiàn)下降趨勢(圖2)。

圖2 不同程度肝臟鐵過載新西蘭大白兔8組回波時間的UTE圖像，顯示隨著肝組織內(nèi)鐵沉積程度的增加，肝臟信號強度逐漸減低。

兩位醫(yī)師分別對49只實驗兔肝組織的UTE-R2*值進行了測量，兩者測量結(jié)果的一致性很高(ICC=0.988)。

不同級別鐵過載組中FF、LIC及UTE-R2*測量值見表2。

表2 不同肝鐵含量分組中肝臟FF、LIC及UTE-R2*測量值

對49只兔模型的UTE-R2*與ICP-LIC進行相關性分析，結(jié)果顯示UTE-R2*值(y)與肝臟鐵含量(x)呈高度線性正相關(r=0.947，P<0.0001)，線性方程為y=123.0x+238.6。

3.脂肪對鐵定量的影響

脂肪分數(shù)、肝鐵濃度和UTE-R2*值在單純鐵過載組中分別為3.61%±1.09%、(10.67±7.12) mgFe/g和(1550.83±951.69) Hz，在鐵過載合并脂肪肝組中分別為27.39%±15.57%、(9.58±8.14) mgFe/g和(1417.63±1019.83) Hz。單純鐵過載組與鐵過載合并脂肪肝組中UTE-R2*(y)與 LIC(x)的線性方程分別為：y=127.3x+192.6(r=0.953，P<0.0001；圖3a)；y=117.8x+289.7(r=0.940，P<0.0001；圖3b)。協(xié)方差分析結(jié)果表明兩組線性方程的斜率無顯著差異(P=0.450>0.05)，提示脂肪肝對UTE序列定量測量肝臟鐵濃度鐵無明顯影響。

圖3 相關性分析點線圖。a)單純鐵過載組R2*值與LIC呈顯著線性正相關；b)鐵過載合并脂肪肝組R2*值呈顯著線性正相關。

4.UTE- R2*對肝鐵過載分級的診斷效能

分別以臨床肝鐵濃度分級閾值1.8、3.2、7.0和15.0 mg/g為參考標準，UTE- R2*對不同肝鐵過載分級的診斷效能指標值見表3。預測不同肝鐵含量分級的UTE-R2*值的最佳截斷值分別為623、678、1400和2050 Hz，AUC分別為0.919、0.968、0.992和0.998。

表3 UTE-R2*值預測鐵過載分級的診斷效能指標值

討 論

非對稱回波最小二乘估算法迭代水脂分離序列(iterative decomposition of water fat with echo asymmetry and least-squares estimation quantitation sequence,IDEAL-IQ)和mDixon序列雖然能對輕、中度鐵過載患者的肝鐵濃度及脂肪分數(shù)進行精確定量[11-12]，但對于重度及極重度鐵過載患者，由于采集過程中第一個回波時間超過1.0 ms，難以采集到相應的信號衰減過程，導致了這2個序列評估重度鐵過載的精確性下降[13]。Sharma等[14]對在3.0T場強下采用梯度回波序列測得的R2*值與使用超導量子干涉儀測得的磁化率值進行比較，結(jié)果顯示R2*與磁化率具有高度相關性(r=0.94)，但當R2*值大于800 Hz時，對鐵濃度值的測量精確性降低。Doyle等[7]采用體外模型的實驗研究結(jié)果顯示，R2*值大于1910 Hz時，常規(guī)序列對鐵濃度定量分析的精確性下降。

本實驗通過在脂肪肝背景下建立鐵過載動物模型，在3.0T場強下采用脂肪抑制技術(shù)UTE序列進行掃描，所用的最短回波時間僅為0.03 ms，得到的R2*值與LIC具有極高的相關性(相關系數(shù)為0.947)，驗證了UTE 序列在定量分析肝臟鐵過載方面的可行性，尤其是對重度及極重度鐵過載。Wu等[15]的研究亦驗證了UTE序列在3.0T場強下定量測量不同程度肝鐵過載大鼠模型的可行性，他們的研究結(jié)果顯示R2*值與LIC具有很好的相關性，相關系數(shù)為0.897，并獲得了R2*與LIC的回歸方程，通過回歸方程預測的肝鐵濃度與真實的肝鐵濃度具有高度一致性。本研究中還采用ROC曲線分析結(jié)合約登指數(shù)來分析R2*值對鐵含量分級的預測效能，結(jié)果顯示R2*值對各組(不同鐵含量分級)均具有有好的診斷效能，能夠區(qū)分不同程度的鐵過載，尤其是對極重度鐵過載的診斷效能，敏感度為1.000，特異度為0.944，曲線下面積為0.998。

為了評估脂肪對鐵定量測量的影響，我們構(gòu)建了鐵過載合并脂肪肝模型，本研究中采用脂肪抑制技術(shù)，在3.0T場強下采用UTE序列對鐵過載動物模型進行圖像采集，并將測量結(jié)果應用協(xié)方差分析聯(lián)合線性回歸分析來評估脂肪對鐵定量測量的影響，結(jié)果顯示單純鐵過載組和鐵過載脂肪組組線性回歸方程的斜率無顯著差異(P=0.450)，說明脂肪的存在對肝鐵濃度的定量測量無明顯影響。Karlsson等[16]研究發(fā)現(xiàn)脂肪對R2*值測量的影響是內(nèi)在的，肝細胞內(nèi)的一些分子會以不同形式影響水的馳豫，其中肝細胞內(nèi)的脂肪滴可導致水的馳豫不均勻增寬，進而對R2*值的測量產(chǎn)生影響；在1.5T場強下，MRI圖像上質(zhì)子密度脂肪分數(shù)每增加一個百分點，R2*值就會增加約1 Hz。然而對于嚴重鐵過載患者R2*值可達到2000 Hz以上，由脂肪分數(shù)引起的R2*值升高可以忽略不計。而且，在合并脂肪沉積的情況下，可以通過脂肪抑制技術(shù)來剔除脂肪的干擾，精確計算出肝臟的R2*值[17]。筆者認為，在本研究中之所以脂肪對肝鐵含量的測量無顯著影響，可能原因為：①我們使用了脂肪抑制技術(shù)，剔除了脂肪對肝鐵定量的影響；②在本研究中，重度和極重度鐵過載的實驗兔有28只，而僅有1只兔子為重度脂肪肝，由脂肪分數(shù)引起的R2*值的升高可以忽略。

本研究的局限性：①本研究為動物實驗，脂肪肝及鐵過載模型在病理學改變上與人體疾病進展過程可能存在差異；②本研究樣本量較小，尤其重度脂肪肝合并鐵過載的實驗兔僅只有1只，故尚需在后續(xù)的研究中增加重度脂肪肝合并鐵過載組的樣本量，進行進一步的探究；③本研究中UTE序列采用多個單獨的回波時間進行掃描，需要單獨的后處理軟件；④本研究值未考慮肝鐵過載會造成不同程度的肝炎和肝纖維化，隨著肝纖維化程度的加重，肝動脈的緩沖不足以調(diào)節(jié)代償門靜脈灌注量的降低，導致肝實質(zhì)內(nèi)血氧分壓降低，進而使得R2*值逐漸增加[18]，仍需進一步研究來評估肝纖維化對R2*值的影響。

綜上所述，通過注射不同量的右旋糖酐鐵聯(lián)合高脂喂養(yǎng)方式，可以構(gòu)建肝鐵過載合并脂肪肝模型。由于UTE序列采集過程中TE非常短(<1 ms)，能夠?qū)Ω舞F含量進行精確定量，尤其是對重度鐵過載顯示出明顯優(yōu)勢。同時脂肪抑制UTE序列能夠消除脂肪對肝鐵含量定量測量的影響，對不同等級鐵過載具有很好的診斷效能。