郭 凱，賴(lài) 俊，冷梅芳，葉澤兵

廣東省第二人民醫(yī)院 心血管內(nèi)二科(廣州 510317)

目前心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)是人類(lèi)死亡的主要原因之一，通過(guò)生活方式干預(yù)及藥物治療，CVD患者的殘留風(fēng)險(xiǎn)仍較高[1]，因此尋找能夠防治冠心病(coronary artery disease,CAD)的藥物對(duì)于進(jìn)一步降低CAD患者主要不良心血管事件(major adverse cardiovascular events,MACE)的發(fā)生率具有重要意義。中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)為CAD的治療開(kāi)辟了新途徑，其中蒙醫(yī)作為蒙古族優(yōu)秀文化遺產(chǎn)之一，是通過(guò)吸收中醫(yī)藥和藏醫(yī)的經(jīng)驗(yàn)逐步形成的；且療效明顯，越來(lái)越被人們接受[2-4]。廣棗五味散(guangzao wuwei san,GWS)是臨床常用的蒙藥之一，臨床療效確切，可改善CAD患者的癥狀[5-6]。GWS由5種草藥組成，包含成分多，其藥理機(jī)制探索困難，因此找尋GWS的活性成分并確定其靶基因，對(duì)開(kāi)發(fā)新藥具有重要的臨床意義。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接方法分析GWS治療CAD的關(guān)鍵靶點(diǎn)和信號(hào)通路，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 GWS活性成分的收集與篩選

GWS包含廣棗、丹參、紅花、肉豆蔻、檀香5種藥材。GWS中的有效成分通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)進(jìn)行分析，關(guān)鍵詞分別為Guangzao、Danshen、Honghua、Roudoukou和Tanxiang。TCMSP包含449種草藥，可獲取疾病、靶點(diǎn)和藥物之間的關(guān)系。口服生物利用度(oral bioavailability,OB)是藥代動(dòng)力學(xué)中的一個(gè)重要參數(shù)，與生物利用度直接相關(guān)。類(lèi)藥性(drug-likeness,DL)表示活性成分與現(xiàn)有藥物的相似性。在TCMSP中，選擇OB>30%和DL>0.18的活性成分用于網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、分子對(duì)接等后續(xù)研究(圖1)。

圖1 GWS對(duì)CAD作用的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析流程圖

1.2 獲取GWS中活性成分與CAD相關(guān)的潛在靶點(diǎn)

從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取GWS中活性成分的潛在靶點(diǎn)。從Genecards(https://www.genecards.org)、Online Mendelian Inheritance in Man(OMIM，https://www.omim.org)、PharmGKB(http://www.pharmgkb.org)、Therapeutic Target Database(TTD，http://db.idrblab.net/ttd/)和 DrugBank(https://go.drugbank.com/)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取與CAD治療相關(guān)的基因靶點(diǎn),并從Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選相關(guān)性得分≥30分的基因靶點(diǎn)。使用UniProt(https://www.uniprot.org)獲取靶基因的全名、ID和簡(jiǎn)稱(chēng)。

1.3 成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

為進(jìn)一步探索潛在靶點(diǎn)和活性成分之間的關(guān)系，使用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)。

1.4 蛋白質(zhì)之間相互作用的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

STRING(http://string-db.org)為在線數(shù)據(jù)庫(kù)，可用于構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protwin interaction network,PPI)的網(wǎng)絡(luò)。目標(biāo)蛋白之間的每一次相互作用都會(huì)被評(píng)分,然后將執(zhí)行以下步驟：選擇“multiple proteins”，輸入GWS與CAD同時(shí)相關(guān)的靶基因，在“Homo sapiens”中搜索，將所需的最低相互作用分?jǐn)?shù)設(shè)置為高置信度(0.9)和隱藏網(wǎng)絡(luò)中斷開(kāi)連接的節(jié)點(diǎn),最后將目標(biāo)蛋白導(dǎo)入Cytoscape軟件中構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.5 GO分析和KEGG分析

將GWS與CAD同時(shí)相關(guān)的靶基因放入R語(yǔ)言程序進(jìn)行GO和KEGG分析，以探索所選靶基因在信號(hào)通路中的作用。

1.6 分子對(duì)接

1.6.1 受體結(jié)構(gòu)的構(gòu)建 PPI 網(wǎng)絡(luò)核心靶蛋白的ID來(lái)自Uniprot。根據(jù)ID，受體結(jié)構(gòu)以pdb格式文件從RCSB PDB(http://www1.rcsb.org/)下載,將受體結(jié)構(gòu)文件導(dǎo)入pyMOL軟件，去除分子和小分子配體后，以pdb格式保存。

1.6.2 配體結(jié)構(gòu)的構(gòu)建 配體的二維結(jié)構(gòu)以sdf格式從PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載并導(dǎo)入Chem3D軟件中，利用MM2位置優(yōu)化所有小分子的能量后，將其轉(zhuǎn)換成3D結(jié)構(gòu)保存為mol2格式文件。

1.6.3 分子對(duì)接 使用ADT 1.5.6軟件轉(zhuǎn)換受體和配體結(jié)構(gòu)文件格式：將受體結(jié)構(gòu)pdb格式文件導(dǎo)入ADT 1.5.6軟件，添加氫后保存為pdbqt格式;將配體結(jié)構(gòu)pdb格式文件轉(zhuǎn)為pdbqt格式。受體結(jié)構(gòu)通過(guò)ADT 1.5.6軟件轉(zhuǎn)換為2D結(jié)構(gòu)。X、Y、Z維度的點(diǎn)數(shù)均設(shè)置為40，間距設(shè)置為 1?；顒?dòng)口袋參數(shù)導(dǎo)出為gpf格式文件，根據(jù)活動(dòng)口袋參數(shù)修改輸入文件，最大能量差為5，模型數(shù)為20，輸出的pdbqt文件與受體文件一起導(dǎo)入pyMOL軟件，保存最優(yōu)模型。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

在GO分析和KEGG分析進(jìn)行數(shù)據(jù)篩選時(shí)，設(shè)置P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 GWS中的活性成分

從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出GWS有568種生物活性成分(其中廣棗43種，丹參202種，紅花189種，肉豆蔻64種，檀香70種),根據(jù)OB和DL標(biāo)準(zhǔn)選取108種有效成分(其中廣棗9種，丹參65種，紅花22種，肉豆蔻9種，檀香3種)進(jìn)行進(jìn)一步研究。

2.2 GWS中活性成分的潛在靶基因

去除重復(fù)的基因后，從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取GWS中的活性成分有246個(gè)潛在靶基因。

2.3 GWS中活性成分與CAD相關(guān)的基因

從Genecard、OMIM、PharmGKB、TTD和DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得618個(gè)CAD相關(guān)靶基因,GWS與CAD相關(guān)的靶基因共有77個(gè)(圖2～3)。

圖2 5個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中與CAD相關(guān)基因

圖3 GWS與CAD的“藥物-疾病”交集靶基因圖

2.4 成分-靶點(diǎn)-疾病交互網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建結(jié)果

應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理分析對(duì)每個(gè)靶點(diǎn)的相關(guān)參數(shù)進(jìn)行可視化分析，結(jié)果顯示162個(gè)節(jié)點(diǎn)和438個(gè)邊，包含85個(gè)成分和77個(gè)靶點(diǎn)。使用Cytoscape軟件中的Network Analyzer插件進(jìn)行分析顯示，GWS治療CAD有7種必需的活性成分(表1)。

表1 GWS治療CAD的活性成分

2.5 GWS治療CAD靶基因的PPI網(wǎng)絡(luò)

使用STRING在線數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),該網(wǎng)絡(luò)中有201條邊和54個(gè)節(jié)點(diǎn)(圖4)，并使用Cytoscape軟件獲取核心靶蛋白。如果該蛋白質(zhì)的介數(shù)(betweenness centrality,BC)、接近度(closeness centrality,CC)、度數(shù)(degree centrality,DC)、特征向量(eigenvector centrality,EC)、LAC和網(wǎng)絡(luò)中心度(network centrality,NC)>中位數(shù)，則保留該蛋白。3次過(guò)濾后(過(guò)濾條件1：BC=21.19，CC=0.15，DC=4.00，EC=0.06，LAC=1.60，NC=2.25;過(guò)濾條件2：BC=7.26，CC=0.37，DC=0.37，LAC=3.34,NC=4.39;過(guò)濾條件3:BC=1.40,CC=0.80,DC=6.00,EC=0.33,LAC=4.00,NC=4.95)，共保留基因信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)、細(xì)胞腫瘤抗原p53(tumor protein P53,TP53)2個(gè)核心目標(biāo)蛋白。

圖4 GWS治療CAD靶基因的PPI網(wǎng)絡(luò)

2.6 GO和KEGG富集分析結(jié)果

使用R語(yǔ)言程序?qū)WS與CAD同時(shí)相關(guān)的靶基因進(jìn)行GO分析。根據(jù)P<0.05獲得2 220個(gè)GO條目，包括69個(gè)細(xì)胞成分、128個(gè)分子功能和2 023個(gè)生物過(guò)程；在細(xì)胞成分方面，潛在靶點(diǎn)主要涉及膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)等；在分子功能方面，潛在靶點(diǎn)主要涉及磷酸酶結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合和細(xì)胞因子受體結(jié)合等；在生物過(guò)程中，潛在靶點(diǎn)主要涉及對(duì)營(yíng)養(yǎng)水平、氧化應(yīng)激及藥物的反應(yīng)等(圖5)。

圖5 GO分析結(jié)果(前10)

使用R語(yǔ)言程序?qū)WS與CAD同時(shí)相關(guān)的靶基因進(jìn)行KEGG富集分析,根據(jù)P<0.05獲得137條信號(hào)通路,選擇前20條信號(hào)通路(圖6),其中具有代表性的為：AGE-RAGE糖尿病并發(fā)癥信號(hào)通路和流體剪切力與動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路。

圖6 靶基因的KEGG富集分析(前20)

2.7 活性成分與核心靶蛋白的分子對(duì)接

將2個(gè)核心靶蛋白(STAT3、TP53)進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果顯示，所有活性成分均可進(jìn)入并結(jié)合蛋白質(zhì)的活性口袋(圖 7、表2)。

圖7 關(guān)鍵基因的分子對(duì)接

表2 分子對(duì)接得分(kcal/mol)

3 討論

CAD在蒙醫(yī)中稱(chēng)為“心刺痛”，是由于“三根”“七素”功能失調(diào)，阻礙赫依和氣血運(yùn)行。蒙藥主要通過(guò)辨證濁化、活血化瘀來(lái)治療CAD[7]。GWS是結(jié)合蒙醫(yī)理論和臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，經(jīng)著名蒙醫(yī)專(zhuān)家反復(fù)確認(rèn)的方劑，通過(guò)調(diào)整人體“三根”“七素”的功能來(lái)治療CAD[7]。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接方法分析了GWS治療CAD的藥理機(jī)制。在GWS中共篩選出108種活性成分，在GWS活性成分的靶基因中，篩選出與CAD相關(guān)的基因共77個(gè)；PPI核心蛋白分析顯示，STAT3和TP53可能是GWS治療CAD的關(guān)鍵靶點(diǎn);GO分析和KEGG通路富集分析顯示，GWS治療CAD的信號(hào)通路有137條；分子對(duì)接分析顯示，代表性活性成分與目標(biāo)蛋白結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合力較高。

本研究結(jié)果顯示，GWS治療CAD必需的活性成分包括槲皮素、山奈酚、木犀草素、柚皮素、β-胡蘿卜素、丹參酮ⅡA、異鼠李素7種。槲皮素是一種天然生物類(lèi)黃酮，可改善內(nèi)皮細(xì)胞功能[8]，抑制樹(shù)突細(xì)胞活化[9]，通過(guò)影響膽固醇代謝相關(guān)基因表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)膽固醇代謝[10-11]。山奈酚是一種常見(jiàn)的低分子量天然黃酮，具有多種藥理作用，如抗炎、抗氧化、抗癌等。研究[12]表明，山奈酚通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥分子中基因和蛋白的表達(dá)來(lái)發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)作用。木犀草素是一種天然黃酮，可抑制巨噬細(xì)胞炎癥，從而抑制AS的發(fā)生[13]。柚皮素是一種柚子中的苦味成分，能改善血脂水平、抑制炎癥反應(yīng)[14]和AS的發(fā)生[15]。流行病學(xué)證據(jù)[16]表明，β-胡蘿卜素可使低密度脂蛋白抗氧化能力增強(qiáng)，有助于改善AS。丹參酮ⅡA是從中草藥丹參根中分離出的一種生物活性成分，可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的自噬及與AS相關(guān)的非編碼RNA的表達(dá)[17-18]，改善內(nèi)皮細(xì)胞功能，調(diào)節(jié)膽固醇代謝[19]。異鼠李素是一種生物活性化合物，具有抑制巨噬細(xì)胞凋亡、抗AS的作用。

PPI核心網(wǎng)絡(luò)和分子對(duì)接分析顯示，GWS的主要成分可通過(guò)影響CAD相關(guān)的基因stat3、tp53來(lái)防治CAD。CAD是冠狀A(yù)S，是一種慢性、進(jìn)行性、炎癥性動(dòng)脈壁疾病，因此stat3、tp53作為經(jīng)典細(xì)胞通路的轉(zhuǎn)錄因子可能在AS的病理機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用，尤其是炎癥和免疫反應(yīng)[20]。STAT3是STAT家族的一員，可能是治療CAD的有效靶點(diǎn)。研究[21]表明，白細(xì)胞介素6細(xì)胞因子家族/Janus激活激酶2/STAT3信號(hào)通路在AS的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和免疫細(xì)胞分化中起著重要作用。此外，還有一些刺激因子可通過(guò)激活STAT3來(lái)影響AS，包括蛋白酪氨酸磷酸酶、激活STAT蛋白抑制劑和細(xì)胞因子信號(hào)3抑制因子[22]。研究[23]表明，tp53是一種轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、代謝和自噬等與AS病理過(guò)程有關(guān)的生物學(xué)功能。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接方法系統(tǒng)研究了GWS治療CAD的活性成分、核心靶點(diǎn)和關(guān)鍵信號(hào)通路。本研究不足之處為，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于現(xiàn)有文獻(xiàn)中的數(shù)據(jù)，預(yù)測(cè)局限，在未來(lái)研究中需深入探索活性成分的詳細(xì)機(jī)制，以期為開(kāi)發(fā)治療CAD的新型藥物提供指導(dǎo)。