何曉文，孟 慧，張家虎，范 昆，李林光*

(1 山東省果樹研究所，山東省蘋果遺傳育種和栽培工程實驗室，山東泰安 271000；2 山東農業(yè)大學 生命科學學院，作物生物學國家重點實驗室，山東泰安 271000)

蘋果炭疽葉枯病(Glomerella leaf spot，GLS)是中國蘋果產區(qū)新出現的流行性病害，病原菌為盤長孢狀刺盤孢(Colletotrichumgloeosporioides)的有性態(tài)圍小叢殼(Glomerellacingulata)[1-2]，因此該病害又被稱為圍小叢殼葉斑病，主要危害‘金冠’、‘嘎拉’和‘喬納金’等蘋果品種，造成早期葉片干枯、脫落，侵染果實引起壞死性斑點，嚴重影響樹體的生長發(fā)育及果實的產量和品質[3-4]。目前，該病害在中國環(huán)渤海灣(山東、河北、遼寧省)、黃土高原(山西、陜西省)等蘋果主產區(qū)均有發(fā)生，并有逐年加重的趨勢[5]。傳統(tǒng)防治炭疽葉枯病多依賴藥劑防治，但效果不顯著，而且容易造成果品質量下降、污染環(huán)境等問題[6]。

目前，選育抗病品種是解決蘋果炭疽葉枯病的有效途徑。吳建圓等[7]對327份蘋果種質資源進行了抗病性鑒定，其中高抗資源160份，高感資源139份，中間抗感類型較少。通過在山東萊陽、江蘇豐縣、安徽碭山等地調查及室內接種鑒定發(fā)現，不同蘋果品種對炭疽葉枯病的抗性存在顯著差異。‘金冠’、‘嘎拉’、‘秦冠’和‘喬納金’等為高感品種，‘富士’和‘紅星’等為高抗品種[8-10]。目前有關蘋果雜交后代炭疽葉枯病抗病遺傳規(guī)律的報道較少，劉源霞等[10]綜合分析了‘金冠’ב富士’，‘富士’ב金冠’，‘嘎拉’ב富士’，‘富士’בQF-2’4個雜交群體F1代個體對GLS的抗性表現，4個群體中抗感植株的分離比分別符合1∶1、1∶1、0∶1和1∶0的理論比值；張朝紅等[11]通過對40份蘋果品種(系)以及‘宮崎短枝富士’ב坂田津輕’、‘坂田津輕’ב巖富10’、‘嘎拉’ב昌紅’、‘新紅星’ב宮崎短枝富士’、‘宮崎短枝富士’ב新紅星’5個組合的8 000余株雜種分離群體的GLS田間抗性進行調查與分析發(fā)現，雜種分離群體中抗感比也符合1∶1或1∶0的理論比值。根據以上研究結果，研究者初步推測蘋果抗炭疽葉枯病性狀受隱性單基因控制，抗病基因型為rr，感病基因型為RR和Rr[10-11]。不同品種(系)對蘋果GLS的抗性差異顯著，培育和種植抗病品種是防控植物病害的重要途徑之一。盡管在雜交親本的選配時，通過抗感品種的互補篩選出抗炭疽葉枯病的蘋果雜種后代，但關于調控蘋果對炭疽葉枯病的抗性機制研究較少，阻礙了分子育種工作的開展。

當受到病原菌侵染時，水楊酸(salicylic acid，SA)激發(fā)植物的多種防衛(wèi)反應，有效增強植物的抗病性[12-15]。研究表明，100 μg/mL SA處理蘋果葉片后對蘋果斑點落葉病菌(AlternariamaliRoberts)有明顯的誘抗效果，葉片中抗性相關酶活性明顯升高，葉片木質素等抗病性物質含量增加，木質化程度增強，使葉片的抗病性提高，病情指數明顯降低，誘抗效果為70.90%[12]。SA通常作為內源信號分子在植物受到生物脅迫時激活植物的系統(tǒng)獲得性抗性，以抵御病原菌侵染[16]。病程相關蛋白(pathogenesis-related protein，PR)與內源SA積累密切相關，是SA信號轉導途徑的標志基因[16-17]。PR基因的表達水平代表SA信號的活性，SA可以通過促進PR基因的表達以響應植物受到的病原菌的侵染[17-18]。張計育等[19]研究表明，SA處理可顯著誘導平邑甜茶葉片中PR8的表達水平。另外，SA介導的信號通路還可以迅速提高組織中多種抗性相關酶(如超氧化物歧化酶、過氧化物酶等)的活性，提高植物的抗病性。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和過氧化物酶(peroxisome，POD)是植物抵御活性氧脅迫的2種重要抗性相關酶，對維持抗氧化系統(tǒng)平衡，阻止活性氧的形成和清除活性氧具有重要作用[20-21]。POD等多種抗氧化酶是馬鈴薯抵御鏈格孢菌(Alternariatenuissima)侵染的關鍵調節(jié)因子，在基礎抗性和木質化方面發(fā)揮著重要作用[22]。目前關于SA在蘋果抵御炭疽葉枯病過程中的作用仍不清楚。

山東省果樹研究所以‘嘎拉’和‘藤牧1號’為親本培育而成多個新品種(系)，這些新品種(系)多具有早果性、豐產性、適應性等優(yōu)良特性。目前，不同蘋果品種(系)對GLS的抗性研究尚不深入，本研究通過田間調查、室內人工接種等方法對‘嘎拉’和‘藤牧1號’及其F1代進行了蘋果炭疽葉枯病的發(fā)病情況統(tǒng)計、分子生物學分析等，鑒定和評價不同品種(系)對炭疽葉枯病的抗性，并初步探究了抗性品種(系)的抗病機制，為栽培和培育抗病品種來防治炭疽葉枯病奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

2003年以‘嘎拉’和‘藤牧1號’為親本進行正反雜交，2005年將‘嘎拉’ב藤牧1號’雜種實生苗1 963株，‘藤牧1號’ב嘎拉’雜種實生苗1 575株定植于雜交試驗園。2011年自以上雜交群體隨機選擇100個株系，及‘嘎拉’、‘藤牧1號、‘煙富3’、‘金冠’等品種，所有試材定植于山東省泰安市岱岳區(qū)山東省果樹研究所天平湖基地(117°032′E，36°225′N)，以八棱海棠為基砧，M26為中間砧，每個品種(系)定植10棵，株行距0.5 m×2 m。2021年上述定植試材中隨機選取83個品種(系)，以及親本‘嘎拉’、‘藤牧1號’和抗病品種‘煙富3’、感病品種‘金冠’進行抗病性調查及鑒定，取樣前15 d不噴施農藥，其他按常規(guī)管理進行。

室內人工接種采用的病菌為山東省果樹研究所植物保護研究室自‘嘎拉’蘋果炭疽葉枯病病葉上分離出來的圍小叢殼(G.cingulata)。

1.2 方 法

1.2.1 樣品采集及室內抗病性鑒定從供試植株上選取未發(fā)病、成熟度一致的當年生健壯新梢，3～5節(jié)展開葉(20 d葉齡左右)進行抗病性接種鑒定，每個品種(系)取4個枝條(2個用于接種病菌，2個為對照)。剪除枝條兩端葉片，保留中部4個完全展開的葉片，用0.6%的次氯酸鈉對葉片表面消毒，然后用無菌水沖洗，瀝干。將炭疽葉枯病菌分生孢子懸浮液(孢子濃度為104個/mL)均勻噴灑到葉片正反兩面，接種4 d后進行抗病性鑒定和數據記錄[10]。

不同抗性品種(系)中炭疽葉枯病菌的生物量檢測。采用植物基因組DNA提取試劑盒(Tiangen，Beijing)提取植物基因組DNA，具體步驟按照實驗說明書進行。通過實時熒光定量PCR檢測葉片中DNA的含量。疾病指數[log2(ITS/MdSK11)]值由MdSK11的Ct值減去ITS的Ct值。3次重復。

1.2.2 分子標記鑒定每個品種(系)取嫩葉0.5 g，液氮速凍，-70 ℃保存。采用植物基因組DNA提取試劑盒(Tiangen，Beijing)提取植物基因組DNA，具體步驟按照實驗說明書進行。利用NanoDrop 2000分光光度計(Thermo Scientific，South Logan，UT，USA)測定DNA的純度和濃度。

利用前人研究中所獲得的與炭疽葉枯病抗性基因Rgls位點緊密連鎖的2個分子標記(SSR標記S0405127和S0304673)對田間87個品種(系)進行基因型鑒定。其中SSR標記S0405127與基因Rgls位點的遺傳距離為0.5 cM，S0304673與基因Rgls的遺傳距離為0.9 cM[23-24]。引物序列及變異位點信息列于表1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 分子標記信息Table 1 The information of molecular markers

SSR反應體系：總量為25 μL，其中DNA模板1 μL，easyTaq 0.25 μL，引物各1 μL，easyTaq 緩沖液2.5 μL，ddH2O 19.25 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預變性10 min；94 ℃變性40 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產物使用3.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗[24]。

1.2.3 抗性相關酶活性檢測分別使用POD Assay Kit A084和SOD Assay Kit A001檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，南京)測定主要抗氧化酶POD和SOD活性，具體步驟按試劑盒說明書進行操作。

1.2.4 抗性相關酶基因表達水平檢測提取接種炭疽葉枯病菌4 d的蘋果葉片總RNA，具體方法參考RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(TIANGEN，北京)說明書，利用NanoDrop 2000分光光度計(Thermo Scientific，South Logan，UT，USA)測定RNA的純度和濃度，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

第一鏈cDNA合成按照FastQuant RT Kit(with gDNase)(TIANGEN，北京)進行。反轉錄完成后檢測cDNA質量及濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆?。以蘋果actin(Mdactin)為內參基因，通過實時熒光定量PCR分析水楊酸相關基因及抗病防御酶基因表達量。所用基因引物序列均由生工生物工程(上海)合成，引物序列見表2。

表2 熒光定量PCR引物序列Table 2 The sequences of qRT-PCR primers

熒光定量PCR反應體系(20 μL)：2×Green qPCR Mix 10.4 μL，cDNA模板2 μL，正向和反向引物各0.4 μL，ddH2O 6.8 μL。反應程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 10 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)；3次重復。運用2-ΔΔCt法進行數據統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 不同蘋果品種(系)對炭疽葉枯病的抗性鑒定

2021年對田間種植的83個雜交后代和親本‘嘎拉’、‘藤牧1號’，抗病品種‘煙富3’和感病品種‘金冠’，進行田間自然發(fā)病調查，不同品種(系)的田間抗性差異明顯?！吕?、‘2-5’、‘19-19’等品種(系)植株發(fā)病嚴重，樹冠的中下層甚至整棵植株葉片落光；‘藤牧1號’、‘煙富3’、‘40-9’及‘50-48’等品種(系)植株未見受害癥狀。

此外，本研究對83個雜交后代，‘嘎拉’、‘藤牧1號’、‘煙富3’和‘金冠’進行了人工接種實驗。將炭疽葉枯病菌的孢子懸浮液接種于不同蘋果品種(系)的葉片上，接種2 d后部分蘋果品種(系)的葉片出現病斑；接種4 d后部分蘋果品種(系)葉片上壞死病變明顯并迅速擴大，部分品種(系)葉片無明顯變化(圖1，Ⅰ)。在87個蘋果品種(系)中，‘藤牧1號’、‘煙富3’、‘40-9’及‘16-16’等品種(系)葉片無病斑或病斑極少，抗性顯著；‘嘎拉’、‘2-5’、‘19-19’及‘26-27’等品種(系)葉片均有病斑且面積較大，表現出對炭疽葉枯病的高感性。結果顯示，高感品種‘嘎拉’和抗性品種‘藤牧1號’雜交后代對蘋果炭疽葉枯病的抗性差異明顯，‘40-9’表現出對炭疽葉枯病的高抗性，這說明遺傳性在蘋果對炭疽葉枯病的抗性中起著重要作用(圖1，Ⅰ)。除此之外，本研究對部分品種(系)中炭疽葉枯病菌的生物量進行了檢測。如圖1，Ⅱ所示，抗性品種(系)中的病菌含量顯著低于感性品種(系)，‘40-9’葉片中病菌含量最低。

2.2 SSR分子標記對抗感品種(系)的鑒定

本研究利用SSR標記進一步在不同品種(系)中進行基因型鑒定。如圖2所示，SSR標記S0405127在‘嘎拉’、‘2-5’、‘19-19’等感病品種(系)中擴增出330 bp的片段，而在‘煙富3’、‘藤牧1號’、‘40-9’等抗病品種(系)中無此片段，與田間表型調查和人工接種結果相比，準確率分別為93.10%和91.95%；S0304673在抗病和感病植株中能擴增出兩條差異明顯的擴增條帶，在抗病品種(系)中擴增出305 bp大小的片段，在感病品種(系)中擴增出333 bp的片段，與田間表型調查和人工接種結果相比，準確率為91.95%和95.40%(圖2，表3)。

表3 不同蘋果品種(系)對蘋果炭疽葉枯病的抗性評價Table 3 Evaluation of different apple varieties for resistance to glomerella leaf spot

續(xù)表3 Continued Table 3

2.3 水楊酸信號轉導途徑相關基因表達變化

NPR1、PR1、PR5為SA信號轉導途徑和植物免疫反應被激活的標志基因；EDS1、PAD4和PAL為SA重要的合成基因。為了研究不同蘋果品種(系)受到蘋果炭疽葉枯病菌侵染后的抗性與SA的相關性，在接種病菌4 d后，我們進行了SA相關基因的表達模式分析。結果如圖3所示，接種炭疽葉枯病菌后，‘煙富3’、‘藤牧1號’、‘40-9’、‘50-48’、‘10-37’、‘16-16’等抗性品種(系)中SA合成相關基因被強烈誘導表達。同時，SA信號轉導相關基因MdNPR1、MdPR1、MdPR5的表達也顯著高于‘嘎拉’等感病品種(系)。由此推測，水楊酸信號轉導途徑參與‘40-9’等蘋果品種(系)對炭疽葉枯病的抗性。

2.4 抗性相關酶活性及基因表達變化

SOD和POD與植物抵抗病原菌的侵染有密切關系。接種炭疽葉枯病菌4 d后，‘煙富3’、‘藤牧1號’、‘40-9’、‘50-48’、‘10-37’、‘16-16’等抗性品種(系)的MdSOD、MdPOD酶基因表達水平顯著高于‘嘎拉’、‘2-5’、‘19-19’等感病品種(系)(圖4，Ⅰ)。分析各品種(系)SOD和POD活性，結果(圖4，Ⅱ)顯示，在接種炭疽葉枯病菌后，這2個氧化還原酶在‘煙富3’、‘藤牧1號’、‘40-9’等抗病品種(系)中的活性均比‘嘎拉’等感病品種(系)要高。

3 討 論

炭疽葉枯病是為害蘋果生產的嚴重病害之一，栽培和培育抗病新品種是防控病害的重要途徑。通過田間自然環(huán)境調查發(fā)現，‘金冠’、‘嘎拉’等為高感品種，‘富士’、‘藤牧1號’等為高抗品種[9-10]。本研究對‘嘎拉’和‘藤牧1號’的F1代等87個品種(系)進行炭疽葉枯病病菌接種，隨后利用表型調查、病菌生物量檢測、SSR分子標記檢測、抗性基因表達水平檢測等進行抗病性分析，進一步明確了‘40-9’、‘50-48’、‘16-16’等系的抗性水平，其中‘40-9’接種炭疽病菌后表現出高抗表型且病菌生物量顯著低于其他品種(系)，已通過品種審定，命名為‘魯麗’。

培育抗病品種是防控植物病害的重要途徑之一。為了獲得抗GLS的蘋果品種及研究其抗性遺傳規(guī)律，研究人員構建了多個雜種分離群體，發(fā)現不同蘋果種質及雜種對GLS的田間抗性差異明顯，如‘蘋光’、‘蘋錦’等品種表現為感病，‘蘋艷’、‘昌蘋8號’、‘華紅’等品種則表現為抗病[11]。通過對不同雜交群體后代GLS抗性進行表型鑒定及與抗病基因連鎖的SSR標記鑒定，認為蘋果雜交后代中抗GLS受隱性單基因控制，抗病基因型為rr，感病基因型為RR或Rr[10-11]，但目前關于蘋果對GLS的抗性機制研究尚不清楚。通過配置不同雜交組合，我們篩選出‘40-9’(‘魯麗’)等多個抗炭疽葉枯病品種(系)，并且通過對‘嘎拉’和‘藤牧1號’雜交后代的抗病性分析，初步明確了植物激素SA在調控蘋果對GLS抗性方面的重要功能。

SA是植物防衛(wèi)反應的信號傳遞過程中的重要信號分子和組成成分。當植物受到病原菌侵染時，SA信號轉導通路被激活，觸發(fā)植物防御反應，保護未侵染部位免受病原菌的再次感染[25]。EDS1(Enhanceddiseasesusceptibility1)、PAD4(Phytoalexindeficient4)和PAL(Phenylalanineammonia-lyase)是SA合成的關鍵基因[26-27]。EDS1可通過誘導PR蛋白的合成來提高植物的抗病性。EDS1的失活會抑制SA的積累并且降低R(resistance)基因介導的植物對病原菌的抗性[28]。PAL參與酚類物質的合成，影響苯丙烷類代謝，通過苯丙烷類代謝途徑可逐步產生黃酮、生物堿、綠原酸等代謝物，合成木質素和植保素等，從而提高植物的抗病性[29-30]。Falcioni等[31]研究表明，外施SA可激活番茄葉片PAL活性，增強寄主對馬鈴薯X病毒侵染的耐受性。Tian等[29]報道SA處理顯著提高梨果實PAL活性，減輕了由Alternariaalternata引起的腐爛癥狀。PAD4與EDS1密切相關，促進SA合成關鍵基因ICS1(Isochorismatesynthase1)的表達，從而提高植物中SA含量以抑制病原菌的生長[26,32]。PR和NPR1是SA信號轉導途徑的標志基因[33]。PR基因的表達水平代表SA信號的活性，SA可以通過促進PR基因的表達以響應植物受到的脅迫[17]。PR-1、PR-2、PR-5、PR-8等的表達水平提高被廣泛認為是植物防御誘導的標志[34]。在小麥葉片中，SA處理后PR-1和PR-5的表達水平提高，從而增強了小麥對白粉病的抗性[35]。SA處理‘Gala’葉片后，PR1、PR5、PR8、幾丁質酶和β-1,3-葡聚糖酶基因的表達量顯著提高，從而提高了植物對病菌的抗性[36]。本研究中，‘煙富3’、‘藤牧1號’、‘40-9’等抗性品種(系)中SA合成相關基因MdEDS1、MdPAD4、MdPAL及信號轉導基因MdNPR1、MdPR1、MdPR5表達水平顯著高于‘嘎拉’等感病品種(系)，這說明SA參與了蘋果對炭疽葉枯病的抗性。

SA誘導的抗病性與防御相關酶活性密切相關[30-31,37]。當植物受到病菌侵染時，抗性相關酶直接發(fā)揮抗病功能或通過催化木質素等抗性化合物形成，構成保護性結構使細胞免受病菌的侵害。當‘嘎拉’葉片接種炭疽葉枯病菌后，SA處理可顯著提高接種葉片的總抗氧化能力和誘導防御相關酶(CAT、SOD、POD、PAL和PPO)的活性[36]。POD和SOD是植物重要的抗氧化酶，對清除體內過量活性氧發(fā)揮關鍵作用。通過提高POD和SOD活性，以及總抗氧化能力，可以維持較低水平的ROS，從而降低了病菌對植物的傷害。本研究中，接種炭疽葉枯病菌后，‘藤牧1號’、‘40-9’等抗性品種(系)的MdSOD、MdPOD酶基因表達水平及酶活性等顯著高于‘嘎拉’等感病品種(系)，推測SA可能通過調節(jié)植物體內的氧化還原過程來影響蘋果對炭疽葉枯病菌的抗性，對挖掘優(yōu)異基因、提高育種效率和種質資源利用率具有重要的指導意義。

本研究通過對‘嘎拉’和‘藤牧1號’F1代等多個品種(系)進行抗病性鑒定，發(fā)現‘藤牧1號’、‘40-9’等品種(系)對炭疽葉枯病的抗性較高，并且SA相關基因及氧化還原酶基因表達水平等顯著高于感病品種，初步推斷SA通過影響植株體內病程相關蛋白基因表達及氧化還原反應等，調節(jié)蘋果對炭疽葉枯病的抗性過程，該研究結果為深入挖掘抗性基因以及利用優(yōu)良種質選育抗病品種提供參考，但是SA誘導的植物抗性是一種復雜的生理反應，SA調控蘋果對炭疽葉枯病的抗性機制還需進一步深入研究。