周向平，滕 凱，肖啟明，陳 武，王凱歌，張洪波，劉 峰，劉天波*，4

1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，長(zhǎng)沙市芙蓉區(qū)農(nóng)大路1號(hào) 4101282. 湖南省煙草公司永州市公司，湖南省永州市冷水灘區(qū)珍珠北路69號(hào) 4250003. 湖南省煙草公司湘西自治州公司，湖南省吉首市人民南路118號(hào) 4160004. 湖南省煙草科學(xué)研究所，長(zhǎng)沙市芙蓉南路一段628號(hào) 410004

由茄青枯假單胞菌（Ralstonia solanacearum）引起的煙草青枯病是煙葉生產(chǎn)上的重要病害之一，對(duì)煙葉生產(chǎn)可造成毀滅性的危害。近年來(lái)煙草青枯病危害程度呈明顯上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著我國(guó)的煙草生產(chǎn)［1］。目前防治煙草青枯病主要采用化學(xué)農(nóng)藥，但長(zhǎng)期使用化學(xué)農(nóng)藥容易使病原菌產(chǎn)生抗藥性，并造成環(huán)境污染［2］。生物防治是一種具有良好發(fā)展前景的防治手段，目前利用有益微生物防控青枯病已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)［3］。

植物根際促生菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）是土壤中直接或間接有益于植物生長(zhǎng)的微生物［4］，對(duì)病原菌具有拮抗作用［5］，可誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性（Induce systemicresistance，ISR）［6］，已成為生物防治的重要資源。在水稻、小麥和番茄等糧食作物和蔬菜上的PGPR研究與應(yīng)用較多，并已發(fā) 現(xiàn) 假 單 胞 菌 屬（Pseudomonas）［7］、鏈 霉 菌（Streptomyces）［8］和芽胞桿菌屬（Bacillus）［9］等多個(gè)種屬的土壤微生物具有促生潛能。貝萊斯芽胞桿菌（Bacillus velezensis）作為芽胞桿菌的一個(gè)新種備受關(guān)注，該菌具有廣譜抑菌活性，被廣泛應(yīng)用于植物病害的生物防治［10］。沙月霞等［11］研究發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽胞桿菌E69 預(yù)防稻瘟病等多種真菌病害，對(duì)葉瘟和穗頸瘟的田間預(yù)防效果分別達(dá)到85.97%和69.67%；余水等［12］試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽胞桿菌MT310 對(duì)煙草赤星病菌（Alternaria alternata）抑制率為68.76%。貝萊斯芽胞桿菌能促進(jìn)馬鈴薯［13］、辣椒［14］和黃瓜［15］等的生長(zhǎng)，有效抑制青枯病菌（Ralstonia solanacearum）、赤星病菌（Alternaria Alternate）和煙草黑脛病菌（Phytophthora nicotianae）等病原菌的生長(zhǎng)［16］。李苗苗等［17］研究表明，貝萊斯芽胞桿菌GY1 可顯著促進(jìn)煙草種子的萌發(fā)和煙株的生長(zhǎng)，GY1 菌懸液處理煙草種子，萌發(fā)率較對(duì)照提高20.67%；閆助冰等［18］篩選出具有較強(qiáng)拮抗作用的貝萊斯芽胞桿菌XC1，能顯著促進(jìn)平邑甜茶幼苗的生長(zhǎng)；耿妍等［19］灌根施用貝萊斯芽胞桿菌B006 菌劑處理的盆栽茄子株高、莖粗、根長(zhǎng)和根干質(zhì)量比對(duì)照分別提高16.7%、20.7%、28.7%和67.0%。貝萊斯芽胞桿菌因其具有抑制病原菌、提高宿主免疫力、促進(jìn)植物生長(zhǎng)等功能，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物病害的防控，如貝萊斯芽胞桿菌FZB42已經(jīng)被商業(yè)化應(yīng)用，作為生物肥料和生物防治劑在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域被廣泛使用［20］。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外有關(guān)貝萊斯芽胞桿菌的報(bào)道越來(lái)越多，但對(duì)貝萊斯芽胞桿菌作為植物根際促生菌在煙草上的促生和抗病等方面研究仍鮮見報(bào)道。為此，以前期試驗(yàn)獲得的植物根際促生菌貝萊斯芽胞桿菌F10為材料，通過盆栽和田間小區(qū)試驗(yàn)考察其對(duì)煙草的促生作用和對(duì)煙草青枯病的防治效果，旨在為生防菌的田間應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌種貝萊斯芽胞桿菌F10（保藏號(hào)：CBMB205）為前期試驗(yàn)篩選，對(duì)茄青枯假單胞菌（Ralstonia solanacearum）具有較強(qiáng)的拮抗作用。煙草青枯病菌由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。

供試煙草品種為云煙87，在育苗基質(zhì)中培育至5～6 片真葉，備用。培養(yǎng)基為NA 培養(yǎng)基（生防菌F10培養(yǎng)）和LB培養(yǎng)基（煙草青枯病菌培養(yǎng)）。

盆栽試驗(yàn)土壤取自湖南省寧鄉(xiāng)市喻家坳鄉(xiāng)三民村附近農(nóng)田，土壤類型為水稻土，有機(jī)質(zhì)38.24 g/kg，全氮2.12 g/kg，堿解氮165.48 mg/kg，速效鉀204.13 mg/kg。

1.2 方法

1.2.1 煙草根系性狀指標(biāo)測(cè)定

盆栽試驗(yàn)在湖南省寧鄉(xiāng)市喻家坳鄉(xiāng)三民村煙草育苗基地溫室中進(jìn)行。設(shè)置3 個(gè)處理，處理1：生防菌F10；處理2：25%溴菌·壬菌銅（Bromothalonil azelaic bacteria copper，BABC）；處理3：對(duì)照（CK）。每處理3 次重復(fù)，每重復(fù)植煙20 株。選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的5～6 片真葉期的煙苗，移栽于裝有滅菌土的花盆中，移栽后立即于根際灌根接種活化后的生防菌F10（濃度1×108CFU/mL）菌液和BABC（稀釋1000倍），每株約50 mL，對(duì)照接入等量的NA培養(yǎng)基。

在移栽后10、20和30 d各處理隨機(jī)取3株煙苗，將煙苗整株挖出，用清水沖洗干凈，測(cè)量根鮮質(zhì)量、總根長(zhǎng)、總根表面積和總根體積，采用TTC法［21］測(cè)定根系活力。將根系放置于烘箱中于105 ℃殺青30 min，60 ℃繼續(xù)烘干48 h，取出測(cè)定根系干質(zhì)量。

1.2.2 煙草地上部分農(nóng)藝性狀指標(biāo)測(cè)定

在移栽后10、20和30 d各處理隨機(jī)取3株煙苗，自然條件下風(fēng)干后，參照文獻(xiàn)［22-23］的方法測(cè)量整株鮮質(zhì)量、株高、莖圍、葉數(shù)和最大葉面積等農(nóng)藝性狀指標(biāo)。將煙株置于烘箱中105 ℃殺青30 min，60 ℃繼續(xù)烘干48 h，取出測(cè)定整株干質(zhì)量。

1.2.3 煙草葉片生理指標(biāo)測(cè)定

移栽后10、20和30 d各處理隨機(jī)取3株煙，每處理取煙株中部3 片葉，剪碎混合均勻后，參照文獻(xiàn)［24］測(cè)定過氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性，采用過氧化氫分解量法測(cè)定過氧化氫酶（CAT）活性［25］。重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。

1.2.4 生防菌對(duì)煙草青枯病的防治效果評(píng)價(jià)

通過盆栽和田間小區(qū)試驗(yàn)評(píng)價(jià)生防菌對(duì)煙草青枯病的防治效果。試驗(yàn)設(shè)計(jì)同1.2.1 節(jié)。處理24 h后，將煙草青枯菌懸液（1×108CFU/mL）接種于各處理的煙苗根際，每株5 mL。盆栽試驗(yàn)將煙株置于30 ℃的溫室中保溫保濕培養(yǎng)，大田小區(qū)試驗(yàn)接種后自然生長(zhǎng)，并觀察發(fā)病情況。始見病株后，第14 天調(diào)查病害發(fā)生情況。依據(jù)GB/T 23222—2008［26］進(jìn)行病害調(diào)查，并統(tǒng)計(jì)發(fā)病率、病情指數(shù)和防治效果。

計(jì)算公式：

田間小區(qū)試驗(yàn)在湖南省江永縣夏層鋪鎮(zhèn)東鋪村旱地?zé)熖镞M(jìn)行，選取連年青枯病發(fā)病較重的煙田地塊。試驗(yàn)設(shè)計(jì)同盆栽試驗(yàn)，每小區(qū)面積67 m2（約100 株），隨機(jī)排列，小區(qū)之間設(shè)置隔離行，小區(qū)邊緣設(shè)置保護(hù)行。移栽時(shí)和移栽后30 d 分別用生防菌F10 發(fā)酵液（1×108CFU/mL）和BABC（稀釋1000 倍液）灌根，每株200 mL，對(duì)照用等量NA 培養(yǎng)基灌根。按優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程進(jìn)行田間管理。在煙草青枯病始發(fā)期開始調(diào)查，每7 d調(diào)查1次病害發(fā)生情況，共調(diào)查3次。調(diào)查統(tǒng)計(jì)方法同盆栽試驗(yàn)。

1.2.5 大田煙株農(nóng)藝性狀和經(jīng)濟(jì)性狀指標(biāo)測(cè)定

田間小區(qū)試驗(yàn)評(píng)價(jià)生防菌對(duì)煙株農(nóng)藝性狀和經(jīng)濟(jì)性狀的影響處理設(shè)置同1.2.2 節(jié)。團(tuán)棵期（移栽后40 d）、旺長(zhǎng)期（移栽后60 d）和成熟期（移栽后80 d）在各小區(qū)選取代表性的未發(fā)病煙株10 株，參照YC/T 142—2010［27］調(diào)查并記載煙株株高、莖圍、葉數(shù)和最大葉面積。煙葉成熟后，分小區(qū)采收、編竿，用密集式烤房、三段五步式烘烤工藝進(jìn)行烘烤，按照烤煙分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)GB2635—1992［28］進(jìn)行煙葉分級(jí)，并統(tǒng)計(jì)煙葉產(chǎn)量、上等煙比例和上中等煙比例。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，使用SPSS 18.0軟件進(jìn)行方差分析，用最小顯著差數(shù)法（LSD）進(jìn)行數(shù)據(jù)間差異的顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防菌對(duì)煙株根系發(fā)育的影響

圖1 結(jié)果表明，生防菌對(duì)煙株生長(zhǎng)發(fā)育影響明顯。處理后30 d，F(xiàn)10處理煙株的根系發(fā)育顯著優(yōu)于BABC處理和CK。

圖1 不同處理對(duì)煙株根系生長(zhǎng)的影響（移栽后30 d）Fig.1 Effects of different treatments on root growth of tobacco plants（30 days after transplanting）

從根系鮮質(zhì)量（圖2a）來(lái)看，不同時(shí)期F10 處理根系鮮質(zhì)量均顯著高于BABC 處理和CK，移栽后30 d F10處理根系鮮質(zhì)量比CK提高58.72%；從根系干質(zhì)量來(lái)看（圖2b），移栽后20 d和30 d F10處理根系干質(zhì)量顯著高于BABC處理和CK，在移栽后30 d，F(xiàn)10 處理根系干質(zhì)量比CK 增加58.55%；從總根長(zhǎng)（圖2c）來(lái)看，移栽后10、20 和30 d F10 處理總根長(zhǎng)比BABC處理和CK顯著增長(zhǎng)，移栽后30 d F10處理總根長(zhǎng)比CK 增加15.46%；從總根表面積（圖2d）和總根體積（圖2e）來(lái)看，在不同時(shí)期F10 處理總根表面積和總根體積均顯著高于BABC處理和CK；從根系活力來(lái)看（圖2f），在不同時(shí)期F10處理根系活力均顯著大于其他處理，移栽后30 d F10 處理根系活力比CK提高35.65%。

圖2 不同處理對(duì)煙株根系發(fā)育的影響Fig.2 Effects of different treatments on root development of tobacco plants

2.2 生防菌對(duì)煙株地上部分生長(zhǎng)的影響

圖3 結(jié)果表明，生防菌對(duì)煙株地上部生長(zhǎng)影響明顯。處理后30 d，生防菌F10處理煙株的長(zhǎng)勢(shì)顯著優(yōu)于BABC 處理和對(duì)照，其中對(duì)煙株株高和葉面積影響最為明顯。

圖3 不同處理對(duì)煙株生長(zhǎng)的影響（移栽后30 d）Fig.3 Effects of different treatments on growth of tobacco plants（30 days after transplanting）

不同處理煙株農(nóng)藝性狀指標(biāo)測(cè)定結(jié)果見圖4。從圖4a和圖4b來(lái)看，移栽后10、20和30 d，F(xiàn)10處理煙株鮮質(zhì)量和干質(zhì)量均顯著高于BABC處理和CK，移栽后30 d F10 處理煙株鮮質(zhì)量和干質(zhì)量分別比CK 提高34.38%和38.93%。從株高來(lái)看（圖4c），在不同生長(zhǎng)時(shí)期F10 處理煙株顯著高于BABC 處理和CK，移栽后30 d F10處理煙株比CK提高54.30%；從莖圍來(lái)看（圖4d），不同時(shí)期F10 處理煙株均顯著高于BABC 處理和CK，隨著生育期的推進(jìn)，差異逐漸增大，移栽后30 d F10處理煙株較CK提高51.20%；從葉數(shù)來(lái)看（圖4e），不同時(shí)期F10 處理的煙株葉數(shù)均顯著高于BABC處理和CK，移栽后30 d F10處理葉數(shù)較CK提高23.07%。從最大葉面積來(lái)看（圖4f），在不同時(shí)期F10 處理煙株最大葉面積均顯著大于BABC 處理和CK，移栽后30 d F10 處理煙株最大葉面積比CK提高43.12%。

圖4 不同處理對(duì)煙株農(nóng)藝性狀的影響Fig.4 Effects of different treatments on agronomic traits of tobacco plants

2.3 生防菌對(duì)煙草葉片生理指標(biāo)的影響

施用生防菌F10 可明顯提高煙草葉片POD、SOD和CAT 3種酶的活性（圖5）。從POD活性來(lái)看（圖5a），3 個(gè)處理的煙草葉片POD 活性均呈增加趨勢(shì)，F(xiàn)10處理和BABC與CK之間存在顯著差異，F(xiàn)10處理煙草葉片POD活性最高，移栽后30 d，F(xiàn)10處理的煙草葉片POD活性比對(duì)照提高25.32%；從SOD活性來(lái)看（圖5b），F(xiàn)10 和BABC 處理煙草葉片酶活性均高于CK，不同時(shí)期F10處理的煙草葉片SOD活性均最高；從CAT活性來(lái)看（圖5c），F(xiàn)10處理對(duì)煙草葉片CAT活性的影響在移栽后10、20和30 d呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，但煙草葉片CAT 酶活性均顯著高于CK。

圖5 不同處理對(duì)煙草葉片生理指標(biāo)的影響Fig.5 Effects of different treatments on physiological indexes of tobacco leaves

2.4 生防菌對(duì)煙草青枯病的防治效果

溫室盆栽和小區(qū)試驗(yàn)（表1）結(jié)果表明，生防菌F10 對(duì)煙草青枯病有明顯防治效果，溫室盆栽和田間試驗(yàn)中，生防菌F10 對(duì)煙草青枯病防效分別為60.49%和54.91%，防效顯著高于化學(xué)藥劑BABC。

表1 不同處理對(duì)煙草青枯病的防治效果①②Tab.1 Control effects of different treatments against tobacco bacterial wilt

2.5 生防菌對(duì)大田煙株農(nóng)藝性狀和經(jīng)濟(jì)性狀的影響

2.5.1 生防菌對(duì)大田煙株農(nóng)藝性狀的影響

不同生長(zhǎng)時(shí)期，不同處理煙株的農(nóng)藝性狀指標(biāo)差異顯著（表2）。施用生防菌F10 可顯著改善烤煙的農(nóng)藝性狀，烤煙株高、莖圍、葉片數(shù)和最大葉面積均高于BABC 處理和CK。團(tuán)棵期生防菌F10 處理較CK 株高、莖圍、葉片數(shù)和最大葉面積分別提高11.02%、3.80%、1.02%和3.73%；旺長(zhǎng)期生防菌F10處理較CK 株高、莖圍、葉片數(shù)和最大葉面積分別提高2.18%、0.37%、5.16%和3.30%；成熟期生防菌F10 處理較CK 株高、莖圍、葉片數(shù)和最大葉面積分別提高3.51%、3.76%、5.42%和4.51%。

表2 不同時(shí)期各處理煙株農(nóng)藝性狀比較Tab.2 Agronomic traits of tobacco plants at different stages under different treatments

2.5.2 生防菌對(duì)煙葉經(jīng)濟(jì)性狀的影響

施用生防菌F10 能顯著提高烤煙經(jīng)濟(jì)性狀指標(biāo)，煙葉產(chǎn)量、上等煙比例和上中等煙比例均高于BABC 處理，顯著高于CK（表3）。與CK 相比，煙葉產(chǎn)量、上等煙比例和上中等煙比例分別提高11.82%、31.46%和13.17%。表明施用生防菌F10有助于提高烤煙經(jīng)濟(jì)效益。

表3 不同處理煙葉經(jīng)濟(jì)性狀比較Tab.3 Economic traits of tobacco leaves under different treatments

3 討論

貝萊斯芽胞桿菌是芽胞桿菌屬的一個(gè)新種，具有廣譜抑菌活性和促生長(zhǎng)作用，被廣泛應(yīng)用于植物病害的生物防治［29］。本研究中發(fā)現(xiàn)根際接種貝萊斯芽胞桿菌F10 能促進(jìn)煙草根系生長(zhǎng)發(fā)育，煙株根系鮮質(zhì)量、干質(zhì)量和根系活力等指標(biāo)顯著提高，同時(shí)可促進(jìn)煙草地上部的生長(zhǎng)發(fā)育，對(duì)煙株莖圍、株高和葉面積的影響尤為明顯，這與李苗苗等［17］的研究結(jié)果一致。貝萊斯芽胞桿菌F10 能促進(jìn)煙株和根系生長(zhǎng)，從而更高效地促進(jìn)煙苗對(duì)水分和養(yǎng)分的吸收，進(jìn)而增強(qiáng)了葉片光合作用，推斷可能與其能夠釋放促進(jìn)植物生長(zhǎng)的植物激素和揮發(fā)性化合物有關(guān)［30］。本研究中僅對(duì)煙株及根系的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)行了測(cè)定，而有關(guān)生防菌促生的相關(guān)物質(zhì)及作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

誘導(dǎo)植物抗性是植物根際促生菌生防作用的重要機(jī)制之一，可以通過JA/ET 信號(hào)通路誘導(dǎo)植物ISR，通過活性氧爆發(fā)、細(xì)胞壁的強(qiáng)化、防御相關(guān)酶的累積以及抗菌物質(zhì)的產(chǎn)生等誘導(dǎo)植物細(xì)胞的防御反應(yīng)［31］。活性氧具有雙重作用，在激發(fā)寄主抗病反應(yīng)的同時(shí)，活性氧的積累超過一定量時(shí)也會(huì)使寄主本身細(xì)胞受到傷害［32］，植物可通過SOD、POD 和CAT等抗氧化酶來(lái)清除活性氧的危害［33］。本研究中發(fā)現(xiàn)煙草根際接種生防菌F10后，葉片SOD、POD和CAT等幾種防御酶活性均顯著提高，表明生防細(xì)菌F10可誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，可能與增強(qiáng)煙株對(duì)青枯病的抵抗力有關(guān)，與陳冉等［34］在擬南芥上和陳爽等［35］在大豆上的研究結(jié)果基本一致。貝萊斯芽胞桿菌能產(chǎn)生多種次級(jí)代謝產(chǎn)物，但這些抑菌物質(zhì)激發(fā)宿主的主要免疫應(yīng)答機(jī)制尚不清楚，且本研究中測(cè)定的防御酶也存在局限性，下一步將擴(kuò)大防御酶測(cè)定范圍，定向研究某一種或某一類抑菌物質(zhì)對(duì)宿主的生防作用，利用代謝組學(xué)分析貝萊斯芽胞桿菌與宿主相互作用時(shí)的應(yīng)答機(jī)制。

本研究結(jié)果表明，煙草根際接種貝萊斯芽胞桿菌F10 顯著降低了煙草青枯病發(fā)病率和病情指數(shù)，溫室盆栽和大田小區(qū)試驗(yàn)相對(duì)防效優(yōu)于化學(xué)藥劑溴菌·壬菌銅，與劉艷霞［36］的研究結(jié)果一致。植物根際促生菌不僅能抑制煙草病害，還能促進(jìn)煙株大田生長(zhǎng)，有效改善烤煙的農(nóng)藝性狀，提高烤后煙葉等級(jí)結(jié)構(gòu)，提高經(jīng)濟(jì)效益［37］，但對(duì)煙葉外觀品質(zhì)和內(nèi)在品質(zhì)的影響還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

貝萊斯芽胞桿菌F10 對(duì)煙草具有促生和防病作用，可明顯改善煙草根系和地上部農(nóng)藝性狀，提高煙草葉片POD、SOD 和CAT 等抗氧化酶的活性，對(duì)煙草青枯病防治效果達(dá)到50%以上，煙葉產(chǎn)量、上等煙和上中等煙比例均有提高，烤煙經(jīng)濟(jì)效益也顯著提高。