李曉芳，周潤鑫，王春瓊，魏力杰，張 燕，李天偉，王兆芹*

1. 北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京市昌平區(qū)回龍觀國際信息產(chǎn)業(yè)基地高新四街8號 1022062. 北京市食品安全免疫快速檢測工程技術(shù)研究中心，北京市昌平區(qū)回龍觀國際信息產(chǎn)業(yè)基地高新四街8號 1022063. 云南省煙草質(zhì)量監(jiān)督檢測站，昆明市高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)科醫(yī)路41號 650106

多菌靈，化學(xué)名稱為苯并咪唑-2-氨基甲酸酯，是一種廣譜、高效、低毒、內(nèi)吸性苯并咪唑類殺菌劑，廣泛用于麥類、水稻、棉花、油菜、花生、甘薯、蔬菜、果樹、花卉等植物的病害防治。市場上推廣應(yīng)用的苯并咪唑類殺菌劑產(chǎn)品主要有多菌靈、苯菌靈和甲基硫菌靈等。根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥登記資料，甲基硫菌靈為在煙葉上登記使用的農(nóng)藥，用于煙葉白粉病、根黑腐病的防治［1］。甲基硫菌靈、苯菌靈為不穩(wěn)定化合物，在植物體內(nèi)可代謝為多菌靈［2-4］。近年來，多菌靈在煙葉中檢出率較高，給煙葉質(zhì)量和生產(chǎn)帶來一定的風(fēng)險。目前，國內(nèi)外對于多菌靈的分析方法主要有分光光度法［5-6］、超高效液相色譜法［7-8］、高效液相色譜法［9-10］、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［11-13］、拉曼光譜法等［14-15］。上述方法需要在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下由專業(yè)人員進(jìn)行操作，樣品前處理繁瑣費(fèi)時，還需配備昂貴的儀器設(shè)備，檢測成本高、耗時長、操作復(fù)雜。此外，也有報道利用酶聯(lián)免疫法［16］、可視化微陣列蛋白芯片法［17］快速檢測多菌靈的殘留量，但樣品集中在蜂蜜、蔬菜、水果等種類，同時這些方法對實(shí)驗(yàn)人員、環(huán)境、儀器設(shè)備也有嚴(yán)格要求，操作時間在1 h以上，不適用于基層現(xiàn)場快速檢測。相關(guān)文獻(xiàn)［1，18-22］中報道的煙葉中多菌靈檢測方法主要是QuEchERS前處理技術(shù)與LC-MS/MS 檢測技術(shù)相結(jié)合的方法，該方法操作復(fù)雜，成本高，不能完全滿足我國煙葉質(zhì)量控制需求。鑒于此，本研究中對膠體金試紙條產(chǎn)品形式進(jìn)行篩選，在能滿足檢測需求的同時，利用變異系數(shù)較小的工藝制備試紙條產(chǎn)品；并配套手持式膠體金讀數(shù)儀，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，形成能現(xiàn)場定量檢測煙葉樣品的商品化試紙條產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

50個煙葉樣品（2020年產(chǎn)自云南、貴州的中部和下部煙葉）。

1000 μg/mL的多菌靈乙醇溶液（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研檢測所）；苯菌靈、甲基硫菌靈、三唑酮、三唑醇標(biāo)準(zhǔn)品（≥99%，德國Dr. Ehrenstorfer 公司）；牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）、卵清蛋白（Ovalbumin，OVA）、Triton X-100、羊抗鼠IgG（美國Sigam 公司）；碳酸鉀、聚山梨酯-80、蔗糖、乙醇、甲醇（AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；硝酸纖維素膜（NC膜，德國Sartorius公司）；膠體金溶液、多菌靈單克隆抗體、多菌靈半抗原-OVA 偶聯(lián)物（自制）；樣品稀釋液為pH=7.2的0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液（自制）。

ESJ110-4A電子天平（感量0.0001 g，沈陽龍騰電子有限公司）；TGL16C臺式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘立科學(xué)儀器有限公司）；XYZ3060 三維噴點(diǎn)平臺（美國Bio-Dot 公司）；CTS300 數(shù)控裁條機(jī)、ZQ2402微電腦自動斬切機(jī)（上海金標(biāo)生物科技有限公司）；GT710 膠體金讀數(shù)儀、KMH-102 恒溫孵育器（北京勤邦生物技術(shù)有限公司）；FSJ-A05N6 磨粉機(jī)（小熊電器股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 多菌靈試紙條產(chǎn)品形式的確定

用膠體金免疫層析技術(shù)篩選出適合多菌靈試紙條的NC 膜、抗原抗體稀釋液、金標(biāo)墊和樣品墊封閉液后，用凍干金配套試紙卡、噴金配套試紙卡兩種工藝制備出試紙條。試紙卡分別以包被原和羊抗鼠IgG作為NC膜上的檢測線（T線）和質(zhì)控線（C線）［23］，采用劃膜儀進(jìn)行劃線，兩線相隔5 mm，噴量1 μL/cm，凍干金配套試紙卡、噴金配套試紙卡包被原的質(zhì)量濃度分別為0.5、0.3 mg/mL，羊抗鼠IgG 的濃度分別為0.6、0.4 mg/mL，將包被好的NC膜置于37 ℃下干燥4 h；噴金配套試紙卡產(chǎn)品用噴膜儀將金標(biāo)抗體按5 μL/cm的量均勻噴涂在金標(biāo)墊上，37 ℃下干燥2 h；依次將NC 膜、金標(biāo)墊、樣品墊、吸水墊粘貼于PVC底板上，貼好后切成4 mm 寬的試紙條，裝在特制的塑料制卡中并置于密封袋內(nèi)，加干燥劑，密封，室溫保存。基于凍干金配套試紙卡產(chǎn)品，向微孔板中加入50 μL多菌靈單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物，放入冷凍干燥機(jī)中，冷阱溫度-50 ℃條件下，預(yù)凍3 h，真空干燥15 h，即得到凍干有多菌靈單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的微孔試劑，密封4 ℃保存。試紙條制備完成后，往空白煙葉樣品中添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0、0.09、0.50 mg/kg）的多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品，然后進(jìn)行板內(nèi)、批內(nèi)變異系數(shù)測試，選擇變異系數(shù)最小、同時能滿足檢測范圍需求的產(chǎn)品形式。

1.2.2 多菌靈試紙條檢測溫度的確定

結(jié)合現(xiàn)場實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度和抗原抗體耐受溫度，選擇室溫（25 ℃）、30 ℃、33 ℃、35 ℃、40 ℃5 個溫度，往空白煙葉樣品中添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品，對比試紙條T、C 線比值（T/C 值）［23］的變化，選擇T/C 值梯度較好的反應(yīng)溫度作為方法檢測溫度。

1.2.3 樣品處理及檢測方法

煙葉去主脈后在60 ℃條件下烘干，利用磨粉機(jī)將其粉碎，然后稱?。?.00±0.05）g 樣品，加入5 mL甲醇，振蕩1 min。移取100 μL上清液，再加入900 μL樣品稀釋液，混勻即為待檢液。將恒溫孵育器提前加熱至1.2.2 節(jié)確定的溫度，將試紙條插入孵育器卡槽中，移取100 μL待檢液，一次性垂直滴加于加樣孔（S孔）中，反應(yīng)10 min后，立即用膠體金讀數(shù)儀讀取結(jié)果。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和定量范圍的確定

按樣品處理及檢測方法測試多菌靈質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0、0.020、0.045、0.090、0.15、0.25、0.50、1.0、1.5、2.0 mg/kg 的煙葉樣品的T/C 值，每個質(zhì)量分?jǐn)?shù)的樣品平行測試6次，計算平均值，結(jié)合儀器定值樣品進(jìn)行校正，根據(jù)校正后對應(yīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)樣品的T/C 值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。對標(biāo)準(zhǔn)曲線線性較好的區(qū)間進(jìn)行曲線擬合，R2大于0.99的線性范圍為定量范圍。

1.2.5 試紙條性能指標(biāo)的確定

①特異性：分別向空白煙葉樣品中添加其他常見的苯并咪唑類農(nóng)藥（苯菌靈、甲基硫菌靈、噻菌靈）及三唑酮、三唑醇至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 mg/kg，用試紙條進(jìn)行檢測，每種藥物平行測定2次，根據(jù)結(jié)果判定試紙條特異性。

②檢測限：利用制備好的多菌靈試紙條檢測20個經(jīng)過預(yù)處理的陰性煙葉樣品，用膠體金讀數(shù)儀讀取對應(yīng)多菌靈的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。計算20個陰性樣品中多菌靈質(zhì)量分?jǐn)?shù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，參照文獻(xiàn)［24］將多菌靈質(zhì)量分?jǐn)?shù)的平均值+3×標(biāo)準(zhǔn)差作為煙葉樣品中多菌靈的最低檢測限。

③準(zhǔn)確性和精密度：取3個不同來源的空白煙葉樣品，分別添加4 個質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平（0.045、0.090、0.180、0.360 mg/kg）的多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品，每個水平下用3批次的試紙條分別進(jìn)行6次平行測試，根據(jù)各添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)的實(shí)際測定值計算添加回收率和批內(nèi)變異系數(shù)，從而判斷試紙條的準(zhǔn)確性和精密度。

④與高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法（High performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）檢測結(jié)果對比：隨機(jī)選取50個煙葉樣品，分別用多菌靈試紙條和儀器方法進(jìn)行檢測，確定陽性樣品檢出符合率。儀器檢測方法參照YC/T 405.1—2011［18］的方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 多菌靈試紙條產(chǎn)品形式

由表1 可知，添加的多菌靈質(zhì)量分?jǐn)?shù)相同時，凍干金配套試紙卡的抑制率高于噴金配套試紙卡，表明凍干金配套試紙卡的靈敏度更高；但噴金配套試紙卡的板內(nèi)和批內(nèi)變異系數(shù)均小于凍干金配套試紙卡，同時噴金配套試紙卡無需溶解凍干金步驟。因此，選擇噴金配套試紙卡作為多菌靈試紙條的產(chǎn)品形式。

表1 多菌靈試紙條的產(chǎn)品形式Tab.1 Product types of test strips for carbendazim

2.2 多菌靈試紙條檢測溫度

利用膠體金讀數(shù)儀，檢測出7個梯度樣品中多菌靈的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。由圖1可知，溫度一定時，隨著多菌靈質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，T/C 值呈下降趨勢，原因是多菌靈檢測試紙條應(yīng)用了競爭抑制免疫層析的原理，樣品中的多菌靈在流動過程中與膠體金標(biāo)記的特異性單克隆抗體結(jié)合，抑制了抗體和NC膜檢測線（T線）上的多菌靈-BSA偶聯(lián)物的結(jié)合，從而導(dǎo)致檢測線顏色發(fā)生變化。對于多菌靈質(zhì)量分?jǐn)?shù)相同的樣品，T/C值隨溫度升高而增大，其中，40 ℃時，空白樣品與多菌靈質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.000 mg/kg的樣品的梯度最大，線性范圍最好，更有利于后續(xù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。因此，最終選擇40 ℃為多菌靈試紙條的檢測溫度。

圖1 不同檢測溫度和多菌靈質(zhì)量分?jǐn)?shù)下試紙條T/C值的變化Fig.1 Variations of T/C value of test strip at different detection temperatures and carbendazim mass fractions

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量范圍

當(dāng)空白煙葉樣品中添加多菌靈質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0、0.020、0.045、0.090、0.15、0.25、0.50、1.0、1.5、2.0 mg/kg的多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品時，對比利用多菌靈試紙條測試的T/C 值結(jié)果與儀器定值樣品結(jié)果，確定最終10個質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平的樣品的T/C 值，然后以多菌靈的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫軸，T/C值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2 所示。取曲線中線性范圍較好區(qū)間（0.020～0.50 mg/kg）進(jìn)行曲線擬合，如圖3 所示，回歸方程為y=0.721lnx+0.273，R2=0.999。因此，確定該方法的定量范圍為0.020～0.50 mg/kg。

圖2 膠體金試紙條的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of colloidal gold test strip

圖3 多菌靈質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.020～0.50 mg·kg-1范圍內(nèi)的擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Fitting standard curve of carbendazim in the mass fraction range of 0.020-0.50 mg·kg-1

2.4 多菌靈試紙條性能指標(biāo)

2.4.1 特異性

由表2可知，利用多菌靈試紙條檢測與多菌靈具有類似功能或結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥時，如苯菌靈、甲基硫菌靈等，檢測結(jié)果均為陰性，表明該試紙條與其他苯并咪唑類殺菌劑和三唑類藥物無交叉反應(yīng)，具有較好的特異性。

表2 多菌靈試紙條的特異性結(jié)果Tab.2 Specific results of test strip for carbendazim

2.4.2 檢測限

利用制備好的多菌靈試紙條測定20個陰性煙葉樣品，檢測結(jié)果見表3。20個陰性樣品對應(yīng)的多菌靈質(zhì)量分?jǐn)?shù)的平均值為0.005 mg/kg，標(biāo)準(zhǔn)差為0.004 mg/kg。根據(jù)1.2.5 節(jié)中最低檢測限的定義可知，對于本研究中制備的試紙條，煙葉樣品中多菌靈的最低檢測限為0.017 mg/kg。

表3 陰性樣品中多菌靈質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定結(jié)果Tab.3 Mass fractions of carbendazim in negative samples

2.4.3 準(zhǔn)確性和精密度

向空白煙葉樣品中添加多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.045、0.090、0.180、0.360 mg/kg 4個水平，每個質(zhì)量分?jǐn)?shù)對應(yīng)的樣品用3 批次的試紙條分別進(jìn)行6次平行測試，結(jié)果見表4?？梢?，多菌靈試紙條定量檢測方法的加標(biāo)回收率范圍為95.6%～128.9%，批內(nèi)變異系數(shù)范圍為6.2%～11.2%，均符合檢測方法要求。

表4 多菌靈試紙條檢測的準(zhǔn)確性和精密度結(jié)果（n=6）Tab.4 Accuracy and precision of test strip for carbendazim（n=6）

2.4.4 與儀器方法檢測結(jié)果對比

檢測的50 個煙葉樣品中，儀器檢測結(jié)果為陰性的樣品有30個。其中，對應(yīng)的試紙條檢測結(jié)果中有29 個均小于試紙條檢測限，也為陰性；僅46號樣品的檢測結(jié)果（0.032 mg/kg）大于檢測限，說明試紙條檢測有一定的假陽性，陰性樣品檢測結(jié)果準(zhǔn)確率大于95%。在煙葉生產(chǎn)加工過程中，需要用不同原料混合配料；同時在檢測過程中，需要對待檢樣品進(jìn)行抽樣、去主脈粉碎后檢測，樣品的取樣代表性和均一性對檢測結(jié)果影響較大。因此，為了降低假陰性，快速檢測方法允許有一定的假陽性。

20 個陽性樣品的試紙條檢測結(jié)果和儀器檢測結(jié)果如表5 所示，相對偏差在3.00%～48.59%之間，對兩種檢測結(jié)果的相關(guān)性分析如圖4所示。試紙條檢測結(jié)果與HPLC-MS/MS 檢測結(jié)果的線性方程為y=0.8351x+0.0460，相關(guān)系數(shù)R=0.8456；在定量范圍0.020～0.50 mg/kg 內(nèi)的線性方程為y=0.9128x+0.0068，相關(guān)系數(shù)R=0.9604。結(jié)果表明，多菌靈試紙條的檢測結(jié)果與HPLC-MS/MS 檢測結(jié)果在定量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，可以應(yīng)用于煙葉中多菌靈的檢測篩選工作。

表5 試紙條與HPLC-MS/MS檢測實(shí)際煙葉樣品中多菌靈質(zhì)量分?jǐn)?shù)的結(jié)果①Tab.5 Test results of mass fractions of carbendazim in tobacco leaves by test strip and HPLC-MS/MS（mg·kg-1）

圖4 試紙條與HPLC-MS/MS法檢測煙葉中多菌靈的相關(guān)性結(jié)果Fig.4 Correlation between test results of test strip and HPLC-MS/MS for carbendazim in tobacco

在實(shí)際檢測工作中，取樣代表性、樣品粉碎程度和含水率等會影響檢測結(jié)果，為了更好地提高煙葉中多菌靈的檢測結(jié)果準(zhǔn)確率，建議從生產(chǎn)、流通環(huán)節(jié)加強(qiáng)質(zhì)量監(jiān)管，將合格品和不合格品進(jìn)行分類管理。

3 結(jié)論

用膠體金免疫層析技術(shù)并配套膠體金讀數(shù)儀，建立了能有效檢測煙葉中殘留的多菌靈藥物的快速定量檢測方法。①研制的多菌靈定量試紙條的檢測限為0.017 mg/kg，檢測范圍為0.020～2.0 mg/kg，定量范圍為0.020～0.50 mg/kg，加標(biāo)回收率為95.6%～128.9%，批內(nèi)變異系數(shù)為6.2%～11.2%；與HPLC-MS/MS 檢測結(jié)果相比，陰性樣品檢測結(jié)果準(zhǔn)確率大于95%，陽性樣品檢測結(jié)果在定量范圍0.020～0.50 mg/kg內(nèi)線性關(guān)系良好。②對于與多菌靈結(jié)構(gòu)相似的藥物，試紙條與其無交叉反應(yīng)，可特異性地定量檢測煙葉中多菌靈殘留的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。