唐井玉，杜漢宇，2，孟春春，劉光清

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，烏魯木齊 830052)

干擾素刺激基因15 (interferon-stimulated gene 15,ISG15) 是干擾素誘導(dǎo)最強(qiáng)烈最快的ISG分子之一。所有物種的ISG15具有相似的結(jié)構(gòu)，均由2個泛素樣蛋白 (Ubiquitin-like protein,Ubl) 結(jié)構(gòu)域組成并都含有特征性的β-折疊，這2個結(jié)構(gòu)域被稱為“鉸鏈”的多肽序列連接[1]。但與其他泛素蛋白相比，ISG15序列差異大，具有多樣性的特征。ISG15有2種發(fā)揮作用的形式，一種是通過ISG化修飾與蛋白質(zhì)中的賴氨酸殘基結(jié)合發(fā)揮作用，整個過程與泛素化過程相似，包括了E1激活酶、E2結(jié)合酶和E3連接酶，USP18解聚酶可以將ISG15從被修飾的蛋白質(zhì)上移除[2]，目前鑒定出的可以被ISG化修飾的蛋白已有上百種[3]；另一種作用形式是未結(jié)合的處于游離狀態(tài)的ISG15。

ISG15具有多種生物學(xué)功能，包括調(diào)節(jié)宿主對病原微生物感染的應(yīng)答[4-5]、調(diào)節(jié)宿主信號通路[6-7]、發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[8]，同時還參與調(diào)節(jié)宿主損傷和DNA修復(fù)[9-10]、腫瘤的發(fā)生[11]、凋亡和自噬[12]，在生命活動過程中發(fā)揮重要的作用。目前關(guān)于羊ISG15的研究較少，主要研究集中在ISG15對反芻動物妊娠期的調(diào)節(jié)，ISG15被認(rèn)為是決定子宮對胚胎接受性的重要因素之一。牛、水牛和綿羊在妊娠早期ISG15會短暫表達(dá)[13]。羊ISG15在抑制病毒感染、調(diào)節(jié)山羊乳腺上皮細(xì)胞凋亡和炎癥等方面有了初步研究[14-15]。

ISG15從發(fā)現(xiàn)至今已有40多年，但由于不同宿主物種之間ISG15功能和結(jié)構(gòu)之間存在差異，因此研究進(jìn)展緩慢。目前關(guān)于人和小鼠ISG15的作用、空間結(jié)構(gòu)等研究較多，但對于山羊的研究報道較少。本研究克隆表達(dá)山羊ISG15并通過生物信息學(xué)分析了解其基本的信息、結(jié)構(gòu)和功能，對其亞細(xì)胞定位初步研究，旨在進(jìn)一步理解山羊ISG15蛋白質(zhì)的功能，為后續(xù)研究山羊ISG15的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、載體及細(xì)胞 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-Myc載體、HEK-293T細(xì)胞和山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞(EEC)均由上海獸醫(yī)研究所伴侶動物生物安全與防控技術(shù)團(tuán)隊(duì)保存。

1.1.2 主要試劑與儀器 反轉(zhuǎn)錄試劑、膠回收試劑盒和無縫連接試劑盒均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；Trizol、Lipofectamine 3000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒、蛋白Marker、ECL顯色液、羊抗兔熒光二抗594和羊抗鼠熒光二抗594均購自Thermo公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；EcoRⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶均購自NEB公司；DMEM-F12、DMEM和Opti-MEM培養(yǎng)基均購自Gibco公司；鼠源Myc單克隆抗體、牛血清白蛋白均購自西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司；兔源ISG15多克隆抗體由上海獸醫(yī)研究所伴侶動物生物安全與防控技術(shù)團(tuán)隊(duì)制備并保存；藍(lán)色熒光染料DAPI購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。倒置熒光顯微鏡購自Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計及合成 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中預(yù)測的山羊ISG15基因序列(登錄號：XM_005690795)，利用SnapGene軟件設(shè)計擴(kuò)增山羊ISG5基因的特異性引物，上游引物ISG15-F：5′-tggaggcccgaattcGGATGGGCGGGGACCTGAAG-3′，下游引物ISG15-R：5′-ggccgcggtacctcgagCTACCC-ACCCCGCAGACG-3′，上、下游引物分別加入pCMV-Myc載體中EcoRⅠ和XhoⅠ兩個酶切位點(diǎn)兩端的同源臂(小寫字母部分)，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為474 bp。引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.2.2 山羊ISG15基因PCR擴(kuò)增 將EEC細(xì)胞樣品按照Trizol說明書提取總RNA。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA。以cDNA為模板，用高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系50 μL：2×Phanta Max MasterMix 25 μL，上、下游引物各2 μL，模板cDNA 2 μL，ddH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 pCMV-Myc-ISG15重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá) 將pCMV-Myc質(zhì)粒用EcoRⅠ和XhoⅠ兩個限制性內(nèi)切酶37 ℃酶切2 h，使其線性化，酶切產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR產(chǎn)物與酶切后的載體進(jìn)行膠回收，測定濃度。將回收后的酶切產(chǎn)物和線性化的pCMV-Myc載體通過ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit (C112) 進(jìn)行同源重組。插入片段與線性化載體摩爾比為2∶1，同源重組反應(yīng)體系為：線性化載體1 μL，目的片段3 μL，5×CE Ⅱ Buffer 2 μL，ExnaseⅡ 1 μL，ddH2O 3 μL。PCR儀中37 ℃連接30 min，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選菌落，PCR鑒定正確后送至北京擎科生物科技有限公司測序。測序正確后根據(jù)無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒說明書提取質(zhì)粒并測定濃度。將構(gòu)建完成的pCMV-Myc-ISG15質(zhì)粒按照Lipofectamine 3000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染說明轉(zhuǎn)染至HEK-293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染pCMV-Myc空載為對照組。轉(zhuǎn)染24 h收取細(xì)胞樣品進(jìn)行Western blotting檢測pCMV-Myc-ISG15質(zhì)粒的表達(dá)。

1.2.4 山羊ISG15基因的生物信息學(xué)分析 從NCBI-Uniport(https:∥www.uniprot.org)和GenBank兩個數(shù)據(jù)庫中獲得其他19個物種的ISG15序列(表1)，利用MegAlign和Mega 6.0軟件對ISG15基因核苷酸和氨基酸序列相似性比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行分析；同時利用在線軟件ProtParam (https:∥web.expasy.org/protparam/)對山羊ISG15理化性質(zhì)進(jìn)行分析；利用TMHMN Server v.2.0 (https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0) 和SignalP 5.0 (https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0)、NetNGlyc-1.0 (https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc-1.0)、YinOYang (https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php?YinO Yang-1.2)和NetPhos-3.1程序(https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1)預(yù)測山羊ISG15蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)、信號肽、N-糖基化、O-糖基化位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)；利用SPOMA(https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html) 和SWISS-MODEL軟件(https:∥swissmodel.expasy.org)預(yù)測山羊ISG15蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)；利用STRING軟件(https:∥cn.string-db.org)預(yù)測與山羊ISG15相互作用的蛋白；通過PredictProtein (http:∥predictprotein.org) 預(yù)測山羊ISG15蛋白的生物學(xué)功能；應(yīng)用在線軟件PSORT Ⅱ Prediction (http:∥psort.hgc.jp/form2.html) 預(yù)測山羊ISG15蛋白在細(xì)胞中的定位。

1.2.5 山羊ISG15蛋白在EEC細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位 將pCMV-Myc-ISG15質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至EEC細(xì)胞，36 h后進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)(indirect immunofluorescence assay,IFA)，檢測外源性ISG15的亞細(xì)胞定位。同時用小反芻獸疫病毒(PPRV)感染EEC細(xì)胞，36 h后進(jìn)行IFA，檢測內(nèi)源性ISG15的亞細(xì)胞定位。

表1 GenBank中不同物種ISG15基因序列信息

2 結(jié) 果

2.1 山羊ISG15基因的克隆、真核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)

以EEC細(xì)胞cDNA為模板擴(kuò)增山羊ISG15基因，獲得了474 bp的目的條帶(圖1A)，與預(yù)期結(jié)果相符?；厥誔CR產(chǎn)物連接至pCMV-Myc酶切后的空載體(圖1B)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行陽性克隆篩選，并將PCR鑒定正確的pCMV-Myc-ISG15質(zhì)粒送測序后，對比序列發(fā)現(xiàn)克隆的山羊ISG15與NCBI數(shù)據(jù)庫中預(yù)測的序列一致，且pCMV-Myc-ISG15質(zhì)粒構(gòu)建成功。將pCMV-Myc-ISG15質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK-293T細(xì)胞，24 h后收取細(xì)胞樣品，經(jīng)Western blotting鑒定發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的pCMV-Myc-ISG15質(zhì)粒成功表達(dá)，大小約為17 ku(圖1C)。

A，山羊ISG15基因CDS區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物：M1，DL2000 DNA Marker；1，ISG15基因擴(kuò)增產(chǎn)物；2，陰性對照。B，pCMV-Myc載體EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切圖：M2，DL5000 DNA Marker；1-2，pCMV-Myc空載EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切。C，山羊ISG15真核表達(dá)產(chǎn)物：M3，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，pCMV-Myc-ISG15質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物；2，pCMV-Myc質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物A，PCR amplification product of ISG15 gene CDS in goats：M1，DL2000 DNA Marker;1，ISG15 gene amplification product;2，Negative control.B，pCMV-Myc plasmid digested by EcoRⅠ和XhoⅠ：M2，DL5000 DNA Marker;1-2，pCMV-Myc empty EcoRⅠ and XhoⅠ double digest.C，Eukaryotic expression product of ISG15 in goats：M3，Protein Marker;1，Expression product of pCMV-Myc-ISG15 plasmid;2，Expression product of pCMV-Myc plasmid圖1 山羊ISG15基因擴(kuò)增及表達(dá)Fig.1 Amplification and expression of ISG15 gene in goats

2.2 相似性比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

2.2.1 相似性比對 核苷酸和氨基酸序列相似性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，山羊ISG15與盤羊核苷酸和氨基酸序列相似性最高，分別為99.2%和100%，與綿羊的相似性次之，分別為98.9%和99.4%，與小鼠的核苷酸和氨基酸序列相似性最低，分別僅有72.6%和62.8%，與人的核苷酸和氨基酸序列相似性分別為75.8%和65.2%(表2)。MegAlign分析20個物種ISG15的氨基酸保守性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同物種的ISG15序列長度不同，起始和終止位置也不相同，但末端均含有LRLRGG。與山羊ISG15相比，不同物種在不同位置氨基酸保守性有差異，在山羊ISG15的50-80位氨基酸區(qū)域突變較為集中。從整體上來看不同物種的ISG15序列具有多樣性。

2.2.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，山羊與綿羊和盤羊?qū)儆谝粋€分支，與奶牛、牦牛和水牛屬于一個大分支；羊駝、單峰駝和雙峰駝屬于一個小分支，人和獼猴屬于一個分支；大鼠和小鼠則屬于另一個分支。從進(jìn)化樹圖可以看出羊與牛類親緣性較近，與靈長類和嚙齒類親緣性較遠(yuǎn)(圖2)。

圖2 ISG15基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of ISG15 gene

2.3 生物信息學(xué)分析

2.3.1 理化性質(zhì)分析 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫預(yù)測發(fā)現(xiàn)，山羊ISG15基因位于16號染色體上，CDS全長474 bp，編碼區(qū)從第128位開始，止于601位，編碼157個氨基酸。ProtParam分析發(fā)現(xiàn)，ISG15蛋白分子質(zhì)量約為17.47 ku，等電點(diǎn)為6.83，分子式為C766H1252N216O299S10，由20種氨基酸組成，其中亮氨酸(Leu,L)有21個，含量最高，占13.4%，色氨酸(Trp,W) 含量最低，僅有1個，占0.6%；其中帶正電荷殘基(Asp+Glu)與帶負(fù)電荷殘基(Arg+Lys)數(shù)目相等，均為17(表3)。失穩(wěn)指數(shù)(instability index,II) 為41.73，由于該值>40，因此該蛋白歸為不穩(wěn)定蛋白。脂肪族指數(shù)(aliphatic index)為96.75。親水性平均值(grand average of hydropathicity,GRAVY) 為-0.148，該值<0，因此判斷山羊ISG15蛋白為親水性蛋白。

表3 山羊ISG15蛋白氨基酸組成

續(xù)表

2.3.2 跨膜結(jié)構(gòu)及信號肽預(yù)測 在線軟件TMHMN Server v.2.0和SignalP 5.0預(yù)測結(jié)果顯示，山羊ISG15蛋白沒有跨膜結(jié)構(gòu)(圖3A)，也沒有信號肽(圖3B)。

圖3 山羊ISG15蛋白跨膜結(jié)構(gòu)(A)及信號肽(B)預(yù)測Fig.3 Prediction of transmembrane structure (A) and signal peptide (B) of ISG15 protein in goats

2.3.3 糖基化和磷酸化位點(diǎn)預(yù)測 預(yù)測結(jié)果顯示，山羊ISG15蛋白存在1個潛在的N-糖基化位點(diǎn)，位于第77位氨基酸處(圖4A)；存在16個潛在的O-糖基化位點(diǎn)，分別位于第22、26、50、69、70、79、81、93、94、95、101、103、125、143、144和147位氨基酸處(圖4B)；存在10個潛在的磷酸化位點(diǎn)，其中包括6個絲氨酸位點(diǎn)(位于第22、69、93、94、95及105位氨基酸處)和4個蘇氨酸位點(diǎn)(分別位于第101、103、144及147位氨基酸處)(圖4C)，結(jié)果顯示該蛋白的磷酸化可能與蛋白激酶C (PKC)、肌酸激酶Ⅰ(CKⅠ)、DNA依賴性蛋白激酶 (DNAPK)、蛋白激酶A (PKA)、肌酸激酶Ⅱ(CKⅡ) 等有關(guān)。

圖4 山羊ISG15蛋白糖基化(A、B)和磷酸化位點(diǎn)(C)預(yù)測Fig.4 Prediction glycosylation (A and B) and phosphorylation (C) sites of ISG15 protein in goats

2.3.4 山羊ISG15蛋白二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)及互作蛋白預(yù)測 利用在線軟件SPOMA分析山羊ISG15的二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該蛋白由4種結(jié)構(gòu)組成，分別為無規(guī)則卷曲、延伸鏈、α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角，所占比例分別為34.39%、31.21%、21.66%和12.74%(圖5)。根據(jù)SWISS-MODEL分析得到的山羊ISG15的三級結(jié)構(gòu)與二級結(jié)構(gòu)相似，也是由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲和延伸鏈構(gòu)成(圖6)。與參考的綿羊ISG15模板相似性較高，達(dá)到了98.72%。利用STRING預(yù)測與山羊ISG15蛋白相互作用的蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)預(yù)測中的蛋白主要為干擾素和泛素化相關(guān)的蛋白。其中已經(jīng)試驗(yàn)證明與其相互作用的蛋白有泛素激活酶 (Ubiquitin-activating enzyme,UBA7)、USP18和DDX解旋酶58 (DEDA-box RNA helicase,DDX58)。預(yù)測ISG15還與抗黏液病毒1 (Myxovirus resistance protein 1,MX1)、抗黏液病毒2(Myxovirus resistance protein 2,MX2)、寡腺苷酸合成酶1 (2′,5′-oligoadenylate synthetase 1,OAS1)、干擾素調(diào)節(jié)因子7 (interferon regulatory factor 7,IRF7)、干擾素誘導(dǎo)蛋白6 (interferon-inducible protein 6,IFI6)、干擾素誘導(dǎo)蛋白44 (interferon-inducible protein 44,IFI44)相互作用 (圖7)。

h，α-螺旋；e，延伸鏈；c，無規(guī)則卷曲；t，β-轉(zhuǎn)角h，Alpha helix;e，Extended chain;c，Random coil;t，Beta turn圖5 山羊ISG15蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5 Secondary structure prediction of ISG15 protein in goats

圖6 山羊ISG15蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.6 Tertiary structure prediction of ISG15 protein in goats

圖7 山羊ISG15互作蛋白預(yù)測Fig.7 Prediction of proteins interacting with ISG15 in goats

2.3.5 蛋白功能預(yù)測 通過PredictProtein在線軟件預(yù)測和分析山羊ISG15蛋白的功能，發(fā)現(xiàn)ISG15可能對細(xì)菌和病毒具有防御作用，通過負(fù)向調(diào)節(jié)病毒基因組的復(fù)制來達(dá)到防御病毒的目的；負(fù)向調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)泛素化；正向調(diào)節(jié)紅細(xì)胞分化和造血過程；調(diào)節(jié)Ⅰ型干擾素和γ干擾素；調(diào)控白細(xì)胞介素10的產(chǎn)生；參與調(diào)節(jié)多種信號通路。

2.3.6 亞細(xì)胞定位預(yù)測 通過在線軟件Psort Ⅱ Prediction對山羊ISG15蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測發(fā)現(xiàn)，山羊ISG15主要定位在細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用，可能性約占69.6%。同時山羊ISG15還可能分布在細(xì)胞核、線粒體和分泌系統(tǒng)的囊泡中，并在其中發(fā)揮作用。

2.4 IFA檢測山羊ISG15蛋白在EEC細(xì)胞中的定位

通過IFA試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染ISG15后，該蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)(圖8A)。未用外源刺激物刺激，EEC細(xì)胞中無法檢測到ISG15，用外源刺激物(PPRV)感染后，EEC細(xì)胞中可以檢測到ISG15蛋白，并且也主要定位在細(xì)胞質(zhì)中(圖8B)。結(jié)果證實(shí)內(nèi)源性與外源性ISG15均定位于細(xì)胞質(zhì)中，此結(jié)果與軟件預(yù)測結(jié)果一致。

A，外源性ISG15蛋白在EEC細(xì)胞中的定位；B，內(nèi)源性ISG15蛋白在EEC細(xì)胞中的定位A，Localization of exogenous ISG15 protein in EEC cells;B，Localization of endogenous ISG15 protein in EEC cells圖8 山羊ISG15蛋白在EEC細(xì)胞中的定位(200×)Fig.8 Localization of ISG15 protein in EEC cells in goats (200×)

3 討 論

ISG15是宿主對微生物感染反應(yīng)的關(guān)鍵成分，本研究克隆了山羊ISG15的CDS區(qū)序列，通過氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)山羊和人該序列的相似性僅為65.2%，與盤羊相似性最高。以往的研究表明，某些哺乳動物和魚類之間，相似性僅為30%～35%，即使兩個不同的哺乳動物之間序列相似性也可能小于60%[16]。ISG15氨基酸的保守性分析發(fā)現(xiàn)，不同物種間ISG15長度不同，但在C-末端均含有LRLRGG序列，這對于翻譯后修飾蛋白質(zhì)至關(guān)重要。氨基酸序列差異性大，在山羊ISG15的50-80位氨基酸區(qū)域表現(xiàn)出明顯的序列變異。序列的差異性導(dǎo)致相似性高的物種之間ISG15的性質(zhì)也存在差異。魯海富等[17]報道的新疆野生盤羊ISG15為疏水性蛋白，且有一個跨膜區(qū)，本研究通過分析發(fā)現(xiàn)，山羊ISG15為親水性蛋白且沒有跨膜結(jié)構(gòu)。崔茹鵬等[18]報道的巴什拜羊ISG15基因編碼區(qū)全長為522 bp，比本研究克隆的山羊ISG15基因長了48 bp。蔡卓軒等[19]報道牛的ISG15基因編碼區(qū)為465 bp，比山羊的少了9 bp。序列的差異性會導(dǎo)致不同物種間ISG15的二級結(jié)構(gòu)存在差異。山羊ISG15二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲所占比例最多，約34.39%，β-轉(zhuǎn)角僅占12.74%，而在新疆野生盤羊中存在10個β-轉(zhuǎn)角[18]，在牛中β-轉(zhuǎn)角僅占17.53%[19]。

越來越多的證據(jù)表明，ISG15序列多樣性會影響其三級結(jié)構(gòu)，主要是保守的殘基在結(jié)構(gòu)域之間形成疏水界面，從而可能形成一系列的構(gòu)象。人和小鼠的ISG15蛋白的三級結(jié)構(gòu)整體構(gòu)象存在著巨大的差異，在人ISG15中Asp79的羧基與Thr101的羥基形成氫鍵，在ISG15的鉸鏈區(qū)形成一個扭結(jié)，但在小鼠ISG15中由于Ser77代替了Asp79，因此沒有此現(xiàn)象[20]。與綿羊ISG15相比，牛ISG15的鉸鏈區(qū)內(nèi)缺乏3個殘基導(dǎo)致牛ISG15在溶液中的穩(wěn)定性較低，這可能與2個Ubl結(jié)構(gòu)域的空間排列不同所致，后面研究證明牛ISG15兩個Ubl結(jié)構(gòu)域的扭曲方向完全不同[21]。因此解析綿羊ISG15的結(jié)構(gòu)對于驗(yàn)證這些鉸鏈區(qū)殘基對三級結(jié)構(gòu)的作用有著重要價值。

ISG15序列的多樣性可以影響其生物學(xué)功能。與犬、小鼠和牛等其他物種的ISG15相比，乙型流感的NS1蛋白能夠更有效地結(jié)合人和非人靈長類動物ISG15，這一發(fā)現(xiàn)表明，這可能是決定宿主易感性的主要因素[21]。這種現(xiàn)象同樣在內(nèi)羅病毒和冠狀病毒中存在。內(nèi)羅病毒的卵巢腫瘤家族蛋白(ovarian tumor family,OTU) 在體外與不同物種的ISG15相互作用不同[22]。冠狀病毒的木瓜酶樣蛋白酶(papain-like proteases,PLP) 與不同物種ISG15相互作用的能力上也有很大的差異，與人ISG15相比，小鼠ISG15的結(jié)合方向偏移了27°，蛋白酶結(jié)構(gòu)也發(fā)生了相應(yīng)的變化以適應(yīng)它。重要的是，它還反映了不同冠狀病毒之間已知宿主范圍的差異[20]。ISG15對人和小鼠的USP18影響不同，與小鼠ISG15相比，人ISG15與USP18結(jié)合更強(qiáng)。研究者認(rèn)為人和小鼠之間ISG15和USP18的序列差異是這種功能差異的根源[23]。蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測發(fā)現(xiàn)，山羊ISG15主要定位于細(xì)胞質(zhì)中(69.6%)，通過外源性轉(zhuǎn)染ISG15真核表達(dá)質(zhì)粒和PPRV感染刺激內(nèi)源性ISG15的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ISG15定位于細(xì)胞質(zhì)中，與預(yù)測結(jié)果相一致。同時本研究發(fā)現(xiàn)，未感染PPRV的EEC細(xì)胞中，通過IFA無法檢測到ISG15的表達(dá)，表明PPRV感染可以刺激ISG15的表達(dá)。很多研究發(fā)現(xiàn)ISG15能夠被病毒刺激上調(diào)表達(dá)，并發(fā)揮著其抗病毒作用[4,24]。該結(jié)果為后續(xù)研究ISG15在PPRV感染中的作用提供了基礎(chǔ)。

ISG15是介導(dǎo)和調(diào)節(jié)宿主對病毒感染反應(yīng)的重要組成部分。由于作用機(jī)理的差異，在不同病原體之間甚至在不同宿主物種之間的重要性有所不同。ISG15的序列和結(jié)構(gòu)多樣性增加了探索其在不同物種間作用的難度。不同物種間ISG15的生物信息學(xué)分析為后續(xù)的研究奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究成功克隆了山羊ISG15基因CDS區(qū)，全長474 bp，編碼157個氨基酸。氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)山羊與盤羊ISG15序列相似性最高；山羊ISG15蛋白沒有跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽區(qū)域，含有1個N-糖基化位點(diǎn)、16個O-糖基化位點(diǎn)和10個磷酸化位點(diǎn)；二級結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲和延伸鏈構(gòu)成；山羊ISG15蛋白可以與干擾素和泛素化相關(guān)蛋白相互作用；亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性和外源性ISG15均定位于EEC細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。