王治方，徐引弟,朱文豪，張青嫻，焦文強(qiáng)，李海利，王克領(lǐng)

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，鄭州 450002)

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis,Hps)是一種革蘭氏陰性、形態(tài)多變、NAD依賴(lài)型細(xì)小桿菌，可長(zhǎng)期寄生于豬的上呼吸道中，是當(dāng)前規(guī)?；i場(chǎng)主要的細(xì)菌性病原之一。當(dāng)機(jī)體抵抗力降低時(shí)，可感染不同年齡、品種的豬，臨床上斷奶前后和保育仔豬發(fā)病率、死亡率較高，主要表現(xiàn)為多發(fā)性纖維素性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎等病癥[1]。該病呈世界范圍內(nèi)流行，每年給養(yǎng)豬行業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

Hps致病機(jī)制非常復(fù)雜，臨床可單獨(dú)感染發(fā)病，更多是作為繼發(fā)病原與豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒、豬流感病毒等病原引發(fā)混合感染，加重病情和危害程度。其臨床血清型較多，已鑒定出15個(gè)血清型，還有20%左右的臨床菌株無(wú)法分型。Hps不同血清型的毒力及致病性存在較大差異，甚至同一血清型不同菌株的致病力也有一定差異，發(fā)病情況也不盡相同[2-3]。菌株毒力與其攜帶的毒力基因有密切關(guān)系。有資料表明，Hps血清1、5、10、13、14型為高毒力,2、4、15型為中等毒力,其他血清型劃分為無(wú)毒力[4-6]。但最近幾年，本實(shí)驗(yàn)室在臨床典型病例中不斷分離出Hps血清7型菌株，證明Hps血清7型在臨床感染率越來(lái)越高。為了解河南地區(qū)Hps血清7型流行菌株的相似性、毒力和耐藥性，本研究以Hps血清7型參考菌株為對(duì)照，對(duì)6株Hps血清7型臨床菌株進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增、測(cè)序分析、毒力基因檢測(cè)、致病性試驗(yàn)和藥敏試驗(yàn)研究，以期為Hps血清7型的流行病學(xué)研究及臨床防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 6株Hps血清7型受試菌株由本實(shí)驗(yàn)室臨床分離鑒定并保存，菌株信息見(jiàn)表1。Hps血清7型參考菌株，編號(hào)0007，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

表1 菌株信息

1.1.2 主要試劑及儀器 胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯(碧迪醫(yī)療器械(上海)有限公司)；犢牛血清、50×TAE 濃縮液瓊脂糖和DNA提取試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(輔酶Ⅰ，NAD)(Roche公司)；PremixTaqTM(TaKaRaTaqTMVersion 2.0 Plus Dye)、DL2000 DNA Marker、DNA提取試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)；藥敏片(杭州濱河微生物試劑有限公司)。

Thermo 5020 PCR擴(kuò)增儀、Thermo 1300SERIES A2生物安全柜(賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司)；電泳儀(DYY-6型) (北京市六一儀器廠)；凝膠成像系統(tǒng)(沙船(天津)生物科技發(fā)展有限公司)；5418臺(tái)式高速離心機(jī)(Eppendorf公司)。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 7周齡體重約250 g健康雄性豚鼠40只，購(gòu)自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方法

1.2.1 菌株DNA提取 將參考菌株和6株臨床菌株分別接種于TSA平板(含5%的犢牛血清，0.001% NAD)上，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)36 h，挑取典型菌落，按照DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)分別提取菌株的DNA，分裝備用。

1.2.2 菌株鑒定及序列分析 參照文獻(xiàn)[7-10]設(shè)計(jì)合成Hps 16S rRNA基因特異性引物和Hps血清7型引物，引物信息見(jiàn)表2。引物均由北京擎科生物科技有限公司合成。以提取的菌株DNA為模板，對(duì)受試菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。PCR反應(yīng)體系25 μL：2×PremixTaqTM13 μL，模板DNA 2 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O 8 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性1 min，退火(退火溫度見(jiàn)表2)1 min，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)完成后，取10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，紫外成像系統(tǒng)觀察結(jié)果、拍照。

表2 Hps 16S rRNA及血清7型引物信息

將菌株16S rRNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送北京擎科生物科技有限公司測(cè)序,利用DNAStar、Mega 6.0軟件將菌株16S rRNA基因測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取的相近的參考菌株基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。參考菌株信息見(jiàn)表3。

表3 參考菌株信息

續(xù)表

1.2.3 毒力基因檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[11-13]合成副豬嗜血桿菌相關(guān)毒力基因的引物，引物信息見(jiàn)表4。以提取的菌株DNA為模板，進(jìn)行菌株毒力基因PCR擴(kuò)增檢測(cè)，鑒定菌株攜帶毒力基因情況。PCR反應(yīng)體系25 μL：2×PremixTaq13 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 8 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性1 min，退火(退火溫度見(jiàn)表4)1 min，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。反應(yīng)完成后，取10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，紫外成像系統(tǒng)觀察結(jié)果、拍照。

表4 毒力基因引物信息

續(xù)表

1.2.4 致病性試驗(yàn) 將40只試驗(yàn)豚鼠隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，試驗(yàn)組7組，對(duì)照組1組，每組5只。挑選純化好的單個(gè)菌落接種于TSB(含5%的新生牛血清和0.001% NAD)液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)備用。調(diào)整菌液濃度至2.0×109CFU/mL，試驗(yàn)組豚鼠腹腔注射調(diào)整好的菌液0.5 mL/只；對(duì)照組豚鼠腹腔注射生理鹽水0.5 mL/只。接種后仔細(xì)觀察記錄每組發(fā)病情況，連續(xù)觀察10 d，對(duì)發(fā)病豚鼠進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散法對(duì)受試菌株和參考菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。將參考菌株和6株臨床菌株分別接種于TSA平板(含5%的犢牛血清，0.001% NAD)上，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，分別挑取各菌株的典型菌落，用滅菌PBS液制成濃度為0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙?，用滅菌棉簽蘸取?xì)菌懸液，均勻涂滿TSA平板(含5%的新生牛血清，0.001% NAD)表面；用滅菌鑷子夾取藥敏紙片均勻貼于TSA平板上，置于5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)36 h，測(cè)量抑菌圈直徑大小，參照藥敏片說(shuō)明書(shū)進(jìn)行結(jié)果判定，包括敏感、中介和耐藥。

2 結(jié) 果

2.1 菌株鑒定和分型鑒定

PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，參考菌株和6株臨床菌株均擴(kuò)增出1 090和490 bp 2條條帶，大小和Hps、Hps血清7型目的條帶一致(圖1)，表明6株菌株均為Hps，血清型為7型。

M，DL2000 DNA Marker；1、2,菌株0007；3、4,菌株1436；5、6,菌株1437；7、8,菌株1532；9、10,菌株1565；11、12,菌株1624；13、14，菌株1678;15、16，陰性對(duì)照M，DL2000 DNA Marker；1 and 2,Strain 0007；3 and 4,Strain 1436；5 and 6,Strain 1437；7 and 8,Strain 1532；9 and 10,Strain 1565；11 and 12,Strain 1624；13 and 14，Strain 1678;15 and 16，Negative control圖1 菌株血清型PCR鑒定Fig.1 Identification of serotype of strains by PCR

利用Mega 6.0軟件，將受試菌株16S rRNA基因測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取的相近的基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，受試菌株與參考菌株0007核苷酸相似性在98.6%以上，與其他參考菌株核苷酸相似性在97.7%以上。菌株1436 與參考菌株0007核苷酸相似性最高，達(dá)100%；菌株1624與菌株1678核苷酸相似性最低，為97.7%。

圖2 菌株16S rRNA基因核苷酸序列相似性分析Fig.2 Similarity analysis of the 16S rRNA gene nucleotide sequence of strains

由16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可知，菌株1624與其他菌株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，單獨(dú)構(gòu)成一個(gè)分支；菌株1436、1437、1532、1565、1678和參考菌株0007及參考菌株在同一個(gè)大分支中，菌株1436與參考菌株0007親緣關(guān)系最近；菌株1437、1532與參考菌株0007在一個(gè)小分支中，親緣關(guān)系較近；菌株1565和1678親緣關(guān)系較近，這2菌株分別與西班牙的CD7-3、CD8-1株親緣關(guān)系近(圖3)。說(shuō)明，同一血清型不同菌株親緣關(guān)系存在一定差異性。

圖3 基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence

2.2 毒力基因測(cè)定結(jié)果

通過(guò)毒力基因PCR擴(kuò)增，臨床菌株和參考菌株檢測(cè)出了vta1、vta2、vta3、wza、nanH、ompP2、cdtA、cdtB、cdtC和espP2毒力基因(圖4)，其中臨床菌株1565和參考菌株0007毒力基因型一致，為vta1+vta2+vta3+wza+nanH+cdtA+cdtB+cdtC+espP2+；另外5株臨床菌株毒力基因型一致，為vta1+vta2+vta3+wza+ompP2+nanH+cdtA+cdtB+cdtC+espP2+(表5)。

M,DL2000 DNA Marker；1～13,capd、vta1、vta2、vta3、wza、hhdA、hhdB、ompP2、nanH、cdtA、cdtB、cdtC和espP2基因M,DL2000 DNA Marker；1-13, capd,vta1,vta2,vta3,wza,hhdA,hhdB,ompP2,nanH,cdtA,cdtB,cdtC and espP2 genes,respectively圖4 毒力基因PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.4 PCR results of virulence genes

表5 毒力基因檢測(cè)結(jié)果

2.3 致病性試驗(yàn)結(jié)果

由表6可知，接種后，參考菌株0007組5只豚鼠均未表現(xiàn)任何臨床癥狀，生長(zhǎng)狀態(tài)良好；1436株、1437株、1532株、1678株組均有1只出現(xiàn)被毛粗亂、反應(yīng)遲鈍、蜷縮發(fā)抖等癥狀，未發(fā)生死亡。1565株、1624株組有2只出現(xiàn)癥狀，未發(fā)生死亡；生理鹽水對(duì)照組未出現(xiàn)任何癥狀；至試驗(yàn)結(jié)束后對(duì)發(fā)病豚鼠剖檢，可見(jiàn)腹腔內(nèi)有腹水、纖維素性滲出，程度不一。用心臟血液、肝臟觸片，革蘭氏染色鏡檢，均發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性、長(zhǎng)短不一的細(xì)絲狀菌體。無(wú)菌采集試驗(yàn)組發(fā)病豚鼠的心臟血液、肝臟接種TSA平板(含5%的新生牛血清，0.001%的NAD)，37 ℃培養(yǎng)30 h后，分離獲得和接種菌株相一致的單一細(xì)菌。

表6 致病性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

選用18種常用抗菌藥對(duì)參考菌株和受試菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表7。參考菌株和臨床菌株表現(xiàn)出不同的耐藥譜，均表現(xiàn)出多重耐藥。所有菌株對(duì)頭孢他啶和頭孢噻呋敏感性好，只有1株臨床菌株對(duì)頭孢噻呋表現(xiàn)為中介；對(duì)強(qiáng)力霉素、氟苯尼考、氧氟沙星、恩諾沙星敏感性較好,分別有1～3株表現(xiàn)為中介或耐藥；對(duì)青霉素、氨芐西林、阿莫西林、卡那霉素、紅霉素、土霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星敏感性差，均有3株以上菌株表現(xiàn)為中介或耐藥；對(duì)新霉素、阿米卡星、替米考星敏感性最差，無(wú)菌株表現(xiàn)為敏感。

表7 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

副豬嗜血桿菌病是養(yǎng)豬行業(yè)的重要細(xì)菌性病原之一，可單一病原感染發(fā)病，更多是作為繼發(fā)病原感染豬群，引起混合感染，給養(yǎng)豬行業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[14]。Hps臨床血清型較多，不同血清型菌株的毒力及致病性不同，臨床感染發(fā)病情況也不盡相同。河南地區(qū)主要流行菌株為4、5、13和7型[15]，4、5和13型相關(guān)報(bào)道也較多，而先前普遍認(rèn)為血清7型菌株為無(wú)毒力菌株，相關(guān)報(bào)道較少。近年來(lái)，Hps血清7型在臨床病例中分離率明顯增多，可能與Hps血清7型菌株在臨床自然進(jìn)化過(guò)程中菌株毒力增強(qiáng)有關(guān)。本試驗(yàn)以Hps血清7型參考菌株為對(duì)照，對(duì)河南地區(qū)6株Hps血清7型臨床菌株進(jìn)行分型鑒定、相似性分析、毒力基因、藥敏試驗(yàn)及豚鼠致病性研究，與參考菌株相比，臨床菌株在毒力基因、耐藥表型方面均表型出一定的差異。分析可能是臨床菌株受自然環(huán)境和宿主體內(nèi)某些變化影響，導(dǎo)致菌株在宿主體內(nèi)感染過(guò)程中個(gè)別毒力基因表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)或下調(diào)；同時(shí)由于國(guó)內(nèi)抗生素使用不規(guī)范，同一血清型不同菌株在不同豬場(chǎng)受到抗生素選擇壓力差異較大，導(dǎo)致同一血清的不同菌株臨床耐藥表型出現(xiàn)一定的差異。

通過(guò)16S rRNA基因序列相似性比對(duì)及發(fā)育樹(shù)構(gòu)建發(fā)現(xiàn)，6株Hps血清7型菌株與參考菌株相似性及親緣關(guān)系表現(xiàn)出有一定的差異性，其中菌株1436與參考菌株相似性達(dá)100%，親緣關(guān)系最近；菌株1624與參考菌株的相似性為98.6%，親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。這充分說(shuō)明同一血清型同一地域分離的菌株也存在一定的差異性。

Hps的致病過(guò)程包括感染黏附、侵入宿主、逃避宿主的防御機(jī)制、在宿主體內(nèi)繁殖并對(duì)組織產(chǎn)生損傷。該過(guò)程是菌體攜帶所有毒力基因協(xié)同參與的復(fù)雜過(guò)程，每個(gè)或每類(lèi)毒力基因功能作用尚未研究清楚。本試驗(yàn)篩選檢測(cè)的13個(gè)毒力基因是Hps的部分致病關(guān)鍵因子。capd基因編碼一種多糖合成蛋白，與菌體莢膜的生物學(xué)功能有關(guān)。vta1、vta2、vta3屬于三聚體自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，與病原體逃避宿主免疫系統(tǒng)監(jiān)視密切關(guān)系[16-18]。wza是與Hps莢膜多糖輸出蛋白相關(guān)的基因，在菌株莢膜多糖轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中起重要作用，與菌體黏附和抗吞噬方面有重要關(guān)聯(lián)。神經(jīng)轉(zhuǎn)氨酶nanH基因與細(xì)菌的氧化耐受能力有關(guān)，在細(xì)菌感染宿主過(guò)程重要作用。hhdA、hhdB基因是溶血素修飾蛋白基因，主要參與溶血素的分泌與修飾[16-17]。cdtA、cdtB、cdtC是細(xì)胞膨脹毒素，誘導(dǎo)細(xì)胞膨脹、細(xì)胞核擴(kuò)大并最終凋亡，是Hps菌株直接發(fā)揮細(xì)胞毒性的重要武器。ompP2是一種孔蛋白，在Hps外膜中含量最多，與細(xì)菌抗吞噬、抗補(bǔ)體介導(dǎo)的血清殺菌作用有關(guān)。胞外絲氨酸蛋白酶espP2基因?qū)儆谧赞D(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，與細(xì)菌的黏附、入侵和細(xì)胞毒性有關(guān)，可介導(dǎo)生物被膜形成和血清抗性的產(chǎn)生等[18]。6株Hps血清7型共檢測(cè)出2種毒力基因型，其中1株臨床菌株與參考菌株相同，為vta1+vta2+vta3+wza+nanH+cdtA+cdtB+cdtC+espP2+；另外5株臨床菌株毒力基因型相同，為vta1+vta2+vta3+wza+ompP2+nanH+cdtA+cdtB+cdtC+espP2+。該結(jié)果與張青嫻等[19]報(bào)道有一定差異。臨床菌株ompP2基因表達(dá)出現(xiàn)明顯上調(diào)，該基因主要與細(xì)菌抗吞噬、抗補(bǔ)體介導(dǎo)的血清殺菌有關(guān)，這可能與近年來(lái)Hps血清7型臨床分離率增多有一定關(guān)聯(lián)。6株臨床菌株均分離于典型病例，說(shuō)明菌株具有一定的致病性；豚鼠致病性試驗(yàn)也表明，6株臨床菌株均可感染豚鼠發(fā)病，發(fā)病率為20%～40%，但死亡率為0。與張青嫻等[20]報(bào)道Hps血清5型攜帶14個(gè)毒力基因，感染豚鼠發(fā)病率80%，死亡率40%比較，Hps血清7型對(duì)豚鼠有一定的致病性，但毒力明顯較弱，與陶偉杰等[21]試驗(yàn)結(jié)果基本一致。毒力基因檢測(cè)結(jié)合致病性試驗(yàn)，攜帶10種毒力基因的菌株與攜帶9種毒力基因的菌株相比，在致病性上沒(méi)有明顯差異，說(shuō)明Hps的致病性不是毒力基因簡(jiǎn)單的累加，而是多個(gè)毒力基因協(xié)同參與復(fù)雜的動(dòng)態(tài)結(jié)果，除本次檢測(cè)的毒力基因外，可能還有其他毒力基因參與，同時(shí)細(xì)菌毒力基因在感染過(guò)程中啟動(dòng)表達(dá)會(huì)有一定差異，致病表型也會(huì)出現(xiàn)差異。毒力表型與毒力基因型有一定的相關(guān)性，但不完全一致，致病機(jī)制十分復(fù)雜，需更多試驗(yàn)進(jìn)行深入研究。

抗生素仍是當(dāng)前防控副豬嗜血桿菌病的有效途徑，但由于養(yǎng)殖過(guò)程中抗生素長(zhǎng)期濫用或不規(guī)范使用，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性越來(lái)越嚴(yán)重，使得藥物抗菌效果越來(lái)越差。從藥敏試驗(yàn)結(jié)果可看出，菌株1678與參考菌株0007耐藥譜相近外，其他菌株耐藥譜均有一定差異?？傮w來(lái)說(shuō)，參考菌株和臨床菌株均對(duì)頭孢他啶和頭孢噻呋敏感性好，這與史開(kāi)志等[22]報(bào)道結(jié)果較一致；而對(duì)青霉素、氨芐西林等β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物敏感性差，這與陶偉杰等[21]和田昊倫等[23]結(jié)果一致，而與Miani等[24]、鄧同煒等[25]報(bào)道結(jié)果不同；對(duì)氟苯尼考敏感性較好，這與田昊倫等[23]、Zhao等[26]結(jié)果一致。受試菌株對(duì)氨基糖苷類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)敏感性最差。此外，參考菌株和臨床菌株均表現(xiàn)出耐3種以上藥物的多重耐藥現(xiàn)象。因此，生產(chǎn)實(shí)踐中對(duì)臨床分離菌株進(jìn)行及時(shí)、準(zhǔn)確的耐藥性檢測(cè)，篩選敏感藥物，對(duì)防治該病具有重要意義。

4 結(jié) 論

Hps血清7型臨床菌株和參考菌株表現(xiàn)出2種毒力基因型，臨床菌株較參考菌株毒力有一定的增強(qiáng)，可引起20%～40%豚鼠感染發(fā)病，表現(xiàn)一定的臨床癥狀，但不能致死豚鼠。臨床菌株和參考菌株均對(duì)頭孢他啶和頭孢噻呋敏感性好；對(duì)強(qiáng)力霉素、氟苯尼考敏感性較好；但對(duì)新霉素、阿米卡星、卡那霉素、紅霉素、替米考星耐藥性較強(qiáng)，且均表現(xiàn)明顯的多重耐藥現(xiàn)象。該研究為Hps血清7型流行病學(xué)、致病機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)，為Hps血清7型的臨床防控提供了參考依據(jù)。