翟新國，鄭培培，蘇金輝，李慶陽，焦賀靜，張若冰，李朋輝，

(1.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院,邯鄲 056038;2.河北大北農(nóng)農(nóng)牧食品有限公司,衡水 053900)

豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)屬于冠狀病毒科(Coronaviridae)病毒大家族[1]。PEDV是一種單股正鏈具有囊膜的RNA病毒，基因組長約28 000 bp[1-2]。PEDV基因組編碼3個非結(jié)構(gòu)蛋白(復(fù)制酶1a、復(fù)制酶1b 以及附屬蛋白(ORF3))和4個結(jié)構(gòu)蛋白(刺突糖蛋白(S)、囊膜蛋白(E)、核衣殼蛋白(N)和膜蛋白(M))[3-5]。在所有PEDV蛋白中，S蛋白主要參與病毒吸附和入侵，決定病毒的毒力和細胞嗜性，并誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體，在分子流行病學(xué)上具有重要意義[6-10]。PEDV感染各年齡段豬均可導(dǎo)致豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea，PED)，但仔豬往往更為嚴重，表現(xiàn)為厭食，嘔吐，腸絨毛萎縮，水樣腹瀉，惡性脫水，體重減輕，病死率極高(最高可達100%)[11-13]。1971年英國報道首例PED疫情，但PEDV卻直到1977年才被比利時科學(xué)家首次鑒定出來，命名為CV777株[13-15]，隨后PEDV廣泛傳播至歐洲和亞洲諸多生豬養(yǎng)殖國家[16]。1984年，中國學(xué)者利用免疫熒光試驗和血清中和試驗首次證實PEDV在中國的存在[17]。由于中國廣泛使用傳染性胃腸炎(transmissible gastroenteritis，TGE)和PED的腹瀉二聯(lián)疫苗，PED疫情一直維持在較低水平[16,18]。2008—2010年間，韓國和中國暴發(fā)了由高毒力變異型PEDV毒株引起的PED，隨后疫情迅速席卷亞洲、北美洲和歐洲，對全球養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的損失[19-20]。為更好防控變異型PEDV毒株，中國基于AJ1102和LW/L毒株研發(fā)并上市兩款新的變異毒株疫苗。盡管如此，近些年P(guān)ED仍是中國最常見危害性最大的豬病之一。Tian等[19]報道2014—2018年四川省和貴州省有47.66%的豬場呈PEDV陽性，對52株P(guān)EDVS基因進行遺傳變異分析，發(fā)現(xiàn)變異型PEDV達82.7%。Cui等[16]報道2015—2019年許多河南省和山西省的經(jīng)典弱毒疫苗免疫的豬場仍會暴發(fā)腹瀉，PEDV陽性率為63.7%，對32株P(guān)EDVS基因進行遺傳變異分析，發(fā)現(xiàn)其均屬于變異型PEDV。因此，變異PEDV毒株已經(jīng)發(fā)展為流行并循環(huán)于中國豬場的最主要毒株[15-16,19]。作為一種重要的豬冠狀病毒，PEDV仍在不斷進化和變異，免疫逃逸能力和傳染性在不斷加強，中國PEDV已呈現(xiàn)出較強的流行性和基因異質(zhì)性，亟需加強對PEDV毒株的遺傳變異監(jiān)測并發(fā)展更有效的防控方案[19]。

2020年底，河北省某大型豬場暴發(fā)PED，大量新生仔豬水樣腹瀉，迅速死亡，損失慘重。為了了解河北地區(qū)遺傳變異情況，掌握本地區(qū)PEDV的流行情況，本研究對該豬場病仔豬進行檢測，成功獲得1株P(guān)EDV全基因組序列，并進行了遺傳變異和重組分析，以期了解該PEDV毒株的遺傳進化和重組規(guī)律，為PEDV疫苗的研制和該病的合理防控提供新思路和理論依據(jù)，也為進一步研究PEDV的致病機制以及病毒與宿主的相互作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

急性仔豬腹瀉樣品于2020年底采集于河北某大型種豬場，產(chǎn)房內(nèi)出生仔豬水樣腹瀉，無菌條件下采集3份瀕死仔豬新鮮小腸組織，利用無菌生理鹽水沖洗，剪取約1 g組織，充分剪碎并放入滅菌2 mL EP管中，加入1 mL無菌PBS，再加入2～4粒滅菌玻璃勻漿珠，提前30 min預(yù)冷組織研磨儀的適配器，按照標準研磨程序，將小腸組織研磨成組織懸液，在4 ℃下，10 000×g離心3 min，取上清于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

離心柱法DNA/RNA提取試劑盒購自IDEXX公司；瓊脂糖購自BIOWEST公司；DL5000 DNA Marker、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞和pMD18-T Vector均購自TaKaRa公司；快速PCR試劑盒(1.1×T3 Super PCR Mix)購自北京擎科生物技術(shù)有限公司；TIANprep Mini Plasmid Kit和TIANgel Midi Purification Kit均購自天根生化科技(北京)有限公司；TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 引物與探針

基于LW/L(MK392335.1)、USA/Colorado/2013(KF272920.1)、S14(MH891585.1)、PEDV-WS(KM609213.1)、PEDV 1842/2016 ITA(KY111278.1)、SD2014(KX064280.1)、JSX2014(MH056658.1)、GD-A(JX112709.1)、CH/S(JN547228.1)、CH/HNYF/14(KP890336.1)、BJ-2011-1株(JN825712.1)和AJ1102(JX188454.1)等設(shè)計PEDV引物，分別為：PEDV-5′-F：ACTTAAA-AAGATTTTCTATCTACGGATAGTTAGCTC；PEDV-3′-R：GTGTATCCATATCAACACC；用于擴增PEDV基因組內(nèi)部序列的引物參考文獻[21]，引物由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 總RNA提取與RT-PCR擴增

參考翟新國等[22]方法進行總RNA提取和RT-PCR。取適量腸組織研磨液上清按照核酸提取試劑盒說明書提取總RNA；取950 ng總RNA按照TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix說明書(AT301)合成cDNA；以cDNA為模板參照1.1×T3 Super PCR Mix說明書進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系25 μL：1.1×T3 Super PCR Mix 20 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，cDNA模板1 μL，補ddH2O至25 μL。PCR反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性10 s，56 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，共31個循環(huán)；72 ℃延伸2.5 min。

1.5 序列測定與基因組拼接

將獲得的各PEDV基因片段的RT-PCR產(chǎn)物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，按照TIANgel Midi Purification Kit說明書對各PEDV片段進行切膠純化，送北京擎科生物技術(shù)有限公司測序；利用DNAStar軟件對測序結(jié)果進行拼接和整理，組裝成完整的PEDV基因組。

1.6 遺傳變異和重組分析

從GenBank中選取20條PEDV基因組序列作為參考序列(表1)，利用DNAStar軟件對所獲的PEDV毒株基因組和S基因序列與參考毒株相應(yīng)序列進行相似性分析；利用NCBI在線BLAST程序?qū)λ@得的PEDV毒株基因組與參考毒株SNJ-P株進行核苷酸變異性比對；利用Mega X 10.0.5軟件對所獲的PEDV毒株基因組和S基因序列與參考毒株相應(yīng)序列進行擬合對比和最大似然法(ML)遺傳進化分析[23]；利用RDP4軟件對所獲的PEDV毒株基因組序列與參考毒株基因組序列進行重組分析[24-25]。

表1 參考毒株信息

2 結(jié) 果

2.1 PEDV基因組擴增與測序

RT-PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，產(chǎn)生1條清晰條帶，大小約1 816 bp(圖1)，說明小腸病料為PEDV陽性，將該毒株命名為HB/HEBEU/2020。成功克隆了覆蓋PEDV全基因組的目的片段，經(jīng)測序和拼接，獲得HB/HEBEU/2020全基因組序列，并提交GenBank，獲得的登錄號為：MW413556。

M，DL5000 DNA Marker；1～3，樣本M，DL5000 DNA Marker；1-3，Samples圖1 PEDV基因組RT-PCR擴增結(jié)果Fig.1 RT-PCR amplification results of PEDV genome

2.2 HB/HEBEU/2020基因組相似性分析

由表2可知，HB/HEBEU/2020基因組全長28 038 bp，其中5′-非編碼區(qū)(UTR)的1—36 bp和3′-UTR的28 020—28 038 bp為引物序列，其余27 983 bp均為本研究測序所得。HB/HEBEU/2020基因組編碼區(qū)全長27 412 bp，含有7個開放閱讀框，從5′到3′依次為復(fù)制酶1a基因(12 309 bp)、復(fù)制酶1b基因(8 037 bp)、S基因(4 161 bp)、ORF3基因(675 bp)、E基因(231 bp)、M基因(681 bp)和N基因(1 326 bp)。與SNJ-P株(MK702008.1)相比，HB/HEBEU/2020基因組包含207個核苷酸點突變，但不存在插入或者缺失。由圖2可知，HB/HEBEU/2020與PEDV流行株株的相似性在96.5%～99.3%之間，HB/HEBEU/2020株與分離自中國的SNJ-P株相似性最高，為99.3%，SD2014、USA/Colorado/2013、BJ-2011-1、S14、HB2018、CH/HLJ/18、PEDV-YZ、GER/L03208/2019、AJ1102、CH/HNYF/14、GD-XL-2019和LW/L與HB/HEBEU/2020相似性均>97.5%，SC1402與HB/HEBEU/2020相似性為96.6%；virulent DR13、CH/S和JS2008與HB/HEBEU/2020相似性分別為97.3%、97.0%和96.7%。在所有市售疫苗株中，變異疫苗株AJ1102與HB/HEBEU/2020相似性最高，為98.3%，其次是變異疫苗株LW/L，與HB/HEBEU/2020相似性為97.8%；經(jīng)典疫苗株attenuated CV777和CV777則與HB/HEBEU/2020的相似性稍低，均為96.5%。

表2 HB/HEBEU/2020株與SNJ-P株基因組的變異性比對

五角星表示本研究的目標毒株；黑圓表示疫苗毒株。下同Pentagram represents the target strain of this study;The black circles represent vaccine strains.The same as below圖2 HB/HEBEU/2020全基因組與各PEDV參考毒株的相似性比對Fig.2 Similarity alignment of whole genome of HB/HEBEU/2020 and the PEDV reference strains

2.3 HB/HEBEU/2020 S基因相似性分析

通過對HB/HEBEU/2020全基因組測序結(jié)果進行分析，可知其S基因全長4 161 bp，編碼1 386個氨基酸。由圖3可知，HB/HEBEU/2020S基因與比利時CV777標準株的相似性為93.5%，共存在248個核苷酸突變，在167 bp處存在G插入，在175—185 bp處存在CAGGGTGTTAA插入，在416—418 bp處存在ATA插入，在475—480 bp處存在CGTGAT缺失，推導(dǎo)的氨基酸相似性為92.8%，共存在93個氨基酸突變，在56—59和140位氨基酸處分別存在GENQ和N插入，在163—164位氨基酸處存在DI缺失。HB/HEBEU/2020S基因與所選參考株相似性在93.2%～98.8%之間，其中與HB2018的相似性最高，為98.8%。HB2018、CH/HLJ/18、GER/L03208/2019、CH/HNYF/14、GD-XL-2019、S14、USA/Colorado/2013、AJ1102、SNJ-P、SD2014、BJ-2011-1、LW/L、PEDV YZ株S基因與HB/HEBEU/2020相似性均超過95.5%，SC1402相似性為93.3%。變異疫苗株AJ1102和LW/LS基因與HB/HEBEU/2020相似性分別為97.3%和96.9%，相比之下，經(jīng)典疫苗株attenuated CV777和CV777則與HB/HEBEU/2020的相似性稍低，分別為93.3%和93.5%。

圖3 HB/HEBEU/2020 S基因與各PEDV參考毒株的相似性對比Fig.3 Similarity alignment of S gene of HB/HEBEU/2020 and the PEDV reference strains

2.4 HB/HEBEU/2020基因組遺傳進化分析

由圖4可知，21株P(guān)EDV毒株進化形成了G1群和G2群，G1群包含G1a和G1b亞群，G1a亞群以經(jīng)典株CV777為代表，還包含virulent DR13和CH/S，G1b亞群以JS2008為代表，還包含attenuated DR13、SC1402和attenuated CV777毒株；G2群包含G2a和G2b亞群，G2a亞群以變異株BJ-2011-1為代表，還包括SNJ-P、SD2014、USA/Colorado/2013、S14、HB2018和CH/HLJ/18等毒株，G2b亞群以變異株AJ1102為代表，還包括GD-XL-2019和LW/L毒株。HB/HEBEU/2020屬于G2a群，該群中所有14株P(guān)EDV均分離于2010年之后，包括11株中國株SNJ-P、SD2014、BJ-2011-1、HB2018、CH/HLJ/18、PEDV-YZ、AJ1102、CH/HNYF/14、HB/HEBEU/2020、GD-XL-2019和LW/L，1株美國株USA/Colorado/2013，1株韓國株S14和1株德國株GER/L03208/2019。HB/HEBEU/2020與市售的經(jīng)典疫苗株attenuated CV777和CV777遺傳距離(親緣關(guān)系)較遠，而與變異疫苗株AJ1102和LW/L遺傳距離較近。

圖4 HB/HEBEU/2020基因組遺傳進化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of whole genome of HB/HEBEU/2020

2.5 HB/HEBEU/2020 S基因遺傳進化分析

由圖5可知，S基因遺傳進化分析結(jié)果與全基因組結(jié)果基本一致，HB/HEBEU/2020S基因與6株中國株P(guān)EDV-YZ、BJ-2011-1、CH/HLJ/18、HB2018、SD2014和CH/HNYF/14，1株美國株USA/Colorado/2013和1株韓國株S14均屬于G2a亞群，其中與HB2018的遺傳距離最近，具有共同的起源，而AJ1102與SNJ-P、LW/L和GD-XL-2019形成了G2b亞群，CV777與CH/S、virulent DR13、attenuated DR13和GER/L03208/2019形成了G1a亞群，JS2008與attenuated DR13、attenuated CV777和SC1402形成了G1b亞群。值得關(guān)注的是，基于S基因遺傳進化分析，德國株GER/L03208/2019和中國株CH/HNYF/14雖分別被劃為G1a亞群和G2a亞群，但其S基因在遺傳上實際處于G1和G2群之間。2株P(guān)EDVS基因更接近G1和G2群共同的始祖株。HB/HEBEU/2020S基因與市售的經(jīng)典疫苗株attenuated CV777株和CV777遺傳距離(親緣關(guān)系)較遠，而與變異疫苗株AJ1102和LW/L遺傳距離較近。

2.6 HB/HEBEU/2020基因組重組分析

為了解HB/HEBEU/2020潛在基因重組情況，基于圖4 PEDV遺傳系譜，選擇11株具有代表性的PEDV毒株(SNJ-P、AJ1102、LW/L、CH/HNYF/14、BJ-2011-1、SD2014、PEDV-YZ、GD-XL-2019、HB2018、attenuated CV777和SC1402)進行基因組重組分析。由表3可知，HB/HEBEU/2020基因組存在3個潛在重組事件，根據(jù)重組事件發(fā)生的概率，事件1、2均至少有5種重組檢測方法呈陽性，發(fā)生概率較高。重組事件1主要親本可基于G2a群的SD2014進行推導(dǎo)，次要親本為G2a群的SNJ-P，重組斷點為15 918—22 119 bp(ORF1b-S基因部分區(qū)域)；重組事件2主要親本為G2a群的HB2018，次要親本為G1b群的SC1402，重組斷點為100—734 bp(5′-UTR-ORF1a基因部分區(qū)域)，發(fā)生在G1群和G2群之間；重組事件3，發(fā)生概率較低(所有7種重組檢測方法中2種呈陽性，重組斷點為2 214—2 729 bp(5′-UTR基因部分區(qū)域)，主要親本為G2a群的SNJ-P，次要親本可基于G1b群的經(jīng)典疫苗株attenuated CV777進行推導(dǎo)。

圖5 HB/HEBEU/2020 S基因遺傳進化分析Fig.5 Phylogenetic analysis of S gene of HB/HEBEU/2020

表3 HB/HEBEU/2020株基因組的重組分析

3 討 論

PEDV是威脅全球養(yǎng)豬業(yè)的一種重要冠狀病毒，2010年后，中國的流行毒株以變異型PEDV毒株為主，許多已免疫的豬場紛紛發(fā)病，仔豬死亡率極高，損失巨大[26]。目前，PEDV仍在不斷流行和進化，然而近2年具有代表性的PEDV毒株全基因組遺傳信息卻十分匱乏。2020年底，河北某大型豬場暴發(fā)PED，本研究采集病料成功擴增并獲得1株突變型PEDV HB/HEBEU/2020全基因組序列，并進行了遺傳變異和重組分析。

HB/HEBEU/2020屬于PEDV突變株，在相似性和遺傳進化上與當(dāng)前主要的商業(yè)化傳統(tǒng)疫苗株存在差異。雖然基于PEDV基因組和S基因相似性分析結(jié)果略有不同，HB/HEBEU/2020與以BJ-2011-1、USA/Colorado/2013、HB2018、S14和SD2014等為代表的分離于2010年后的PEDV毒株相似性均較高。本研究選擇了ML法進行遺傳進化分析。利用ML法進行遺傳進化分析雖然耗時長，但卻往往能反應(yīng)真實的情況，結(jié)果更為準確[27-28]。本研究發(fā)現(xiàn)，不論是全基因組遺傳進化分析還是S基因遺傳進化分析，PEDV均呈現(xiàn)兩種不同的進化路徑，形成了G1群和G2群，G1群可進一步分化為G1a亞群和G1b亞群，G2群可進一步分化為G2a亞群和G2b亞群，該結(jié)果與Wang等[26]的研究結(jié)果一致。德國株GER/L03208/2019在全基因組遺傳進化分析和S基因遺傳進化分析中呈現(xiàn)不同的結(jié)果，但在遺傳上都處于G1a群和G2a群之間，親緣關(guān)系更接近于G1群和G2群共同的始祖株。與GER/L03208/2019類似，CH/HNYF/14在遺傳上也更接近于G1群和G2群共同的始祖株。相比其他甲型冠狀病毒，如豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)和人冠狀病毒229E株等，一種高頭蝠冠狀病毒512/2005株(Scotophilusbat coronavirus，BtCoV)與PEDV原型株CV777的親緣性更高，說明CV777與BtCoV存在共同祖先，冠狀病毒可能在豬和蝙蝠之間存在跨物種傳播[29]。HB/HEBEU/2020屬于G2a群，與PEDV原型株CV777(G1a亞群)的遺傳距離較遠，因此HB/HEBEU/2020的進化方向與高頭蝠來源的BtCoV關(guān)系不大。目前，以CV777為基礎(chǔ)的經(jīng)典株P(guān)EDV疫苗在中國市場占有較大份額，本研究提示這些經(jīng)典疫苗可能很難對HB/HEBEU/2020提供有效的保護。在所有市售疫苗株中，AJ1102(G2b亞群)與HB/HEBEU/2020遺傳距離最近，同屬于G2群，這提示AJ1102 與HB/HEBEU/2020可能進化于同一個祖先毒株。由于AJ1102與HB/HEBEU/2020相似性達98.3%，并且目前尚無以G2b亞群毒株開發(fā)的商品化PEDV疫苗，本研究結(jié)果表明現(xiàn)階段選擇以AJ1102毒株為基礎(chǔ)的PEDV疫苗并制定免疫計劃將有助于對HB/HEBEU/2020的防控。近年來，中國頻頻發(fā)生G2b亞群PEDV變異毒株感染疫情[22,26]，損失慘重，建議中國及早布局G2b亞群PEDV毒株疫苗研發(fā)計劃以應(yīng)對PEDV疫情。

PEDV仍在不斷進化，HB/HEBEU/2020已經(jīng)進化為跨G1和G2群的重組變異株。以冠狀病毒為代表的RNA病毒通過點突變積累和同源重組進化有利于基因損傷修復(fù)、組織嗜性和宿主范圍改變，進而增強環(huán)境適應(yīng)性[22,30-33]。本研究發(fā)現(xiàn)，HB/HEBEU/2020存在3個潛在的重組事件，其中重組事件1和2均至少有5種檢測方法驗證呈陽性，說明發(fā)生概率較大。翟新國等[22]研究發(fā)現(xiàn)PEDV G1群和G2群毒株S1基因可能存在重組事件。在本研究中，重組事件2和3證明PEDV G1b亞群和G2a亞群基因組之間存在重組事件，說明不同PEDV毒株之間普遍存在基因重組現(xiàn)象[19,34]。由于PEDV重組發(fā)生會帶來潛在不可控風(fēng)險，因此建議種豬場在制定免疫程序時，應(yīng)基于本場病原日常監(jiān)測結(jié)果，選擇親緣關(guān)系較近的疫苗毒株(避免不同疫苗株混用)，從而有效防止強毒重組突變株的產(chǎn)生。Boniotti等[32]報道了1株2009—2012年間流行于意大利的豬重組腸道冠狀病毒(Swine enteric coronavirus，SeCoV)，SeCoV由PEDV的S基因和TGEV的骨架重組產(chǎn)生，隨后，德國和西班牙等國也暴發(fā)了這種重組型SeCoV引起的疫情[35]；Valkó等[36]發(fā)現(xiàn)在匈牙利SeCoVS基因和PEDV又有了新的重組現(xiàn)象，這些都說明冠狀病毒屬的成員之間也可發(fā)生基因重組，這些廣泛發(fā)生的豬冠狀病毒重組將持續(xù)對生豬養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴重威脅。因此，應(yīng)繼續(xù)加強對PEDV病原學(xué)監(jiān)測，揭示PEDV潛在起源、演化和重組的分子機制。

4 結(jié) 論

本研究成功克隆了河北省暴發(fā)于2020年底的1株變異型PEDV(HB/HEBEU/2020)全基因組，發(fā)現(xiàn)其與SNJ-P株相似性最高，屬于PEDV G2b亞群，并且存在跨PEDV亞群重組現(xiàn)象。研究結(jié)果有助于揭示PEDV在中國的自然選擇與進化規(guī)律，為制定合理的防控策略提供理論和依據(jù)。