梁 盼，楊艷平，馮國(guó)飛，溫文勝，張 哲△

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)區(qū)域性高發(fā)腫瘤早期防治研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530021；3.廣西區(qū)域性高發(fā)腫瘤早期防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530021）

鼻咽癌（NPC）是一種起源于鼻咽黏膜上皮的惡性腫瘤，發(fā)病部位多在鼻咽頂部和咽隱窩，以非角化性未分化癌多見(jiàn)。其發(fā)病具有地域性，且病因復(fù)雜，EB病毒、遺傳和環(huán)境是促進(jìn)NPC發(fā)生發(fā)展的重要因素[1]。隨著放療、化療及靶向治療手段的發(fā)展，近年來(lái)NPC的療效已大幅提高，轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)仍是目前NPC 的治療難點(diǎn)[2]。探索與NPC 相關(guān)的分子標(biāo)志物和新的治療靶點(diǎn)，是NPC轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究的重要切入點(diǎn)。

GINS（Go,Ichi,Nii,San）復(fù)合體是生物DNA復(fù)制機(jī)制中的組成部分，參與DNA復(fù)制的起始和延伸過(guò)程[3-4]。其有助于增加DNA底物親和力，使底物特異性結(jié)合到MCM亞基上，激活解旋酶（mini-chromosome maintenance,MCM），促進(jìn)解螺旋[5]。該復(fù)合體由4 個(gè)亞基組成，包括亞基GINS1（Psf1），GINS2（Psf2），GINS3（Psf3）和GINS4（Sld5）[6]。近年的研究提示，GINS 復(fù)合物的高表達(dá)與腫瘤患者的不良預(yù)后有關(guān)[7-8]。GINS1的表達(dá)下調(diào)在滑膜肉瘤中可抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡[9]，在肺癌可抑制細(xì)胞的增殖[10]。此外，GINS1的高表達(dá)還與肝癌的較強(qiáng)侵襲性表型和不良預(yù)后相關(guān)[11]。但GINS1在NPC 中的表達(dá)尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。本研究主要探討GINS1在NPC 中的表達(dá)情況及其對(duì)NPC 的生物學(xué)行為的影響，進(jìn)一步為NPC分子靶向診斷和治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株和主要試劑 NPC 細(xì)胞株HONE1來(lái)自廣西醫(yī)科大學(xué)鼻咽癌重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。DMEM 培養(yǎng)基、KSFM培養(yǎng)基（配套生長(zhǎng)因子）、澳洲胎牛血清購(gòu)自Gibco 公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine RNAi-MAX Reagent 購(gòu)自Invitrogen 公司，siRNA 購(gòu)自BIONEER 公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒來(lái)自全式金品牌，SYBR Green Master Mix 買(mǎi)自Applied Biosystems 公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Dojindo 公司。BCA 試劑盒購(gòu)自碧云天公司，Nu-PAGETM 4-12%Bis-Tris Gel、Marker、sample buffer（4×）、running buffer（20×）購(gòu)買(mǎi)于Thermo Fisher Scientific公司。GINS1抗體購(gòu)自Abcam公司，GAPDH抗體購(gòu)于Proteintech，二抗購(gòu)自L(fǎng)I-COR公司。細(xì)胞劃痕插件購(gòu)自ibidi 公司，Transwell 小室來(lái)自公司Corning，人工基質(zhì)膠Matrigel來(lái)自BD公司。

1.1.2 組織標(biāo)本 本次鼻咽部組織標(biāo)本來(lái)自廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科門(mén)診就診患者，且已經(jīng)過(guò)病理科確診，黏膜慢性炎的患者15例，未分化型非角化性癌患者20例。所有樣本均經(jīng)過(guò)廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)（No.2016-KY-050），患者均知情同意。收集患者的相關(guān)臨床病理資料，采用美國(guó)聯(lián)合腫瘤委員會(huì)（AJCC）修訂的第8版NPC分期標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)病例資料進(jìn)行T分期、N分期及臨床分期。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 數(shù)據(jù)集來(lái)自NCBI的公共數(shù)據(jù)庫(kù)GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/），納入數(shù)據(jù)集標(biāo)準(zhǔn)：（1）正常組和鼻咽癌組均不少于3例；（2）數(shù)據(jù)集來(lái)源物種為人；（3）包括GINS1的數(shù)據(jù)。由此納入人的NPC 基因表達(dá)譜公共數(shù)據(jù)集GSE12452、GSE13597、GSE34573、GSE61218、GSE53819 和GSE64634，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析以上數(shù)據(jù)集中NPC和正常組織GINS1的轉(zhuǎn)錄水平情況。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 永生化人鼻咽上皮細(xì)胞系NP69與人NPC 細(xì)胞株（TW03、HK1、C666-1、5-8F、6-10B、CNE2、CNE1、HONE1）分別復(fù)蘇接種于KSFM培養(yǎng)基（含0.2%生長(zhǎng)因子）、DMEM 完全培養(yǎng)基（含10%新生胎牛血清、1%青—鏈霉素混合液）中，置于37 ℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d 更換培養(yǎng)液。

1.2.3 HONE1細(xì)胞轉(zhuǎn)染 分2組轉(zhuǎn)染，一組為轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組（siNC-HONE1 組）轉(zhuǎn)染無(wú)義序列；一組為實(shí)驗(yàn)組（siGINS1-HONE1 組）轉(zhuǎn)染GINS1的序列。按照Invitrogen Lipofectamine RNAiMAX 說(shuō)明書(shū)操作，待接種的6孔板細(xì)胞長(zhǎng)至50%～60%融合率時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別將siNC 和siGINS1轉(zhuǎn)染至6 孔培養(yǎng)板中。6 h后6孔板細(xì)胞更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至24 h，利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RTqPCR）、蛋白免疫印跡法（Western blotting）驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 RNA 提取和逆轉(zhuǎn)錄 利用TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA濃度，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)配置逆轉(zhuǎn)錄體系，該體系含2 μg Total RNA、1μL Anchored Oligo（dT）Primer、10 μL Reaction Mix、1μL RI Enzyme Mix、1μL gDNA Remover 和對(duì)應(yīng)的RNase-free Water。按照該體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，所得cDNA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 RT-qPCR

采用SYBR Green 法，20 μL 的反應(yīng)體系，該體系包括無(wú)菌去離子水7 μL，基因正向引物1 μL，基因反向引物1 μL，cDNA 1 μL 和SYBR Green 10 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃（預(yù)變性）10 min；95 ℃10 s，60 ℃1 min，共40 個(gè)循環(huán)，所得結(jié)果使用2-ΔΔCT方法計(jì)算。目標(biāo)基因?yàn)镚INS1，上游引物序列為：5’-CAACTGCCTGCCTTCAACGA-3’，下游引物序列為：5’-ATCCGAAGCAAGCGGTCATA-3’。內(nèi)參基因?yàn)镚APDH，上游引物序列為：5’-GCTCAGACACCATGGGGAAG-3’，下游引物序列為：5’-TGTAGTTGAGGTCAATGAAGGGG-3’。

1.2.6 Western blotting 法檢測(cè)細(xì)胞蛋白水平的表達(dá) 收集細(xì)胞，加入蛋白裂解液，冰上裂解30 min，使用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。70 ℃10 min蛋白變性，上樣，使用220 V 電壓電泳至泳道m(xù)aker 分離至膠底，切膠、轉(zhuǎn)膜后使用5%脫脂牛奶封閉1.5 h，一抗過(guò)夜后，二抗孵育1.5 h，凝膠成像系統(tǒng)拍照并記錄。Image J 進(jìn)行灰度值分析，蛋白相對(duì)表達(dá)量=（目的條帶灰度值－背景灰度值）/（內(nèi)參條帶灰度值－背景灰度值）。

1.2.7 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活力

將轉(zhuǎn)染后的HONE1細(xì)胞，離心、計(jì)數(shù)。取96孔板居中位置，每孔接種細(xì)胞數(shù)為1 000 個(gè)/100 μL 培養(yǎng)基。siGINS1-HONE1 組與siNC-HONE1 組分別設(shè)置5個(gè)復(fù)孔/d，每天同一時(shí)段取10 μL CCK-8試劑溶液加入每孔，置于培養(yǎng)箱中孵育2 h，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定細(xì)胞吸光度值（OD）值并記錄，連續(xù)測(cè)定5 d。

1.2.8 劃痕法測(cè)定細(xì)胞遷移能力 HONE1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，消化、離心、計(jì)數(shù)。將提前準(zhǔn)備好的劃痕插件黏附于6 孔板，siGINS1-HONE1 組與siNCHONE1 組各5 個(gè)復(fù)孔。插件小室內(nèi)接種細(xì)胞數(shù)為5×104個(gè)。待小室細(xì)胞貼壁長(zhǎng)滿(mǎn)后，移除插件，在六孔板中加入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)，顯微鏡下觀察劃痕傷口愈合情況，抓拍0 h、8 h 細(xì)胞劃痕照片，計(jì)算劃痕愈合率。傷口愈合率=（0 h劃痕面積－8 h劃痕面積）/0 h劃痕面積×100%。

1.2.9 Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 將基質(zhì)膠與無(wú)血清DMEM 按1∶29 比例混合稀釋?zhuān)?00 μL稀釋后的基質(zhì)膠鋪于Transwell小室上室，放置培養(yǎng)箱1.5 h。轉(zhuǎn)染后的HONE1 細(xì)胞取5×104個(gè)接種于上室，下室加入600 μL 含10%血清DMEM完全培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，用4%多聚甲醛固定、1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下拍照，計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，STATA 13軟件進(jìn)行Meta分析，Image J進(jìn)行蛋白條帶灰度值分析和劃痕愈合率計(jì)算，GraphPad 8.0作圖。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1GINS1在NPC細(xì)胞和腫瘤組織中轉(zhuǎn)錄上調(diào)

在NCBI平臺(tái)公共數(shù)據(jù)庫(kù)GEO提取公共數(shù)據(jù)集GSE12452，GSE13597，GSE34573，GSE61218，GSE53819 和GSE64634，使用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)GINS1轉(zhuǎn)錄水平的差異性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，與正常組比較，鼻咽癌組中GINS1轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)上調(diào)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 GINS1在NPC基因芯片中的表達(dá)情況

對(duì)6個(gè)微陣列數(shù)據(jù)集進(jìn)行Meta分析，鼻咽癌組包括111 例、正常組包括44 例，見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，單個(gè)數(shù)據(jù)集存在異質(zhì)性（I2=61.50%，P=0.02），NPC組織中的轉(zhuǎn)錄水平高于正常組織（SMD=2.23，95%CI：1.44～3.02，P=0.000），見(jiàn)圖2A。Begg 法（P=0.26）和Egger 法（P=0.38），檢驗(yàn)結(jié)果表明本研究不存在明顯發(fā)表偏倚，見(jiàn)圖2B，圖2C。敏感度分析（圖2D）結(jié)果顯示，合并標(biāo)準(zhǔn)均差較為穩(wěn)定，剔除任一研究結(jié)果，不會(huì)改變結(jié)論。

表1 Meta分析中GEO數(shù)據(jù)集的詳細(xì)信息

圖2 GINS1在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)NPC芯片數(shù)據(jù)集中的Meta分析

進(jìn)一步通過(guò)RT-qPCR 技術(shù)，檢測(cè)了GINS1在NPC 細(xì)胞系和組織轉(zhuǎn)錄水平的差異，結(jié)果顯示，對(duì)比正常鼻咽上皮細(xì)胞系NP69，基因GINS1在NPC細(xì)胞系中轉(zhuǎn)錄上調(diào)（P＜0.05）（圖3A）；對(duì)比正常組織，GINS1基因在癌組織中呈轉(zhuǎn)錄上調(diào)（P＜0.01），圖3 B、圖3 C。

圖3 GINS1在NPC細(xì)胞和組織中轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)情況

進(jìn)一步分析GINS1的轉(zhuǎn)錄水平與患者臨床病理特征的關(guān)系，GINS1的轉(zhuǎn)錄水平在患者的年齡、性別、T分期、N分期及臨床分期中差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 臨床組織樣本中GINS1 轉(zhuǎn)錄水平與NPC 患者相關(guān)臨床病理參數(shù)的關(guān)系

表2 臨床組織樣本中GINS1 轉(zhuǎn)錄水平與NPC 患者相關(guān)臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.2 siRNA 沉默GINS1的表達(dá)抑制NPC 細(xì)胞的增殖能力

沉默GINS1后細(xì)胞中GINS1轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平表達(dá)降低，見(jiàn)圖4 A～圖4C。通過(guò)CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞貼壁后第1、第2、第3、第4、第5 天的OD 值，繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)，結(jié)果顯示，與siNC-HONE1 組相比，siGINS1-HONE1 組第3、第4、第5 天細(xì)胞的吸光度值明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)圖4D。

圖4 沉默GINS1抑制NPC細(xì)胞增殖能力

2.3 siRNA 沉默GINS1的表達(dá)抑制NPC 細(xì)胞的遷移能力

劃痕結(jié)果顯示，siGINS1-HONE1 組與siNCHONE1 組細(xì)胞劃痕愈合率分別為（0.61±0.14）、（0.75±0.12），siGINS1-HONE1 組劃痕愈合率低于siNC-HONE1 組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.22，P＜0.05），見(jiàn)圖5。

圖5 沉默GINS1抑制NPC細(xì)胞的遷移能力

2.4 siRNA 沉默GINS1的表達(dá)抑制NPC 細(xì)胞的侵襲能力

Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，siNC-HONE1 組穿膜細(xì)胞數(shù)為每視野（23±19）個(gè)，siGINS1-HONE1 組穿膜細(xì)胞數(shù)為每視野（113±25）個(gè)，兩組細(xì)胞數(shù)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.91，P＜0.05），見(jiàn)圖6。

圖6 沉默GINS1抑制NPC細(xì)胞的侵襲能力

3 討論

GINS1是GINS 復(fù)合體家族成員的一種亞基，是SLD5的伴侶，其在進(jìn)化上是保守的，參與了低等真核生物[12-13]和人類(lèi)的DNA復(fù)制過(guò)程[14]。GINS1是近幾年的研究熱點(diǎn)，大多情況下，該基因在腫瘤中表達(dá)上調(diào)，具有一定的腫瘤組織靶向性。本研究發(fā)現(xiàn)，GINS1在GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)NPC 芯片中轉(zhuǎn)錄上調(diào)。通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)，GINS1在NPC細(xì)胞系及組織中mRNA表達(dá)水平高于正常鼻咽上皮細(xì)胞及組織，結(jié)果與GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)一致。提示GINS1可能是促癌基因。

本課題使用siRNA 干擾技術(shù)沉默細(xì)胞HONE1中基因GINS1表達(dá)后，通過(guò)CCK-8 法檢測(cè)到si-GINS1-HONE1 組細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制。Tang 等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，在滑膜肉瘤腫瘤中，下調(diào)GINS1的表達(dá)，可明顯抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Li等[15]發(fā)現(xiàn)，在肝癌中，下調(diào)GINS1可導(dǎo)致G1/S 期腫瘤細(xì)胞周期阻滯，進(jìn)而降低腫瘤細(xì)胞的增殖能力。再者，Zhang等[10]的研究表明，敲低GINS1的表達(dá)后，肺癌細(xì)胞的增殖能力被抑制。本研究證實(shí)敲低GINS1后，可在體外抑制NPC 細(xì)胞的增殖，進(jìn)一步證明GINS1有抑制腫瘤增殖的作用。

遷移和侵襲是腫瘤細(xì)胞重要的惡性生物學(xué)行為，亦是臨床上促使癌癥發(fā)展，造成死亡的主要原因。鑒于此，本研究使用劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默GINS1的NPC細(xì)胞的遷移和侵襲能力，結(jié)果提示：沉默GINS1的表達(dá)，可以抑制鼻咽癌細(xì)胞的遷移侵襲能力。Saifei等[16]研究發(fā)現(xiàn)，沉默GINS2可以抑制甲狀腺癌MAPK通路過(guò)度激活的狀態(tài)，抑制該信號(hào)通路的相關(guān)蛋白表達(dá)，比如JNK、ERK 和p38，降低甲狀腺癌細(xì)胞的活力、遷移和侵襲功能。Dianmin 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)GINS2增加了STAT1 和STAT2蛋白的表達(dá)，抑制肺癌的增殖和遷移。此外，Yang 等[18]研究指出，GINS4在非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)促進(jìn)了細(xì)胞的遷移和侵襲能力。GINS 復(fù)合物亞基之間有著密不可分的關(guān)系，GINS2、GINS4在其他腫瘤當(dāng)中的作用也提示著GINS1在NPC 中也可能是異常生物學(xué)行為發(fā)生的重要因素之一。本研究也證實(shí)了，沉默GINS1抑制NPC 遷移和侵襲能力，說(shuō)明GINS1可能在NPC 的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。

綜上，GINS1在NPC中呈現(xiàn)轉(zhuǎn)錄上調(diào)，通過(guò)siRNA 敲低GINS1的表達(dá)，可以顯著抑制NPC 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。研究表明，GINS2在腫瘤中可通過(guò)MAPK/ERK 通路、STAT 信號(hào)通路影響腫瘤的增殖和遷移[16-17]。因此，筆者假設(shè)，與GINS2同為GINS 家族的GINS1，也有通過(guò)MAPK/ERK 通路、STAT 信號(hào)通路影響NPC 惡性生物學(xué)行為的可能性，這也是本課題下一步的研究方向。闡明相關(guān)機(jī)制，本課題組能更好的了解GINS1基因作為癌基因的作用，為NPC的診斷和防治提供新的靶點(diǎn)。