楊 曄，黨榮廣，張 靜，董 超，宋雪晶

（石家莊市人民醫(yī)院 1.腫瘤科一病區(qū)，2.腫瘤科二病區(qū),石家莊 050011）

肺癌是死亡率較高的惡性腫瘤，肺癌患者的5年生存率不到15%，目前肺癌的治療方式主要有手術、放療、化療及分子靶向和免疫治療等，但復發(fā)、轉移與耐藥常導致患者預后很差。腫瘤轉移是惡性腫瘤基本特征，涉及多基因的調控，研究肺癌發(fā)生發(fā)展及轉移機制具有重要意義[1-2]?？坩樀鞍?（fibulin 5，FBLN5）是一種胞外基質糖蛋白，與細胞增殖黏附、血管修復、腫瘤發(fā)生發(fā)展等密切相關[3]。FBLN5在不同的腫瘤中發(fā)揮作用不一致，如在肝細胞癌、乳腺癌等腫瘤中表達下調，發(fā)揮抑癌基因的作用[4]。研究顯示，在非小細胞肺癌中，異檸檬酸脫氫酶（IDH）的突變促進DNA-甲基轉移酶1（DNMT1）與FBLN5 啟動子的結合，使FBLN5 甲基化，促進細胞的遷移和增殖[5]。本研究旨在分析FBLN5在肺癌組織中的表達，探討其與肺癌臨床病理特征的關系，并通過干預FBLN5 表達探討FBLN5 對肺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響，為肺癌的靶向治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞 人肺癌細胞系HCC827、人支氣管上皮細胞BEAS-2B購于中國科學院細胞庫（中國科學院細胞庫）。

1.1.2 試劑及試劑盒 胎牛血清和RPMI 1640 培養(yǎng)基（美 國Gibco 公司）；TRIzol、Lipofectamine ?2000 Transfection Reagent、MTT 細胞活力檢測試劑盒（美國Invitrogen 公司）；PrimeScriptTMRT reagent kit、SYBR?Premix Ex Taq?Kit（日本Takara 公司）；FBLN5 過表達質粒（pcDNA-FBLN5）、空載質粒（pcDNA-NC）及FBLN5、β-actin引物（廣州市銳博生物科技有限公司）；BeyoECL Moon（極超敏ECL 化學發(fā)光試劑盒）、BeyoClick?EdU-594細胞增殖檢測試劑盒（購于上海碧云天生物技術有限公司）；兔抗人FBLN5、Ki67、PCNA、MMP-2、MMP-9 單克隆抗體（英國Abcam公司）。

1.2 方法

1.2.1 肺癌組織中FBLN5mRNA 的表達 選取2019年1月至2020年6月在石家莊市人民醫(yī)院行手術治療的67例肺癌組織與癌旁組織，其中男39例，女28例，年齡35～82歲，平均（62.30±9.70）歲?；颊咴谛g前未經任何放化療治療，術后經病理診斷為肺癌。收集肺癌患者腫瘤分化程度、TNM 分期、淋巴結轉移等臨床資料。實時熒光定量PCR（real-time quantification PCR，RT-qPCR）法檢測肺癌組織及癌旁組織FBLN5mRNA表達水平。

1.2.2 細胞培養(yǎng) HCC827、BEAS-2B 細胞置于含有10% FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞貼壁至80%～90%時，胰蛋白酶消化收集細胞，用于后續(xù)實驗。

1.2.3 細胞分組及轉染 將HCC827 細胞接種于6 孔板中，細胞融合達80%以上后使用Lipofectamine?2000 轉染試劑進行轉染，將細胞分為空白對照組（Control組）、FBLN5過表達組（pcDNA-FBLN5組）和陰性對照組（pcDNA-NC組）。Control組不做轉染處理，細胞轉染6 h后更換新鮮RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h。

1.2.4 RT-qPCR檢測FBLN5mRNA水平 Trizol試劑提取肺癌組織、癌旁組織及HCC827、BEAS-2B細胞總RNA，用PrimeScriptTMRT reagent kit 合成cDNA 后，采用RT-qPCR 檢測FBLN5mRNA 相對表達量。FBLN5上游引物5’-3’：TGTAGTGGTTGGGAGGATTTTGGTG；下游引物5’-3’：TTCCTAACATATCCAAAACACACAA；β-actin上游引物5’-3’：TTCCTAACATATCCAAAACACACAA；下游引物5’-3’：TCGGTGAGGATCTTCATGAGGTA。以βactin為內參，采用2-△△CT法計算FBLN5mRNA 相對表達量。

1.2.5 MTT 法檢測細胞增殖 轉染后的各組HCC827細胞生長至對數期時，以每孔2×105個細胞接種于96 孔板中，于培養(yǎng)24 h、48 h、72 h 時每孔加入10 μL的MTT溶液（濃度5 g/L），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再加入150 μL 的DMSO 溶液，酶標儀490 nm 處檢測吸光度（A）值。

1.2.6 Edu 染色 轉染后的各組HCC827 細胞生長至對數期時，胰蛋白酶消化制備成2×106個細胞/mL的懸液，接種于24孔板中，培養(yǎng)24 h后，加入Edu染液孵育2 h，去除培養(yǎng)液，加入4%多聚甲醛固定15 min，PBS 洗滌細胞3 次，每次3～5 min，每孔加入Click 反應液，室溫避光孵育30 min，PBS 洗滌后再加入Hoechst 33342染液進行細胞核染色，顯微鏡觀察。

1.2.7 Transwell 小室檢測細胞遷移與侵襲 侵襲實驗中Matigel膠使用無血清培養(yǎng)基稀釋鋪于Transwell 小室，待膠干后（遷移實驗無需加入Matigel膠），Transwell 上室加入無血清培養(yǎng)液稀釋的各組HCC827 細胞，下室加入完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h 后，下室細胞用4%多聚甲醇固定，0.5%結晶紫染色30 min，隨機選擇6 個視野，顯微鏡觀察，計算平均每個視野遷移與侵襲細胞數目。

1.2.8 免疫蛋白印跡法（Western blotting）檢測細胞中Ki67、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達 收集各組轉染48 h的HCC827細胞，加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度，蛋白樣品進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后轉至醋酸纖維膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入兔抗人Ki67、PCNA、MMP-2、MMP-9單克隆抗體和β-actin（1∶1 000）抗體，4℃反應過夜，加相應的二抗孵育2 h，ECL 發(fā)光液顯色，以β-actin為內參，分析條帶灰度。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0 軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用采用LSD-t檢驗；計數資料以百分率（%）表示，組間比較采用卡方檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 FBLN5 mRNA 在肺癌組織和癌旁組織中的表達

RT-qPCR檢測結果顯示，FBLN5mRNA在肺癌組織中表達水平（0.41±0.07），低于癌旁組織（1.00±0.00）（P＜0.05），見圖1。

圖1 FBLN5 mRNA在肺癌組織和癌旁組織中的表達

2.2 肺癌組織中FBLN5表達與肺癌臨床病理特征的關系

根據肺癌組織中FBLN5mRNA表達水平，以表達的平均值為界，可將肺癌患者分為FBLN5高表達34例和低表達33例，結果顯示，FBLN5表達與TNM分期和淋巴結轉移相關（P＜0.05），見表1。

表1 肺癌組織中FBLN5表達與肺癌臨床病理特征的關系 n（%）

2.3 過表達FBLN5 后HCC827 細胞FBLN5 mRNA及蛋白表達

RT-qPCR 和Western blotting 檢測結果顯示，與BEAS-2B 組相比，Control 組FBLN5 mRNA 及蛋白表達水平降低（P＜0.05），與Control 組和pcDNANC 組相比，pcDNA-FBLN5 組HCC827 細胞FBLN5 mRNA 及蛋白表達水平升高（P＜0.05），見圖2、圖3。

圖2 各組細胞FBLN5蛋白表達

圖3 過表達FBLN5細胞FBLN5 mRNA及蛋白表達比較

2.4 過表達FBLN5對HCC827細胞增殖的影響

MTT 結果顯示，與Control 組和pcDNA-NC 組相比，pcDNA-FBLN5組HCC827細胞吸光度（A）值降低（P＜0.05）；Edu 染色結果顯示，pcDNA-FBLN5組HCC827 細胞染色為紅色的細胞較Control 組和pcDNA-NC 組減少，表明過表達FBLN5 顯著抑制HCC827細胞增殖活性，見圖4、圖5。

圖4 過表達FBLN5后HCC827細胞增殖曲線

圖5 過表達FBLN5后HCC827細胞Edu染色（×200）

2.5 過表達FBLN5 對HCC827 細胞遷移與侵襲的影響

Transwell 小室實驗結果顯示，與Control 組和pcDNA-NC組相比，pcDNA-FBLN5組HCC827細胞遷移與侵襲數目降低（P＜0.05），表明過表達FBLN5顯著抑制HCC827細胞遷移與侵襲，見圖6。

圖6 過表達FBLN5后各組HCC827細胞遷移侵襲（×200）

2.6 過表達FBLN5 對HCC827 細胞增殖及遷移侵襲相關蛋白表達的影響

WB 檢測結果顯示，與Control 組和pcDNA-NC組相比，pcDNA-FBLN5 組HCC827 細胞Ki67、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平降低（P＜0.05），見圖7。

圖7 過表達FBLN5后各組HCC827細胞Ki67、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達

3 討論

腫瘤轉移常與腫瘤耐藥性有關，腫瘤轉移過程復雜，是多基因表達調控的結果，尋找有效的診療靶點抑制肺癌的轉移對于改善患者預后具有重要意義[6-7]。

扣針蛋白（fibulin，FBLN）家族具有維持結締組織和基底膜形成和穩(wěn)定的作用，FBLN 還可通過參與調節(jié)細胞內外的信號通路，影響細胞增殖、細胞間的粘附作用及細胞遷移等[8]；FBLN5是一種含448個氨基酸的糖蛋白，屬于FBLN 家族，FBLN5 主要表達于血管平滑肌細胞、成纖維細胞和內皮細胞，在受損血管和病理條件下表達增多，FBLN5的異常表達與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關[9]。而且，FBLN5在不同腫瘤中表達水平不同，可能與不同的腫瘤微環(huán)境有關。已有研究顯示，FBLN5在肺癌組織中表達水平降低，FBLN5通過調節(jié)腫瘤微環(huán)境來抑制Wnt/β-catenin 信號傳導，抑制肺癌轉移[10]。本研究結果顯示，FBLN5在肺癌組織中表達水平顯著低于癌旁組織，與文獻[10]報道的結果一致，提示FBLN5 表達與肺癌的發(fā)生有關。通過分析FBLN與肺癌臨床病理特征的關系，發(fā)現FBLN5 表達與TNM 分期和淋巴結轉移有關，提示FBLN5與肺癌的發(fā)生發(fā)展與轉移相關。研究顯示，FBLN5在乳腺癌和子宮內膜癌等腫瘤中表達下調，其表達可抑制癌細胞增殖和侵襲，發(fā)揮抑癌的作用[11]，推測FBLN5 可能通過調節(jié)肺癌細胞增殖與侵襲參與肺癌的發(fā)生發(fā)展與轉移。

腫瘤的轉移與惡性腫瘤細胞抵抗凋亡、無限復制以及持續(xù)的血管生成等特征有關，FBLN5在調控腫瘤細胞增殖、遷移侵襲等過程中發(fā)揮重要作用[12]。有研究表明，FBLN5通過抑制結腸癌細胞瞬時受體電位陽離子通道亞家族V成員1（TRPV1）促進細胞凋亡和活性氧（ROS）的產生，腫瘤微環(huán)境中ROS 水平升高，可抑制腫瘤血管生成，進而抑制腫瘤進展[13]。為探索FBLN5對肺癌細胞的作用，本研究在HCC827 細胞中轉染pcDNA-FBLN5 后，細胞增殖活性、遷移與侵襲細胞數目及Ki67、PCNA、MMP-2 和MMP-9 蛋白表達水平降低；MMP2 和MMP9 屬于基質金屬蛋白酶類，其水平升高可以促進腫瘤細胞的侵襲與轉移[14]。Ki-67 與PCNA 是細胞增殖抗原蛋白，與細胞增殖有關。有研究顯示，FBLN5可通過下調Ki-67抑制乳腺癌細胞增殖和侵襲[15]。本研究結果顯示，過表達FBLN5可顯著抑制細胞增殖、遷移與侵襲，其機制可能與下調Ki67、PCNA、MMP-2和MMP-9表達有關，但FBLN5的具體調控機制仍需做進一步研究。

綜上所述，FBLN5 在肺癌組織中低表達，且與肺癌的腫瘤分期和淋巴結轉移相關，過表達FBLN5可顯著抑制肺癌細胞增殖、遷移與侵襲，FBLN5 可能是治療肺癌的靶基因。