徐碧瑩， 黃偉鵬， 張敏艷， 吳委林， 鄭大浩

(延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

玉米(學(xué)名：Zea mays)在我國是3大糧食作物之一[1]，是世界上重要的糧食作物和豐產(chǎn)性最高的谷物作物[2]。在自然界危害玉米的害蟲種類超過90多種[3]，從玉米的根部到其上部的雄穗，受到根蟲、莖稈蛀蟲的侵害較多[4]。近年來，由于傳統(tǒng)種植方式的改變，導(dǎo)致玉米蟲害發(fā)生具有越來越加重的趨勢[5-6]。據(jù)研究，植物內(nèi)源性苯并噁嗪類次生代謝物與其生抗性和植株表皮組織結(jié)構(gòu)上防御響應(yīng)密切相關(guān)[7-8]，賦予了植株對害蟲及病原菌的廣泛普遍的抗性。苯并惡嗪代謝從吲哚-3-甘油磷酸開始，經(jīng)過吲哚、吲哚-2-酮、3-羥基吲哚-2-酮合成出2-羥基-苯并惡嗪-3-酮(HBOA)，再由HBOA合成出DIBOA及其衍生物DIBOA-葡萄糖苷和TRIBOA-葡萄糖苷[9]。此后在不同的鄰-甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下進(jìn)行甲基化產(chǎn)生各種賦予植物真正防御機(jī)能的含有甲氧基的苯并噁惡嗪-3-酮-葡萄糖苷類物質(zhì)[10]。bx7基因是苯并噁嗪代謝途徑中的關(guān)鍵酶之一，催化由TRIBOA-葡萄糖苷轉(zhuǎn)化為丁布葡萄糖苷(DIMBOA-Glc)，在玉米植株抗蟲方面起著重要作用。

該研究采用cDNA-PCR克隆技術(shù)，從玉米Mo17中克隆編碼TRIBOA-Glc鄰甲基轉(zhuǎn)移酶的bx7基因，并對目標(biāo)序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為TRIBOA-Glc鄰甲基轉(zhuǎn)移酶的體外合成和功能驗證奠定基礎(chǔ)，這對揭示玉米抗蟲性的分子機(jī)制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

該試驗采用高抗蚜蟲玉米自交系Mo17種子，培養(yǎng)在農(nóng)學(xué)院教學(xué)實(shí)驗基地，待玉米苗長至3葉期取樣并保存于-80 ℃冰箱，用于RNA提取。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取與cDNA合成

總RNA提取按照RNA提取試劑盒說明書操作，cDNA合成按照Promega公司GoScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作。

1.2.2 基因克隆與測序

利用NCBI網(wǎng)站(National Center for Biotechnology Information)下載玉米TRIBOA-Glc鄰甲基轉(zhuǎn)移酶bx7基因的mRNA序列(登錄號為NM_001127247.2)，然后通過BLAST分析方法，進(jìn)行多序列比對分析。利用Primer Premier 6.0設(shè)計引物，利用Auto Dimer 1.0來檢測所設(shè)計的引物質(zhì)量。其中正向引物為bx7EC545F1：GAATTCTGGGAAGAGTGTCATCAA(下劃線部分為限制性內(nèi)切酶EcoR I位點(diǎn))；反向引物為bx7XI2161R:CTCGAGATGTTTCCGTCCTCCGA(下劃線部分為限制性內(nèi)切酶Xho I位點(diǎn))。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1) PCR擴(kuò)增體系 cDNA，1 μL,Taq-GreenMix，5 μL,10 μmol/L引物各1 μL，最終加ddH2O補(bǔ)充至10 μL。

2) 反應(yīng)條件為 95 ℃預(yù)變性，5 min；95 ℃，30 s，57.1 ℃，45 s，72 ℃，1 min 30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸反應(yīng)10 min。

3) PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測驗證正確后，利用膠回收試劑盒將擴(kuò)增出的目標(biāo)條帶進(jìn)行回收。將回收后的產(chǎn)物連接到pMD-19T載體上，再導(dǎo)入到感受態(tài)的大腸桿菌DH5α中，在含有氨芐青霉素、IPTG、X-Gal的培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)，經(jīng)過藍(lán)白斑選擇挑取陽性克隆。經(jīng)酶切驗證正確后將菌液送往上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測序。

1.2.3 目標(biāo)序列的同源性分析

將得到的測序結(jié)果，利用DNA Star軟件和Gene Doc軟件進(jìn)行序列分析和同源性比對分析。在NCBI上下載禾本科bx7蛋白序列，再用MEGA7軟件構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.2.4 目標(biāo)序列的生物信息學(xué)分析

目標(biāo)序列編碼的蛋白質(zhì)序列分析，通過在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行Blast分析確定為bx7基因后應(yīng)用BioEdit軟件進(jìn)行分析，采用ExPASy Proteomics Server在線工具中ProtScale模塊對bx7基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行親疏水性等一級結(jié)構(gòu)的分析；通過NCBI在線網(wǎng)站對目標(biāo)序列編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行序列同源性分析；使用TMHMM2.0、SOPMA、SWISS-MODEL在線分析工具對目標(biāo)蛋白的跨膜區(qū)域分析，對二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 bx7基因序列分析

以高抗蚜蟲的玉米自交系Mo17為材料，提取RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以cDNA為模板成功克隆出含有完整的目標(biāo)基因的cDNA片段(1 522 bp)(圖1)，在NCBI網(wǎng)站上與標(biāo)準(zhǔn)基因序列進(jìn)行分析，經(jīng)分析所獲序列含有一個完整的開放閱讀框，長1 176 bp，編碼392個氨基酸(圖2，3)。與標(biāo)準(zhǔn)基因序列相比共發(fā)生16處突變，存在1個6堿基和1個3堿基的插入突變，2個3堿基的缺失突變，12個單堿基突變。其中，1個單堿基突變位于起始密碼的上游-30 bp處，2個單堿基突變位于終止密碼的下游1 300～1 340 bp。蛋白質(zhì)序列存在6處變化，即從N末端開始第92個氨基酸和第336個氨基酸天門冬氨酸(D)丟失，第124個氨基酸丙氨酸(A)變成甘氨酸(G)，第127個氨基酸甘氨酸(G)變成丙氨酸(A)，并且存在第120個氨基酸絲氨酸(S)、第122個氨基酸天門冬氨酸(D)、丙氨酸(A)的插入。

注：M為2 000 bp 、15 000 bp DNA marker；第1泳道為以cDNA為模板的PCR產(chǎn)物；第2泳道為PCR擴(kuò)增回收產(chǎn)物；第3泳道為重組質(zhì)粒為模板的PCR產(chǎn)物；第4泳道為以插入目的片段的重組質(zhì)粒(pMD-19T重組質(zhì)粒)；第5泳道為重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物。

圖2 玉米自交系Mo17與標(biāo)準(zhǔn)基因組B73基因序列比較

2.2 目標(biāo)序列的生物信息學(xué)分析

2.2.1 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

利用在線工具ProtScale、TMHMM 2.0對編碼的蛋白質(zhì)的親疏水性(圖4)與跨膜區(qū)域結(jié)構(gòu)(圖5)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，從自交系Mo17中分離的目標(biāo)序列編碼由392個氨基酸組成的蛋白(bx7Zm1753Mo17P)，與玉米標(biāo)準(zhǔn)基因組(B73)的參考蛋白(bx7Ref_B73P)相比，含有相同的親水性氨基酸殘基數(shù)，均為226個；含有的疏水性氨基酸殘基數(shù)不同，參考蛋白含有疏水性氨基酸殘基165個；目標(biāo)蛋白含有疏水性氨基酸殘基166個。在參考蛋白中，丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、甘氨酸(G)、纈氨酸(V)、天門冬氨酸(D)、絲氨酸(S)等6種氨基酸占蛋白質(zhì)總氨基酸殘基數(shù)(391)的50.1%；在目標(biāo)蛋白中，占蛋白質(zhì)總氨基酸殘基數(shù)(392)的50.3%，所占比例差距不大。但在全部氨基酸中，丙氨酸(A)的比例最大(11%)，色氨酸(W)與天冬酰胺(N)所占比例最低(均為1.5%)

注：峰值<0表示親水性，A表示親水區(qū)(Hydrophilic domain)；峰值>0表示疏水性，B表示疏水區(qū)(Hydrophobic domain)。

圖5 參考蛋白和目標(biāo)蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析

目標(biāo)蛋白與參考蛋白的相對分子量分別為42.58 KD與42.53 KD；總元素數(shù)量分別為5 925與 5 914。除O元素、S元素數(shù)量相同外，其余3種組成元素C、H、N均有差異，分別為1 860、24、531和1857、293、530。正電荷殘疾總數(shù)相同均為38個；負(fù)電荷殘基總數(shù)相差1，分別為54、55。目標(biāo)蛋白與參考蛋白經(jīng)在線分析，穩(wěn)定系數(shù)小于40，表明目標(biāo)序列和參考序列編碼的蛋白的穩(wěn)定性較好，推斷為穩(wěn)定的親水性蛋白。該蛋白在Mo17與標(biāo)準(zhǔn)基因組的B73中均無跨膜區(qū)域結(jié)構(gòu)，屬于無跨膜結(jié)構(gòu)的親水性蛋白。

利用線上ProtScale軟件的Hphob. / Kyte& Doolittle模塊對目標(biāo)蛋白bx7Zm1753Mo17P的親疏水性進(jìn)行分析，從結(jié)果來看(圖3)，目標(biāo)蛋白bx7Zm1753Mo17P與參考蛋白bx7Ref_B73P具有相似的親水結(jié)構(gòu)，疏水結(jié)構(gòu)有些差異。峰值<0表示親水性，峰值>0表示疏水性，在圖中A區(qū)(A1-A10)代表親水區(qū)，B區(qū)(B1-B10)代表疏水區(qū)。在疏水區(qū)(B區(qū))B4區(qū)域?qū)Ρ瓤煽吹接忻黠@不同，不同區(qū)域的親疏水強(qiáng)弱不同，這可能反映了蛋白質(zhì)的親水性和疏水性序列譜的折疊情況。

圖3 玉米自交系Mo17與標(biāo)準(zhǔn)基因組B73編碼蛋白質(zhì)比較

2.2.2 蛋白質(zhì)二級三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

通過使用SOPMA預(yù)測目的蛋白的二級結(jié)構(gòu)可看出(表1，圖6)，目標(biāo)蛋白和參考蛋白均由α螺旋、β轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲與延伸鏈構(gòu)成，其中，α螺旋與無規(guī)則卷曲占氨基酸總數(shù)的比例較大，在參考蛋白中分別占47.06%與34.78%，在目標(biāo)蛋白中分別占44.64%與35.71%，而β轉(zhuǎn)角占氨基酸總數(shù)的比例最小，僅占了4.86%與5.61%。

表1 目標(biāo)蛋白和參考蛋白的二級結(jié)構(gòu)

注：a(藍(lán)色)為α螺旋；b(玫紅色)為無規(guī)則卷曲；c(綠色)為β轉(zhuǎn)角;d(紅色)為延伸鏈

利用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫PDB網(wǎng)站的3D Structure Viewers在線可視化工具預(yù)測參考蛋白bx7Ref_B73P和目標(biāo)蛋白bx7Zm1753Mo17P的三級結(jié)構(gòu)，得到三維結(jié)構(gòu)圖(圖7)。由于目標(biāo)片段編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列與標(biāo)準(zhǔn)基因組上所推斷的蛋白質(zhì)氨基酸序列相比，存在7個氨基酸的差異，導(dǎo)致參考蛋白和目的蛋白的三級結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化。

圖7 參考蛋白和目的蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.2.3 bx7蛋白的同源性分析及進(jìn)化樹

在NCBI在線分析工具中下載獲得與bx7相似性高的序列，并且利用MEGA7軟件來構(gòu)建玉米(Mo17)、普通小麥(XP_044393359.1)、硬粒小麥(VAI34156.1)、二粒小麥(XP_037442496.1)、黑麥(AXY54917.1)、大麥(KAE8793625.1)、二棱大麥(XP_044965079.1)、畫眉草(TVU31390.1)、柳枝稷(XP_039772587.1)、黍稷(RLM70322.1)、高粱(XP_002441380.2)、疣粒稻(KAF0887985.1)、粳稻(XP_015619557.1)、秈稻(EAY82987.1)、短柄草(XP_014752382.1)、谷子(XP_004962112.1)的進(jìn)化樹(圖8)。結(jié)果顯示，玉米(Mo17)與谷子、短柄草在同一支，普通小麥、硬粒小麥、二粒小麥、黑麥、大麥、二棱大麥、畫眉草在同一支，柳枝稷、高粱、黍稷、疣粒稻、粳稻和秈稻在同一分支，說明玉米與谷子、短柄草的親緣關(guān)系最近。

圖8 bx7與其他植物的氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.2.4 bx7蛋白的功能預(yù)測

將bx7基因編碼的氨基酸序列導(dǎo)入到NCBI數(shù)據(jù)庫中的Conserved Domain Database模塊進(jìn)行相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測。預(yù)測結(jié)果表明，該蛋白有2個保守結(jié)構(gòu)域(圖9)，該結(jié)構(gòu)域分別位于第30～90和170～380位氨基酸之間，屬于dimerization2 超級家族和AdoMet_MTases 超級家族。

圖9 參考蛋白和目的蛋白的保守結(jié)構(gòu)域

3 討論與結(jié)論

苯并惡嗪類化合物是參與植物防御的一類重要的次生化合物，具有抗病蟲害和化感等作用[11]。在苯并噁嗪類化合物中丁布(DIMBOA)被認(rèn)為是與植物抗病蟲害密切相關(guān)的代謝物質(zhì)[11]。有研究資料顯示，當(dāng)丁布含量達(dá)到一定程度時，能夠完全抑制小麥赤霉病菌孢子的生長[12]；同時用丁布來飼喂家蠶幼蟲，會導(dǎo)致家蠶幼蟲在3 d內(nèi)死亡[13]。丁布的分解產(chǎn)物也成為有效的化感作用的化合物，能夠降低一些雜草的生長和萌發(fā)[14]。在丁布合成途徑中，bx7基因催化TRIBOA-葡萄糖苷轉(zhuǎn)化為丁布葡萄糖苷(DIMBOA-Glc)[15-16]。不同的玉米對抗蟲性存在很大差異可能與TRIBOA-葡萄糖苷轉(zhuǎn)化為丁布葡萄糖苷(DIMBOA-Glc)的效率有關(guān)。可以推測bx7基因通過調(diào)控植物體內(nèi)丁布葡萄糖苷(DIMBOA-Glc)的含量高低，進(jìn)而決定植株抗蟲性的強(qiáng)弱[17-22]。該研究中，從玉米自交系Mo17中克隆出含有目標(biāo)片段的序列長度為1 522 bp，它與玉米標(biāo)準(zhǔn)基因組數(shù)據(jù)庫中的參考序列相比，在序列長度上存在一定差異。與參考序列相比，目標(biāo)序列在ORF內(nèi)存在13處堿基突變，導(dǎo)致了蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的改變；雖然來自Mo17 自交系的蛋白質(zhì)分子量和總元素數(shù)量與參考蛋白有一定差異，其氨基酸序列中也存在7個氨基酸的差異，造成了蛋白質(zhì)構(gòu)成元素C、H、O、N 和S 組成以及蛋白質(zhì)多肽鏈的正負(fù)電荷量以及親疏水特性等理化特性的略微變化。但通過與其他禾本科植物的同源性分析發(fā)現(xiàn)，氨基酸序列一致性較高，說明bx7蛋白在禾本科植物中的功能較為保守。屬于dimerization 超級家族和AdoMet_MTases 超級家族。

對克隆基因所編碼的蛋白質(zhì)親疏水性的分析表明，存在5個氨基酸的差異，其中，有2個氨基酸位于親水區(qū)，3個氨基酸位于疏水區(qū)，并且無跨膜結(jié)構(gòu)。bx7基因存在于禾本科植物中，例如玉米、谷子、大麥等，當(dāng)植物體受到外界侵害，該基因主要以TRIBOA-葡萄糖苷為底物使其轉(zhuǎn)化為丁布葡萄糖苷，而后去糖苷化生成丁布(DIMBOA)，最終使植物體產(chǎn)生能夠抵御外界侵害的有毒的苯并噁嗪類物質(zhì)。該研究中，來自自交系Mo17分離出的目標(biāo)片段有3個氨基酸的插入，2個氨基酸的丟失和突變，這對該基因的表達(dá)與對該酶的催化效率是否有影響，還需要進(jìn)一步深入研究。