何慧洲，程芝梅，張 帥，王黎洲，李 苒，許 敏，周 石*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)影像學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550000；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院介入放射科國(guó)家放射與治療臨床研究中心分中心，貴州 貴陽(yáng) 550000)

原發(fā)性肝癌發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[1-2]。肝纖維化與肝癌關(guān)系密切，多數(shù)肝癌患者有肝纖維化或肝硬化背景，且肝癌發(fā)病率隨肝硬化程度加重而增加[3]。肝癌患者腫瘤周?chē)谓M織(以下簡(jiǎn)稱瘤周)通常存在廣泛纖維化，可能是組織缺氧引起的細(xì)胞外基質(zhì)增多所致，而TACE可進(jìn)一步加重組織缺氧[4-5]。臨床研究[6-7]發(fā)現(xiàn)TACE術(shù)后肝癌患者肝損傷和肝纖維化程度加重，類似現(xiàn)象亦見(jiàn)于動(dòng)物模型中[4,8]。DONG等[9]的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TACE可活化肝星狀細(xì)胞，促進(jìn)纖維化。本研究以超聲剪切波彈性成像(shear-wave elastography， SWE)檢測(cè)肝癌模型兔組織硬度及TACE后瘤周纖維化情況，觀察SWE評(píng)價(jià)肝纖維化的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及主要試劑 12只雄性新西蘭兔，7～8周齡，體質(zhì)量(2.55±0.16)kg，購(gòu)自貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[許可證：SYXK(黔)2018-0001]，根據(jù)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行操作。碘佛醇注射液和罌粟乙碘油注射液(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)，吡柔比星(浙江瀚暉制藥有限公司)，放射免疫沉淀法緩沖液(radioimmunoprecipitation assay buffer，RIPA)組織/細(xì)胞裂解液、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE)凝膠和羊抗兔二抗(北京索萊寶公司)，膠原Ⅰ抗體(NOVUS biologicals com, USA)，膠原Ⅲ抗體(上海愛(ài)必信生物科技有限公司)，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(enhanced chemiluminescence， ECL)曝光液(江蘇親科生物研究中心有限公司)。

1.2 建立VX2肝癌模型 以邁瑞M6Vet便攜式超聲儀引導(dǎo)經(jīng)皮穿刺兔肝左葉，植入VX2肝癌組織塊以建立兔VX2肝癌模型，之后以明膠海綿封堵穿刺針道[10]。

1.3 TACE 采用完全隨機(jī)法將模型兔分為T(mén)ACE組和Sham組，每組6只。于建模后2～3周采用小動(dòng)物麻醉機(jī)進(jìn)行誘導(dǎo)麻醉，保定后置于 Siemens MEGALIX Cat Plus 125/20/40/80數(shù)字減影血管造影機(jī)(digital substraction angiography， DSA)臺(tái)面，以面罩吸入維持麻醉。剝離右側(cè)股動(dòng)脈，以導(dǎo)引導(dǎo)管(145-5091-150，Micro Therapeutics Inc)及導(dǎo)絲(M001508110， FATHOMTM-14， Boston Scientific) 行選擇性肝固有動(dòng)脈造影，觀察局部腫瘤染色[10-11]；之后對(duì)TACE組經(jīng)導(dǎo)管泵入碘化油與2 mg/ml吡柔比星乳劑，至碘油沉積于腫瘤內(nèi)時(shí)結(jié)束栓塞，記錄栓塞劑用量；對(duì)Sham組予生理鹽水2 ml。術(shù)后觀察兔一般狀態(tài)及有無(wú)發(fā)熱、腹瀉、腹股溝區(qū)感染等。

1.4 SWE 術(shù)前及術(shù)后2周采用聲科Aixplorer彩色多普勒超聲儀，以頻率4～15 MHz淺表探頭行腹部超聲檢查，以常規(guī)超聲觀察腫瘤大小，計(jì)算腫瘤體積；啟動(dòng)SWE，測(cè)量腫瘤、瘤周及肝右葉組織硬度，重復(fù)測(cè)量3次，取平均值。

1.5 檢測(cè)血清肝、腎功能指標(biāo) 術(shù)后2周經(jīng)兔中央耳動(dòng)脈采血， 3 000 r/min離心10 min，收集血清并保存于-80℃冰箱內(nèi)，以全自動(dòng)生化分析儀(Chemray 240，深圳雷杜生命科技有限公司)檢測(cè)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase, AST)、肌酐(creatinine, Cr)及血尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)水平。

1.6 病理檢查 取血后處死兔并取腫瘤和瘤周組織，行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色，觀察肝細(xì)胞形態(tài)；行Masson染色， 根據(jù)Metavir評(píng)分[6]進(jìn)行肝纖維化分級(jí)，并于顯微鏡下觀察膠原分布及纖維化程度。

1.7 檢測(cè)蛋白表達(dá) 采用Western blot法，以RIPA組織/細(xì)胞裂解液提取瘤周肝組織總蛋白，再以SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride， PVDF)，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入膠原Ⅰ、膠原Ⅲ和β-actin一抗4℃孵育過(guò)夜，室溫下與二抗共孵育1 h，以ECL發(fā)光液顯色后采用凝膠成像系統(tǒng)獲取蛋白表達(dá)灰度條帶，采用ImageJ軟件分析條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。以±s表示正態(tài)分布的計(jì)量資料，以成組樣本t或校正t(即t’)檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較；對(duì)計(jì)數(shù)資料行χ2檢驗(yàn)。采用Spearman相關(guān)分析評(píng)估相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

12只均建模成功，經(jīng)股動(dòng)脈插管行肝動(dòng)脈造影成功率100%(12/12)，見(jiàn)圖1。TACE組碘油乳劑用量為0.5～1.2 ml，平均(1.02±0.27)ml。2組術(shù)后均未見(jiàn)明顯并發(fā)癥。

圖1 肝動(dòng)脈造影示VX2肝癌兔模型腫瘤富血供，可見(jiàn)“抱球征”(箭)

2.1 常規(guī)超聲和SWE 術(shù)前2組腫瘤體積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。術(shù)后2周TACE組腫瘤回聲不均勻，CDFI未探及明顯血流信號(hào)；Sham組腫瘤體積明顯增大，顯著大于TACE組(P=0.03)，以低回聲為主，CDFI見(jiàn)短條狀血流信號(hào)。見(jiàn)表1。

表1 超聲顯示肝癌模型兔腫瘤體積(cm3，±s)

表1 超聲顯示肝癌模型兔腫瘤體積(cm3，±s)

組別腫瘤體積術(shù)前術(shù)后2周TACE組2.30±1.313.68±1.67Sham組2.75±1.977.10±2.96t值-0.47-2.47P值0.650.03

術(shù)前2組腫瘤、瘤周及肝右葉組織硬度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；術(shù)后2周TACE組腫瘤及瘤周硬度均高于Sham組(P均<0.05)，見(jiàn)表2、圖2。

表2 肝癌模型兔腫瘤、瘤周及肝右葉組織硬度比較(kPa，±s)

表2 肝癌模型兔腫瘤、瘤周及肝右葉組織硬度比較(kPa，±s)

組別腫瘤瘤周肝右葉術(shù)前 TACE組44.17±6.998.98±0.906.52±0.84 Sham組45.22±16.588.17±0.905.95±0.97 t值-0.141.561.09 P值0.890.150.30術(shù)后2周 TACE組57.48±13.7810.61±0.886.99±0.79 Sham組40.76±2.088.96±0.886.62±0.67 t值2.943.250.89 P值0.02<0.010.40

2.2 血清肝、腎功能指標(biāo) 術(shù)前2組血清ALT、AST、BUN及Cr差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；術(shù)后2周，TACE組ALT、AST均高于Sham組(P均<0.05)，組間BUN、Cr差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 肝癌模型兔血清ALT、AST、BUN及Cr比較(±s)

表3 肝癌模型兔血清ALT、AST、BUN及Cr比較(±s)

組別ALT(U/L)AST(U/L)BUN (mg/dL)Cr(μmol/L)術(shù)前 TACE組41.08±11.2739.18±12.7820.86±1.8779.82±14.68 Sham組42.47±7.4336.10±8.7019.52±4.8068.84±12.87 t值-0.250.490.641.38 P值0.810.640.540.20術(shù)后2周 TACE組130.81±74.51151.20±91.9623.39±6.1676.89±16.07 Sham組54.23±10.4231.70±11.8817.60±2.1270.35±8.41 t值2.493.162.180.88 P值0.030.020.070.40

2.3 病理結(jié)果 HE染色顯示TACE組瘤周肝細(xì)胞水腫明顯(圖3)，Sham組瘤周偶見(jiàn)肝細(xì)胞水腫。Masson染色顯示TACE組瘤周膠原纖維多于Sham組，瘤周出現(xiàn)條索狀纖維束并包繞腫瘤(圖4)，Metavir分級(jí)中位數(shù)為F3(F2～3)；Sham組見(jiàn)匯管區(qū)周?chē)w維化，Metavir分級(jí)中位數(shù)為F1(F0～1)；TACE組瘤周纖維化程度高于Sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=3.05，P<0.01)。TACE組膠原Ⅰ和膠原Ⅲ蛋白表達(dá)水平均高于Sham組(圖5)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.78，P<0.01；t=5.92，P<0.01)。

圖3 TACE組和Sham組HE染色圖(×200) A.TACE組，瘤周肝細(xì)胞水腫明顯，細(xì)胞體積增大，胞質(zhì)淡染； B.Sham組，瘤周肝細(xì)胞形態(tài)正常，偶見(jiàn)水腫

圖4 TACE組和Sham組Masson染色圖(×50) A.TACE組，瘤周出現(xiàn)條索狀纖維束，并包繞腫瘤，Metavir分級(jí)F3； B.Sham組，匯管區(qū)周?chē)w維化，Metavir分級(jí)F1

圖5 Western blot法檢測(cè)瘤周膠原蛋白表達(dá) A.電泳圖； B.膠原Ⅰ和膠原Ⅲ蛋白表達(dá)量柱狀圖(**：與Sham組比較，P<0.01)

2.4 相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，瘤周肝纖維化Metavir分級(jí)與其硬度值呈正相關(guān)(r=0.67，P=0.02)，見(jiàn)圖6。

圖6 瘤周肝纖維化分級(jí)與其硬度值的相關(guān)性散點(diǎn)圖

3 討論

臨床多數(shù)肝癌患者需接受多次TACE治療。本研究建立兔VX2肝癌移植瘤模型，并以TACE進(jìn)行治療，結(jié)果顯示TACE后肝損傷及瘤周纖維化加重，與既往研究[4,7]結(jié)果相符，提示化療栓塞劑促進(jìn)肝損傷、加重肝纖維化[7,11]。有學(xué)者[12]認(rèn)為介入治療后肝纖維化加重可能與預(yù)后有關(guān)；亦有研究[13]發(fā)現(xiàn)肝臟硬度可能影響消融治療療效，而肝臟硬度較高是TACE治療后肝癌早期復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[14-15]。瘤周層粘連蛋白表達(dá)增加可能是TACE后瘤周纖維化程度增加的機(jī)制之一[16]。

超聲彈性成像是評(píng)估組織硬度的常用手段。肝臟硬度與肝纖維化程度相關(guān)[17]，故SWE可用于評(píng)估肝纖維化程度[18]。本研究采用SWE檢測(cè)VX2肝癌模型兔的腫瘤、瘤周及肝右葉組織硬度，發(fā)現(xiàn)術(shù)前TACE組與Sham組之間腫瘤、瘤周及肝右葉組織硬度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而術(shù)后2周TACE組腫瘤及瘤周硬度均高于Sham組；且TACE組瘤周肝細(xì)胞水腫明顯，而Sham組偶見(jiàn)肝細(xì)胞水腫； TACE組瘤周出現(xiàn)條索狀纖維束并包繞腫瘤，其Metavir肝纖維化分級(jí)高于Sham組；TACE組膠原Ⅰ和膠原Ⅲ蛋白表達(dá)水平均高于Sham組，進(jìn)一步證實(shí)TACE治療肝癌可加重瘤周纖維化。 Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，瘤周肝纖維化Metavir分級(jí)與其硬度值呈正相關(guān)，提示SWE可用于評(píng)價(jià)瘤周纖維化。但本研究所示瘤周纖維化Metavir分級(jí)與其硬度值的相關(guān)系數(shù)r略低于既往研究[19](r=0.726)，可能與研究對(duì)象不同有關(guān)：既往研究[19]以SWE評(píng)價(jià)人肝纖維化，本研究以肝癌模型兔為觀察對(duì)象，檢查時(shí)不能配合屏住呼吸，可能影響檢測(cè)結(jié)果。

綜上，TACE可加重VX2肝癌模型兔瘤周纖維化；SWE可用于評(píng)估其肝纖維化程度。