陳清清， 吳云麗， 吳一波， 林玉玲， 閆小利， 邱慧娜， 張建明， 鄭廷金， 張志珊

腸球菌對(duì)利奈唑胺耐藥機(jī)制除主要為23S rRNA基因的突變外，移動(dòng)遺傳元件（MGE）相關(guān)的cfr、cfr（B）、optrA、poxtA等獲得性耐藥基因也起重要作用[4]，這些基因可隨著質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子等在不同腸球菌和其他革蘭陽(yáng)性球菌中快速傳播。耐藥基因的存在及傳播不僅加速了細(xì)菌耐藥性的獲得，而且增加了腸球菌相關(guān)感染性疾病的治療難度。通過(guò)細(xì)菌分型可探究各菌株間的克隆關(guān)系，確定病原菌和感染源之間的關(guān)系，可為控制此類耐藥菌的流行和交叉感染提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 采用常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)方法對(duì)福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院2018—2019年的臨床微生物標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，腸球菌屬鑒定采用Phoenix100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏儀（美國(guó)BD公司）及MALDI-TOF細(xì)菌質(zhì)譜鑒定儀（布魯克公司）進(jìn)行鑒定。

1.1.2 抗菌藥物和培養(yǎng)基 抗菌藥物紙片為英國(guó)OXOID公司產(chǎn)品，藥敏試驗(yàn)所用的MH瓊脂培養(yǎng)基為廣州市迪景生物有限公司產(chǎn)品。商品化藥敏板-革蘭陽(yáng)性菌藥敏板PMIC/ID-55為美國(guó)BD公司的Phoenix100檢測(cè)系統(tǒng)配套產(chǎn)品。CAMHB肉湯粉劑為青島海博生物公司產(chǎn)品。利奈唑胺高純度標(biāo)準(zhǔn)品（CAS：165800-03-3）為四川省維克奇生物科技有限公司產(chǎn)品。96孔藥敏培養(yǎng)空板為艾斯特實(shí)驗(yàn)器材公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗(yàn) 采用革蘭陽(yáng)性菌藥敏板PMIC/ID-55（美國(guó)BD公司）檢測(cè)腸球菌的常規(guī)藥敏試驗(yàn)及利奈唑胺的最低抑菌濃度（MIC）；采用藥敏紙片法（K-B法）和肉湯微量稀釋法（MIC法）對(duì)經(jīng)儀器法檢測(cè)出的利奈唑胺不敏感腸球菌（LISE）菌株進(jìn)行確認(rèn)。藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株為糞腸球菌ATCC 29212，參照2019年美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）推薦的抗菌藥物折點(diǎn)判讀結(jié)果。

1.2.2 微量藥敏板的制備 預(yù)制96孔肉湯微量稀釋法的藥敏培養(yǎng)板，根據(jù)純度計(jì)算并稱量藥物配置濃度為1 280 mg/L的儲(chǔ)存液，使用滅菌蒸餾水進(jìn)行倍比稀釋，將倍比稀釋后不同濃度的抗菌藥物溶液分別加到滅菌的96孔聚苯乙烯板中，于A～G的1～11列從上至下第1至第8孔加藥液，每孔50 μL，MIC范圍為0.5～64 mg/L，第12列不加藥作為生長(zhǎng)對(duì)照，加蓋－80℃以下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 統(tǒng)計(jì)分析 采用WHONET 5.6 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.4 同源性分析 采用多位點(diǎn)序列分型（MLST）分析LISE菌株的同源性。

1.2.5 耐藥基因檢測(cè) 采用PCR法檢測(cè)23S rRNA、rplC、rplD、rplV、optrA、poxtA、cfr、cfr（B）利奈唑胺耐藥相關(guān)基因，并使用基因測(cè)序方法驗(yàn)證擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，耐藥基因PCR引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小見(jiàn)表1。

表1 耐藥基因PCR引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物Table 1 Primer sequences for PCR detection of relevant drug resistance genes and amplicon size

2 結(jié)果

2.1 腸球菌屬的菌種分布及藥敏結(jié)果

2018—2019年共檢出腸球菌屬細(xì)菌522株，其中糞腸球菌332株，占63.6%；屎腸球菌121株，占23.2%；其他腸球菌69株，占13.2%，見(jiàn)表2。除利奈唑胺、四環(huán)素外，屎腸球菌對(duì)其他測(cè)試藥物的耐藥率明顯高于糞腸球菌，見(jiàn)表3。經(jīng)MIC法復(fù)核確認(rèn)檢出LISE 44株，均為糞腸球菌，其中中介糞腸球菌（LIEf）16株，占4.8%（16/332），MIC值為4 mg/L；耐藥糞腸球菌（LREf）28株，占8.4%（28/332），有25株MIC值為8 mg/L，3株MIC值為16 mg/L。

表2 522株腸球菌屬的菌種分布Table 2 Species distribution of 522 Enterococcus strains

表3 腸球菌屬細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 3 Susceptibility of Enterococcus species to antimicrobial agents （%）

2.2 LISE菌株的科室和標(biāo)本類型分布

LISE菌株科室分布中泌尿外科占43.2%（19/44），腫瘤科占9.1%（4/44），老年病科和肝膽外科均為6.8%（3/44），其他分別為神經(jīng)外科、胃腸外科、內(nèi)分泌科、甲狀腺外科、燒傷科等；標(biāo)本類型中尿液占52.3%（23/44）、抽出液占18.2%（8/44）、分泌物占13.6%（6/44）、引流液占4.5%（2/44）、其他占11.4%（5/44）。

2.3 LISE菌株的耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

選取與利奈唑胺耐藥相關(guān)的基因23S rRNA、rplC、rplD、rplV、optrA、poxtA、cfr、cfr（B）進(jìn)行檢測(cè)，44株LISE菌株optrA基因陽(yáng)性的23株，cfr基因陽(yáng)性的1株，poxtA基因陽(yáng)性的1株，23S rRNA發(fā)生基因突變（G2601C）的1株，編碼L3核糖體蛋白的rplC基因發(fā)生突變 （C291T、C369T、T107A）的有4株，編碼L4核糖體蛋白的rplD基因發(fā)生突變 （C348T、A144G）的有19株，編碼L22核糖體蛋白的rplV基因未發(fā)生突變，見(jiàn)表4。

表4 LREf和LIEf菌株耐藥基因及耐藥表型Table 4 Drug resistance genes and resistance phenotypes of linezolid-resistant and linezolid-intermediate Enterococcus faecalis strains

2.4 MLST分析

將44株LISE的7個(gè)管家基因（pstS、gdh、gyd、xpt、yiqL、aroE、gki）上傳至 MLST 官網(wǎng)進(jìn)行比對(duì)，共有32個(gè)ST型，其中9株為ST16型，ST480、ST689、ST995、ST985型各2株，其他分別為ST179、ST302、ST975、ST991等，共有13個(gè)新的ST型（ST975、ST976、ST978～ST981、ST984、ST985、ST987、ST990、ST991、ST995、ST1003），見(jiàn)表 5。

表5 44株LISE菌株的MLST分布Table 5 Multilocus sequence typing of 44 linezolid-insensitive Enterococcus strains

3 討論

2018－2019年我院糞腸球菌藥敏結(jié)果顯示其對(duì)利奈唑胺的耐藥率為8.4%，高于CHINET監(jiān)測(cè)網(wǎng)顯示2018－2019年糞腸球菌對(duì)利奈唑胺的耐藥率（2.2%）。從臨床上共分離44株LISE，其中28株為 LREf，16株為 LIEf。28株 LREf的 MIC值為8～16 mg/L，目前對(duì)于腸球菌利奈唑胺耐藥水平的定義尚無(wú)共識(shí)，有文獻(xiàn)建議將MIC范圍為8～16 mg/L定義為低水平的耐藥，將MIC＞64 mg/L定義為高水平的耐藥[5]。低水平的耐藥可能成為發(fā)展更高水平耐藥性的“墊腳石”，這可能導(dǎo)致醫(yī)院“超級(jí)細(xì)菌”的產(chǎn)生[6]。44株LISE分離的科室主要為泌尿外科、腫瘤科、老年病科和肝膽外科，標(biāo)本來(lái)源主要為尿液、抽出液、分泌物、引流液。

23S rRNA的V區(qū)點(diǎn)突變是目前LRE菌株最普遍的耐藥機(jī)制且具有多樣性，主要的突變類型為G2576T，其次為G2447T、G2505A[7]。本研究結(jié)果顯示LRE-EF03的23S rRNA發(fā)生了G2601C點(diǎn)突變，引起了Q867H氨基酸的改變，該菌株同時(shí)攜帶optrA基因，與美國(guó)LEADER項(xiàng)目報(bào)道的腸球菌攜帶optrA基因同時(shí)發(fā)生23S rRNA G2576T的突變位置不同[8]。

我院糞腸球菌檢測(cè)出1株cfr陽(yáng)性的LRE，命名為EF02，該菌株同時(shí)攜帶optrA，利奈唑胺對(duì)其的MIC值為8 mg/L，基因型為ST330。cfr編碼一種rRNA甲基轉(zhuǎn)移酶，可引起唑烷酮類、氯霉素類、林可霉素類、截短側(cè)耳素類和鏈霉菌素A耐藥和大環(huán)內(nèi)酯類敏感性下降[9]。自2012年首次報(bào)道了由質(zhì)粒攜帶cfr基因介導(dǎo)人源糞腸球菌（ST16）對(duì)利奈唑胺耐藥以來(lái)[10]，逐漸出現(xiàn)了一些類似的報(bào)道[11-14]。2015年Wang 等[11]第一次報(bào)道了optrA耐藥基因來(lái)自于國(guó)內(nèi)人和動(dòng)物分離的腸球菌，為cfr之后報(bào)道的第2個(gè)可轉(zhuǎn)移性利奈唑胺耐藥基因，該基因很容易在腸球菌之間轉(zhuǎn)移[11，15-16]。本研究44株LISE菌株optrA基因陽(yáng)性的有23株，占52.3%，其中21株為L(zhǎng)REf，2株為L(zhǎng)IEf。2018年報(bào)道了在意大利臨床分離的高度耐利奈唑胺MRSA中檢測(cè)到1種新的耐藥基因poxtA，其在金黃色葡萄球菌、腸球菌中的表達(dá)可導(dǎo)致對(duì)酚類、唑烷酮類和四環(huán)素類藥物敏感性降低[17]。2019年國(guó)內(nèi)研究者發(fā)現(xiàn)了1株豬源糞腸球菌攜帶了1個(gè)具有optrA和poxtA基因的質(zhì)粒[18]，我院LRE菌株中亦發(fā)現(xiàn)了EF94同時(shí)攜帶optrA和poxtA。根據(jù)目前文獻(xiàn)報(bào)道，EF02和EF94均為國(guó)內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)同時(shí)攜帶兩種耐藥基因的人源糞腸球菌。

核糖體蛋白L3、L4或L22突變可能是造成利奈唑胺非轉(zhuǎn)移性耐藥的另一種機(jī)制。有研究顯示由rplC和rplD編碼的核糖體蛋白L3和L4保守結(jié)構(gòu)域的改變與利奈唑胺非敏感腸球菌（MIC 4～8 mg/L）有一定的相關(guān)性[19]。本研究的44株LISE中有23株發(fā)生點(diǎn)突變（rplC4株，rplD19株），其中只有LIEf-EF04的rplC發(fā)生了L36del （T107A）突變，其他22株雖發(fā)生點(diǎn)突變但并未引起氨基酸的改變，其中13株合并optrA且有11株為L(zhǎng)RE。

MLST分析顯示44株LISE可分為32個(gè)不同的ST型，ST16最為多見(jiàn)（9/44）且有7株攜帶optrA，利奈唑胺對(duì)其的MIC值為8～16 mg/L，與國(guó)內(nèi)劉暢[20]和樓亞玲[21]報(bào)道的LRE菌株中ST16（均攜帶optrA）為最常見(jiàn)型別一致。而與葡萄牙[22]檢出的optrA陽(yáng)性糞腸球菌的基因型為ST476（5/28） 和 ST585（3/28） 不 一 致。44株LISE出現(xiàn)了新的ST型，說(shuō)明菌株也在不斷進(jìn)化以應(yīng)對(duì)艱難的生存環(huán)境。ST16-179-302-985復(fù)合群（EF13、EF29、EF34、EF42、EF43、EF51、EF60、EF78） 與 ST480-689復(fù) 合 群（EF04、EF16、EF58、EF86）分布在泌尿外科，提示泌尿外科存在ST16型與ST480為主的多克隆傳播現(xiàn)象。其他ST型菌株分布于各個(gè)科室，呈散在流行，不存在院內(nèi)克隆傳播。

LRE菌株optrA的高攜帶率表明其為我院LRE的主要耐藥機(jī)制，且可作為利奈唑胺耐藥性篩查的有效分子標(biāo)志。另外，需要進(jìn)一步常規(guī)和持續(xù)篩選患者攜帶optrA基因菌株的危險(xiǎn)因素，這些因素可能與利奈唑胺耐藥性的快速傳播有關(guān)。44株LISE中有9株未發(fā)現(xiàn)其他耐藥機(jī)制。細(xì)菌生物膜的形成在細(xì)菌適應(yīng)性耐藥方面被認(rèn)為能夠?qū)е录?xì)菌耐藥性增強(qiáng)，因此不能排除生物膜形成有助于降低對(duì)利奈唑胺敏感性的可能性。有研究通過(guò)透射電子顯微鏡進(jìn)行觀察比較利奈唑胺敏感腸球菌與LISE的生物膜，與敏感株相比，LISE的菌體細(xì)胞壁往往更厚[23]。生物膜是否參與了LISE對(duì)利奈唑胺的耐藥形成有待進(jìn)一步探究。