張 喆，鞏秀玉，蘭麗麗，王學(xué)鋒，馬勝偉，陳海剛，張林寶

1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所/廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源環(huán)境重點(diǎn)野外科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站/廣東珠江口生態(tài)系統(tǒng)野外科學(xué)觀測研究站，廣東 廣州 510300

2. 廣州海關(guān)技術(shù)中心，廣東 廣州 510623

3. 南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524025

4. 廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088

細(xì)胞色素P450酶是依賴血紅素的多功能氧化酶，在內(nèi)源物質(zhì)合成及外源物質(zhì)的代謝轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用[1]。CYPs為超基因家族，廣泛存在于微生物[2]、植物[3]和動物[4]體內(nèi)。截至2017年，已有超過41 000條P450基因序列被克隆和命名[5]。CYPs包含許多家族，在無脊椎動物中已發(fā)現(xiàn)70多個(gè)CYPs家族[6]。CYP1～4家族在生物體I相解毒系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用[7]。CYP1A亞家族作為CYP1家族的重要成員，可催化多種底物代謝。海洋魚類Cyp1a基因的表達(dá)可被多氯聯(lián)苯 (Polychlorinated biphenyls, PCBs) 和多環(huán)芳烴 (Polyaromatic hydrocarbons, PAHs) 等多種外源物質(zhì)誘導(dǎo)，且其表達(dá)量與污染物含量顯著相關(guān)[8]，故常被用作環(huán)境監(jiān)測的生物標(biāo)志物。因此，CYPs基因序列的獲得及應(yīng)用對海洋環(huán)境監(jiān)測和海洋生物保護(hù)有重要意義。

多溴聯(lián)苯醚類物質(zhì) (Polybrominated diphenyl ethers, PBDEs) 具有親脂性、持久性和生物蓄積性等與PCBs相似的性質(zhì)[9]，是我國近岸海域環(huán)境中典型的持久性有機(jī)污染物[10-11]。在209種PBDEs同系物中，BDE-209溴原子含量最高，是目前唯一仍可商業(yè)化使用的PBDEs，因此也是目前海洋環(huán)境中含量較高的PBDEs污染物[12]。BDE-3則是溴原子含量最低的PBDEs，環(huán)境中的BDE-3主要通過高溴原子PBDEs的光降解和生物降解產(chǎn)生，是PBDEs光降解最為豐富的產(chǎn)物之一[13-14]。PBDEs可以影響魚類的生殖發(fā)育[15]、免疫[16]和行為[17]等。已有研究表明，BDE-47和BDE-99可以誘導(dǎo)斑馬魚 (Danio rerio)Cyp1a基因表達(dá)[18]，大西洋鮭(Salmo salar) 肝臟細(xì)胞Cyp1a基因表達(dá)在 BDE-47脅迫下顯著上調(diào)[19]，而商業(yè)化五溴聯(lián)苯醚 (Penta-BDE) 和八溴聯(lián)苯醚 (Octa-BDE) 混合物則未對大西洋鮭Cyp1a表達(dá)產(chǎn)物7-乙氧基香豆素-O-脫乙基酶(EROD)活性產(chǎn)生影響[20]?？梢婔~類Cyp1a基因的表達(dá)可受到PBDEs的影響，但不同PBDEs的作用機(jī)制不同。因此，分析不同溴代PBDEs對魚類Cyp1a基因的影響，有助于深入探討PBDEs的毒性機(jī)制。

紫紅笛鯛 (Lutjanus argentimaculatus) 為廣鹽性魚類，在印度太平洋地區(qū)廣泛分布，是我國東南沿海重要的增養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)種類。2016年，其養(yǎng)殖產(chǎn)量和捕撈量分別達(dá)到 10 240 和9 815 t[21]。從數(shù)量和分布來看，其可作為我國東南沿海潛在的環(huán)境監(jiān)測生物。鑒于此，本文以紫紅笛鯛為實(shí)驗(yàn)生物，克隆獲得Cyp1acDNA全長，對其氨基酸序列進(jìn)行同源性分析及mRNA的組織表達(dá)分析。進(jìn)而分析了不同濃度BDE-3和BDE-209脅迫對紫紅笛鯛肝臟Cyp1a表達(dá)和EROD活性的影響，初步探討了兩種PBDEs脅迫對紫紅笛鯛Cyp1a表達(dá)影響的異同。結(jié)果可充實(shí)海洋魚類CYPs基因數(shù)據(jù)庫，為深入探討PBDEs對海洋生物的毒性機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及試劑

紫紅笛鯛幼魚體長 (8.29±0.53) cm、體質(zhì)量(15.07±0.26) g，購自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所深圳試驗(yàn)基地。將魚取回后，在實(shí)驗(yàn)條件下暫養(yǎng) 7 d，水溫 (26.3±0.5) ℃，pH 8.1±0.2，鹽度33.5±0.8，光照強(qiáng)度 600～700 lx，光周期為 12 L∶12 D。每天投喂人工配合飼料2次，并于第2次投喂1 h后換水，暫養(yǎng)期間保證實(shí)驗(yàn)用魚日死亡率低于1%。實(shí)驗(yàn)用BDE-3 (CAS#101-55-3，純度99%)購自美國Sigma-Aldrich公司，BDE-209 (CAS#1163-19-5，純度>97%) 購自美國 AccuStandard 公司。實(shí)驗(yàn)用其他化學(xué)試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，為國產(chǎn)分析純。分子試劑及試劑盒除特殊標(biāo)注外，均購自寶日醫(yī)生物技術(shù) (北京) 有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紫紅笛鯛組織樣品采集

暫養(yǎng)結(jié)束后，隨機(jī)選取7尾魚進(jìn)行解剖。其中1尾取其肝臟組織，液氮冷凍保存，用于Cyp1a基因的克??；剩余6尾解剖后，分別取其肝臟、鰓、腎臟、腦、腸和肌肉組織，液氮速凍，?80 ℃保存，用于Cyp1a基因的組織表達(dá)分析。

1.2.2Cyp1a基因中間片段的獲得

使用 TRIzol?Reagen t (Cat. # 15596026，Thermo Scientific，美國) 提取紫紅笛鯛肝臟總RNA，并利用 Reverse Transcriptase M-MLV 進(jìn)行 cDNA 的合成，具體方法參照試劑盒說明書。于GenBank數(shù)據(jù)庫搜集石頜鯛 (Lithognathus mormyrus, AF264037.1)、金鯛 (Sparus aurata, AF011223.1)、真鯛 (Pagrus major, EU163982.1)、黑棘鯛 (Acanthopagrus schlegelii,DQ898145.1) 和門齒鯛 (Stenotomus chrysops, U14162.1)等近緣物種的Cyp1a核酸序列進(jìn)行簡并引物設(shè)計(jì)(表1)。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in experiment

以合成的cDNA為模板，以cyp1a-F和cyp1a-R為引物，進(jìn)行Cyp1a基因中間片段的克隆。PCR反應(yīng)體系的配制參照Taq酶使用說明書 (TaKaRaTaq?)。PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃ 變性 5 min；94 ℃變性 30 s，60 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 30 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物回收純化后，送至生工生物工程 (上海) 股份有限公司測序，結(jié)果得到272 bp的Cyp1a基因中間片段。

1.2.3Cyp1a基因 cDNA 全長克隆

取紫紅笛鯛肝臟組織提取mRNA后，利用SMARTer? RACE 5'/3' Kit (Clontech Laboratories,Inc.，美國) 進(jìn)行第一鏈cDNA合成。根據(jù)克隆獲得的中間片段設(shè)計(jì) 5'及 3' RACE 特異性引物 (表1)。參照試劑盒說明書配制PCR反應(yīng)體系，利用巢式PCR (PCR反應(yīng)條件參照說明書) 依次擴(kuò)增得到Cyp1a基因5'和3'末端序列并進(jìn)行測序，對測序的5'和3'序列進(jìn)行拼接得到紫紅笛鯛Cyp1acDNA全長序列。

1.2.4Cyp1a基因序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

使用 DNAMAN 軟件 (Lynnon Biosoft，美國)查找Cyp1a開放閱讀框，利用BlastP在GenBank中尋找同源序列，利用CLUSTAL方法進(jìn)行多重序列比較。利用在線工具分別進(jìn)行推導(dǎo)氨基酸分子量和等電點(diǎn) (Prot-Param)、蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn) (Net-Phos 3.1 Server)、糖基化位點(diǎn) (NetNGlyc 2.0 Server)、蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測 (TMHMM ser-vices 2.0) 和蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 (SWISS-Model)。使用MEGA 7.0軟件包[23]，采用鄰接法 (Neighborjoining) 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.5Cyp1a基因組織表達(dá)分析

應(yīng)用RT-PCR方法分析Cyp1a基因在紫紅笛鯛各組織表達(dá)情況。將紫紅笛鯛各組織分別提取mRNA 后反轉(zhuǎn)錄為 cDNA (PrimeScript? RT reagent Kit)，配制熒光定量反應(yīng)液 (TB Green?Fast qPCR Mix)，各試劑使用量參照試劑盒說明書。使用羅氏LC480熒光定量PCR儀進(jìn)行不同組織基因表達(dá)分析，熒光定量PCR反應(yīng)條件參照試劑盒說明書。PCR反應(yīng)結(jié)束后，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行溶解曲線分析，同時(shí)取PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收測序以確定產(chǎn)物為單一目的基因。

1.2.6 BDE-3 和 BDE-209 脅迫實(shí)驗(yàn)及樣品采集

選擇健康、規(guī)格整齊的紫紅笛鯛幼魚480尾用于脅迫實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)容器為500 L玻璃鋼材質(zhì)育苗桶。實(shí)驗(yàn)設(shè)置1個(gè)空白對照組 (CK組)，1個(gè)溶劑對照組 (SCK 組)、3個(gè) BDE-3脅迫組 (10、50和250 μg·L?1，分別命名為 E2、E3 和 E4 組)和 3 個(gè) BDE-209 脅迫組 (10、50 和 250 μg·L?1，分別命名為T2、T3和T4組)，在溶劑對照組中加入實(shí)驗(yàn)組同體積的DMSO。每組60尾魚，設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行20尾，PBDEs連續(xù)脅迫15 d，期間每天換水1次，早晚各投喂人工配合飼料1次。分別于脅迫的第3、第7 和第15 天取樣。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組、每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)取魚6尾，將其肝臟樣品分別取出后即刻用液氮速凍，?80 ℃保存，用于Cyp1a基因表達(dá)分析和EROD酶活性的測定。

1.2.7 紫紅笛鯛肝臟Cyp1a表達(dá)及 EROD 活性分析

紫紅笛鯛肝臟Cyp1a基因的RT-PCR分析方法同1.2.5。紫紅笛鯛肝臟微粒體制備、微粒體酶蛋白的提取及EROD活性的測定參照余銘恩等[24]，使用快速熒光光度法對EROD活性進(jìn)行測定，單位以 nmol·(min·mg)?1表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

Cyp1a表達(dá)量分析采用△△Ct法[25]。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 (SD)”表示，所得數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析 (One-way AVOVA)，用Duncan's法對平均值進(jìn)行多重比較，顯著性水平為P<0.05。利用Excel 2010軟件進(jìn)行相關(guān)性分析和作圖。

2 結(jié)果

2.1 紫紅笛鯛 Cyp1a 基因序列分析

紫紅笛鯛Cyp1a基因cDNA全長為2 540 bp(GenBank登錄號：MH973703)，開放閱讀框?yàn)? 566 bp，編碼 521 個(gè)氨基酸。cDNA 包含 144 個(gè)堿基的5'非編碼區(qū)、830個(gè)堿基的3'非編碼區(qū)及終止密碼子TAG，并含有一個(gè)多聚腺苷酸信號 (AAT AAA) 和一個(gè) poly (A) 尾。起始密碼子 ATG 位于145—147位核苷酸，且在?3位置為嘌呤堿基 (A)，+4位置為G，符合典型的kozak結(jié)構(gòu)。因此，該cDNA編碼一個(gè)全長蛋白質(zhì) (圖1)。該基因所編碼蛋白的推導(dǎo)分子量為59 255.32 ku，理論等電點(diǎn)為6.05，分子式為 C2 658H4 169N711O767S28。推導(dǎo)氨基酸在46—53有一個(gè)脯氨酸/甘氨酸豐富區(qū) (PGPKPLP)，在 308—326和 456—465分別為硬骨魚類CYP1A特征序列(SDEKIVGIVNDLFGAGFDT) 和血紅素蛋白結(jié)合核心區(qū)特征序列 (FGMGKRRCIG)?？拷t素蛋白結(jié)合區(qū)附近，為CYPs的不變序列(PSSFNPDRF)，位于氨基酸的429—437位。此外，在推導(dǎo)氨基酸時(shí)發(fā)現(xiàn)6個(gè)底物識別位點(diǎn) (Substrate recognition sites, SRSs)，分別位于氨基酸110—129、224—231、264—277、315—331、384—397和496—505位。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析顯示，該序列有48個(gè)磷酸化位點(diǎn)，分別為27個(gè)絲氨酸 (Ser)、16 個(gè)蘇氨酸 (Thr) 和 5 個(gè)酪氨酸 (Tyr)，未發(fā)現(xiàn)糖基化位點(diǎn)、信號肽及跨膜結(jié)構(gòu)，說明其為胞內(nèi)產(chǎn)物。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，CYP1A蛋白存在52.02%的α-螺旋、5.76%的β-折疊和42.22%的無規(guī)則卷曲。蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)建模所用模板蛋白為人類細(xì)胞色素P450 1A1 (PBD登錄號：4i8v)，本序列與模板序列一致度為57.87%，其 GMQE (Global model quality estimation) 評分為0.76，表明該模型的可靠性較高，QMEAN評分為?0.37，表明待測蛋白與模板蛋白的匹配度較好(圖2)。

圖1 紫紅笛鯛Cyp1a核苷酸序列及其推導(dǎo)氨基酸序列Fig. 1 Nucleotide and deduced amino acid sequence of Cyp1a of L. argentimaculatus

圖2 紫紅笛鯛CYP1A二級 (a) 和三級結(jié)構(gòu) (b) 預(yù)測Fig. 2 Prediction of secondary structure (a) and tertiary structure (b) of L. argentimaculatus CYP1A

2.2 同源性分析

多序列比對分析顯示，紫紅笛鯛CYP1A與花鱸 (Lateolabrax maculatus, QQL94697.1)、尖吻鱸 (Lates calcarifer, XP_018552995.1)、高體鰤 (Seriola dumerili, XP_022601069.1)、大西洋庸鰈 (Hippoglossus hippoglossus, XP_034430519.1)、狹鱗庸鰈(H. stenolepis, XP_035011139.1)、舌齒鱸 (Dicentrarchuslabrax, CAB63650.1)、龍膽石斑魚 (Epinephelus lanceolatus, XP_033474241.1) 和褐菖鲉 (Sebastiscus marmoratus,APT40582.1) CYP1A蛋白質(zhì)序列相似性分別為92.69%、91.94%、91.94%、91.75%、91.75%、91.68%、90.98%和90.60% (圖3)。與上述序列血紅素蛋白結(jié)合區(qū)等CYPs特征區(qū)域均高度保守。將該序列提交至國際P450命名委員會 (Standardized Cytochrome P450 Nomenclature Committee)，被命名為紫紅笛鯛Cyp1a基因。

圖3 紫紅笛鯛CYP1A推導(dǎo)氨基酸多重序列比較Fig. 3 Multiple sequence alignment of deduced amino acid sequence of CYP1A of L. argentimaculatus

由進(jìn)化樹分析結(jié)果可知，紫紅笛鯛CYP1A與白梭吻鱸 (Sander lucioperca, XP_031137387.1) 進(jìn)化地位最近，與龍膽石斑魚、鞍斑杜父鱸鰧 (Cottoperca gobio, XP_029282397.1)、睛斑鰻狼魚 (Anarrhichthys ocellatus, XP_031704348.1)、褐菖鲉、蔭平鲉(Sebastes umbrosus, XP_037652197.1) 和許氏平鲉(S. schlegelii, AWN64552.1) 等硬骨魚類聚為一支(圖4)。

圖4 紫紅笛鯛CYP1A進(jìn)化樹分析Fig. 4 Phylogenetic analysis of L. argentimaculatus CYP1A

2.3 紫紅笛鯛 Cyp1a 基因組織表達(dá)

圖5為Cyp1a基因在紫紅笛鯛的組織分布。結(jié)果表明，Cyp1a基因在實(shí)驗(yàn)采集的各組織中均有表達(dá)且存在組織表達(dá)差異。其中肝臟表達(dá)量最高 (P<0.05)，其次為腦和鰓，肌肉組織中表達(dá)量最低 (P<0.05)。

圖5 Cyp1a mRNA在紫紅笛鯛的組織表達(dá)注：不同字母代表存在顯著性差異(P<0.05)， 后圖同此。Fig. 5 Tissue expression of Cyp1a mRNA in L. argentimaculatusNote:Different ltters represent significant dfference (P<0.05). The same case in fllowing figures.

2.4 BDE-3 和 BDE-209 對紫紅笛鯛肝臟 Cyp1a 基因表達(dá)和EROD活性的影響

紫紅笛鯛肝臟組織Cyp1a基因在BDE-3和BDE-209脅迫下的響應(yīng)見圖6。BDE-3脅迫7 d后，E3和E4組Cyp1a基因表達(dá)被顯著抑制，分別為CK組的69.61%和45.48%。15 d時(shí)E3和E4組Cyp1a表達(dá)量仍顯著低于對照組 (P<0.05)。與BDE-3不同，BDE-209脅迫7 d后，T4組Cyp1a基因表達(dá)顯著上調(diào)。脅迫15 d，T3和T4組Cyp1a基因表達(dá)量分別為對照組的7.99和11.17倍 (P<0.05)。而低濃度 BDE-3 (E2 組) 和 BDE-209 (T2組) 則未對Cyp1a基因表達(dá)產(chǎn)生顯著影響 (P>0.05)。

圖6 BDE-3 (a) 和BDE-209 (b) 脅迫對紫紅笛鯛肝臟Cyp1a基因表達(dá)的影響Fig. 6 Effects of BDE-3 (a) and BDE-209 (b) on Cyp1a expression in liver of L. argentimaculatus

與Cyp1a相似，整個(gè)脅迫實(shí)驗(yàn)期間，E2組EROD活性與對照組無顯著差異 (P>0.05，圖7)。脅迫7 d時(shí)，E3和E4組EROD活性顯著下降 (P<0.05)，分別為對照組的63.96%和72.24%。15 d時(shí)E4組EROD活性仍顯著低于對照組，為對照組的78.29%，而E3組與對照組無顯著差異 (P>0.05)。BDE-209則對紫紅笛鯛肝臟EROD活性呈現(xiàn)誘導(dǎo)效應(yīng)。脅迫7 d，T4組EROD活性顯著升高，為對照組的1.37倍。脅迫15 d時(shí)，T3和T4組EROD活性均顯著高于對照組 (P<0.05)，分別為對照組的1.48和2.7倍。BDE-209脅迫3 d，各實(shí)驗(yàn)組與對照組EROD活性無顯著差異 (P>0.05)。將各實(shí)驗(yàn)組Cyp1a基因表達(dá)量與EROD活性進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示兩者呈顯著的正相關(guān)關(guān)系 (R2=0.590，P<0.001，圖8)。

圖7 BDE-3 (a) 和BDE-209(b) 脅迫對紫紅笛鯛肝臟EROD活性的影響Fig. 7 Effects of BDE-3 (a) and BDE-209 (b) on EROD activities in liver of L. argentimaculatus

圖8 Cyp1a基因表達(dá)量與7-乙氧基香豆素-O-脫乙基酶活性相關(guān)性分析Fig. 8 Correlation between Cyp1a relative expression and EROD activity

3 討論

3.1 紫紅笛鯛 Cyp1a 基因序列及組織表達(dá)

P450酶系可催化多樣性底物，其中海洋魚類CYP1A亞家族基因表達(dá)及酶活性的改變常被用作海洋污染物監(jiān)測的早期預(yù)警信號，而魚類Cyp1a基因的獲得是實(shí)現(xiàn)其環(huán)境監(jiān)測應(yīng)用的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)首次克隆獲得了紫紅笛鯛Cyp1a基因cDNA序列全長，也是在其體內(nèi)首次獲得細(xì)胞色素P450基因。紫紅笛鯛CYP1A序列具有CYPs核苷酸高度保守的血紅素結(jié)合區(qū)序列 (FxxGxRxCxG)、不變序列 (PxxFxPE/DRF)[26]和硬骨魚類CYP1A特征序列 (SDEKIVGIVNDLFGAGFDT)[27]，有 6 個(gè) SRS用于識別并結(jié)合底物，是典型的P450酶[28]。肝臟是環(huán)境污染物積累、生物轉(zhuǎn)化和代謝的主要器官[29]，Cyp1a基因在外源物質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用，因而一般在肝臟中的表達(dá)量較高[30]。本研究表明，紫紅笛鯛Cyp1a基因在肝臟中的表達(dá)量最高，其次是腦和鰓，肌肉中表達(dá)量最低。其組織表達(dá)模式與虹鱒 (Oncorhynchus mykiss)[31]和青鳉(Oryzias latipes)[32-33]等魚類Cyp1a基因的組織表達(dá)模式相似，提示紫紅笛鯛Cyp1a基因的功能與其他魚類相似，主要參與外源物質(zhì)的代謝，使其具有一定的組織表達(dá)特性。鑒于此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇紫紅笛鯛肝臟作為靶器官，用于評價(jià)BDE-3和BDE-209對Cyp1a基因表達(dá)的影響。7-乙氧基香豆素(7-ethoxyresorufin) 的脫乙基反應(yīng)主要由CYP1A家族酶催化，因此EROD活性的上升可用來指征Cyp1a基因表達(dá)的上調(diào)[34]。本研究結(jié)果顯示，PBDEs脅迫下，紫紅笛鯛肝臟Cyp1a基因表達(dá)量與EROD活性呈顯著正相關(guān)關(guān)系，這與以往研究結(jié)果一致[22]，說明紫紅笛鯛肝臟EROD活性可以反映Cyp1a基因的表達(dá)情況。鑒于此，在后續(xù)的討論中將紫紅笛鯛Cyp1a基因表達(dá)和EROD活性結(jié)果相結(jié)合進(jìn)行分析討論。

3.2 Cyp1a 和 EROD 對 BDE-3 和 BDE-209 脅迫的響應(yīng)

魚類Cyp1a基因表達(dá)和EROD活性受到環(huán)境有機(jī)物[35]、藥物[36]和農(nóng)藥[37]等多種外源物質(zhì)的影響。然而，有關(guān)PBDEs污染物對海洋魚類Cyp1a基因及EROD的影響研究較為有限。本研究選擇具有一定代表性的PBDEs污染物BDE-3和BDE-209，以分析紫紅笛鯛Cyp1a基因?qū)Σ煌逶雍縋BDEs脅迫的響應(yīng)。結(jié)果表明，低濃度BDE-209 (10 μg·L?1) 對紫紅笛鯛Cyp1a和 EROD 未產(chǎn)生顯著影響。遲瀟等[38]分析了BDE-47和BDE-153 對半滑舌鰨 (Cynoglossus semilaevis) EROD 活性的影響，發(fā)現(xiàn)只有當(dāng)上述兩種污染物濃度較高時(shí)(>500 ng·L?1)，EROD 活性才被顯著誘導(dǎo)，這與本研究結(jié)果一致。高濃度 (50～250 μg·L?1) BDE-209 脅迫7～15 d，紫紅笛鯛肝臟Cyp1a表達(dá)量和EROD活性均顯著升高，且呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。這一現(xiàn)象在其他生物體內(nèi)也有發(fā)現(xiàn)。0.2 mg·kg?1BDE-209口飼大鼠28 d，可以顯著誘導(dǎo)其Cyp1a基因的表達(dá)[39]。Wang 等[40]的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，0.01～0.1 μg·L?1BDE-209可以顯著誘導(dǎo)莫桑比克羅非魚 (Mossambica tilapia) 肝臟EROD活性。上述結(jié)果說明紫紅笛鯛Cyp1a基因和EROD活性可以作為環(huán)境中較高濃度 (>50 μg·L?1) BDE-209 污染的潛在生物標(biāo)志物。

BDE-3屬于低溴代PBDEs，可以引起海洋生物的氧化損傷[41]。然而，與BDE-209相比，有關(guān)BDE-3對海洋魚類毒性效應(yīng)的研究較少，可供參考的數(shù)據(jù)非常有限。本研究發(fā)現(xiàn)，與BDE-209相反，高濃度 (50～250 μg·L?1) BDE-3 脅迫下，紫紅笛鯛肝臟Cyp1a基因表達(dá)和EROD活性被顯著抑制。較之低溴代的BDE-3，BDE-209因具有較高的疏水性和較低的揮發(fā)性，生物毒性較低[42]，這可能是導(dǎo)致兩者對紫紅笛鯛Cyp1a表達(dá)和EROD活性影響存在差異的原因之一。由于較高的生物毒性，當(dāng)BDE-3濃度較高時(shí)，會對生物體產(chǎn)生不利影響，此時(shí)生物體可能會自發(fā)產(chǎn)生抑制劑，EROD的催化功能被抑制，EROD活性下降，以起到對自身的保護(hù)作用[43-44]。與此同時(shí)，高濃度的BDE-3也可能對紫紅笛鯛的肝臟組織造成損傷。S?fteland等[19]研究發(fā)現(xiàn)，BDE-47及PBDEs混合物脅迫大西洋鮭的肝臟細(xì)胞，其Cyp1a基因的表達(dá)被抑制，可能由上述污染物引起肝臟細(xì)胞凋亡所致。這也提示在今后的研究中，應(yīng)對肝臟細(xì)胞損傷和凋亡等指標(biāo)進(jìn)行測定，以對PBDEs毒性機(jī)制進(jìn)行更加全面和深入的探討。與此同時(shí)，魚類的性別、發(fā)育階段及飼料等可以改變其體內(nèi)的激素水平，進(jìn)而影響Cyp1a基因的表達(dá)，在評價(jià)Cyp1a基因作為生物標(biāo)志物時(shí)應(yīng)充分考慮上述因素的影響[44]，因此開展PBDEs對不同種類、不同發(fā)育階段海洋魚類的毒性效應(yīng)研究，對于系統(tǒng)地評價(jià)PBDEs的毒性機(jī)制具有重要意義。

3.3 BDE-3 和 BDE-209 對 Cyp1a 和 EROD 影響的差異

BDE-3和BDE-209脅迫下，紫紅笛鯛Cyp1a基因表達(dá)量和EROD活性變化存在明顯差異，很可能與Cyp1a基因表達(dá)的調(diào)控通路有關(guān)。哺乳動物Cyp1a基因的表達(dá)與芳香烴受體基因 (Arylhydrocarbon receptor,AhR) 有關(guān)。AhR為配體激活型受體，外源物質(zhì)可作為配體與AhR結(jié)合，從而誘導(dǎo)生物體Cyp1a基因的表達(dá)及EROD活性的增加[45-46]。有些PBDEs在分子和物理化學(xué)性質(zhì)上與PCBs等二噁英類污染物相似[47]，可以激活A(yù)hR的表達(dá)[42]。Yang等[43]發(fā)現(xiàn)BDE-99可作為AhR的瞬間配體誘導(dǎo)斑馬魚肝臟細(xì)胞Cyp1a基因的表達(dá)，而BDE-47則未對Cyp1a的表達(dá)產(chǎn)生影響。BDE-47、BDE-99 和 BDE-153 可以抑制鯉魚 (Cyprinus carpio)肝臟細(xì)胞EROD活性，而BDE-100則未對EROD活性產(chǎn)生影響[48]。Whal等[49]發(fā)現(xiàn)商業(yè)化BDE-47中微量的溴化呋喃污染，也可能會誘導(dǎo)AhR基因的表達(dá)?？梢娪捎赑BDEs同系物溴原子含量及純度的差異，使其對AhR的作用不盡相同，這可能是造成BDE-3和BDE-209對紫紅笛鯛Cyp1a表達(dá)影響不同的原因之一。與此同時(shí)，與哺乳動物不同，魚體內(nèi)可能存在不止一個(gè)AhR基因。如在大西洋鳉魚 (Fundulus heteroclitus) 體內(nèi)發(fā)現(xiàn) 2 個(gè)AhR旁系同源基因 (AhR1和AhR2)，兩者在魚體內(nèi)可能發(fā)揮不同的功能[50]。不同魚種體內(nèi)的AhR基因與同一污染物的結(jié)合能力存在差別[51]，即便被同一污染物脅迫，不同魚類AhR及其下游基因的響應(yīng)也會存在差異。目前，紫紅笛鯛AhR基因的克隆并未見報(bào)道，因此其AhR基因的數(shù)量及功能尚不清楚。在今后的工作中可對紫紅笛鯛AhR基因進(jìn)行克隆及功能驗(yàn)證，以更好地解釋其Cyp1a基因?qū)Σ煌琍BDEs響應(yīng)的差異。

4 結(jié)論

本研究首次克隆獲得紫紅笛鯛Cyp1a基因，該基因在肝臟組織中表達(dá)量最高。在BDE-3和BDE-209脅迫下，紫紅笛鯛肝臟Cyp1a基因表達(dá)和EROD活性分別顯著下調(diào)和上調(diào)，且存在劑量-效應(yīng)。本研究結(jié)果提示不同PBDEs污染物對紫紅笛鯛Cyp1a基因表達(dá)影響的作用機(jī)制可能存在差異，為評價(jià)PBDEs對海洋魚類的毒性機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。