魏浩飛 孫海濱 王川 李新江

河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院普外科，河北石家莊 050000

胃腺癌是常見(jiàn)的胃腸道惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率較高[1]。早期胃腺癌以手術(shù)治療為主，晚期則以化療、免疫等綜合治療為主，但患者仍會(huì)出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致死亡[2-3]。深入研究胃腺癌發(fā)生機(jī)制，尋找新的診斷治療靶點(diǎn)，對(duì)胃腺癌早期診治意義重大。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）ADPGKAS1 基因位于人類(lèi)11 號(hào)染色體，廣泛表達(dá)于骨髓、腎臟及前列腺等組織[4]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)[5-6]，lncRNA ADPGKAS1 在多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)。微小RNA（microRNA，miR）-1301-3p 基因位于2q23.3，編碼基因包含有一個(gè)外顯子。研究表明[7-8]，食管癌、胰腺癌等惡性腫瘤中miR-1301-3p 表達(dá)上調(diào)，其作為一種促癌基因，通過(guò)激活糖原合酶激酶3β，促進(jìn)腫瘤的惡性增殖。有研究報(bào)道[9]，lncRNA ADPGK-AS1 能夠作為分子支架結(jié)合miRNA，促進(jìn)腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移。目前l(fā)ncRNA ADPGK-AS1、miR-1301-3p 在胃腺癌中表達(dá)及相關(guān)性的研究報(bào)道較少，本文就此進(jìn)行分析，以期為臨床工作提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2016 年5 月至2018 年5 月河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“我院”）收治的142 例胃腺癌患者。男80 例，女62 例；年齡35～80 歲，平均（58.6±6.6）歲；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：有43 例，無(wú)99 例；腫瘤直徑：＜5 cm 85 例，≥5 cm 57 例；腫瘤位置：胃底部和胃體部39 例，幽門(mén)部和胃竇部103 例；腫瘤分期：Ⅰ～Ⅱ期92 例，Ⅲ期50 例；腫瘤分化程度：高中分化92 例，低分化50 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①由病理檢查明確為胃腺癌，接受胃腺癌根治術(shù)治療；②初診患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①卡氏功能狀態(tài)評(píng)分＜70 分；②伴重度心肺等臟器功能不全；③伴胃腸道急慢性感染性疾病；④合并其他類(lèi)型惡性腫瘤；⑤接受過(guò)放化療。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

1.2 研究方法

將術(shù)中獲取的部分癌及癌旁組織迅速置入凍存管中，液氮中凍存，轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室后置于-80℃保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)取50 mg 組織加入Trizol 后，組織勻漿器研磨組織，Trizol 試劑提取組織RNA，Narodrop1000 測(cè)定RNA 純度和純度。逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR 反應(yīng)，總反應(yīng)體系11 μl：模板0.2 μl，2×SYBR Green Premix 5 μl，正向和反向引物各1 μl，雙蒸水3.8 μl。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min，1 個(gè)循環(huán)；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35 個(gè)循環(huán)。正向和反向引物序列見(jiàn)表1。lncRNA ADPGK-AS1 以GAPDH 為內(nèi)參，miR-1301-3p 以U6 為內(nèi)參，2-ΔΔCt法對(duì)lncRNA ADPGK-AS1、miR-1301-3p 表達(dá)量進(jìn)行分析。以lncRNA ADPGK-AS1、miR-1301-3p 相對(duì)表達(dá)量的平均值進(jìn)行分組[10]，分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。高lncRNA ADPGK-AS1 組69 例，低lncRNA ADPGKAS1 組73 例；高miR-1301-3p 組70 例，低miR-1301-3p 組72 例。

1.3 隨訪

患者出院后每3 個(gè)月電話隨訪1 次，隨訪截至2021 年5 月，隨訪時(shí)間結(jié)束或出現(xiàn)患者死亡為隨訪終點(diǎn)，統(tǒng)計(jì)術(shù)后3 年生存情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料符合正態(tài)分布時(shí)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t 檢驗(yàn)。采用Pearson 相關(guān)性分析相關(guān)性。采用LncBase Predicted V.2 數(shù)據(jù)庫(kù)分析預(yù)測(cè)lncRNA ADPGK-AS1與miR-1301-3p 的作用。采用Kaplan-Meier 繪制生存曲線，比較采用log-rank 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 癌和癌旁組織中l(wèi)ncRNA ADPGK-AS1、miR-1301-3p 表達(dá)

胃腺癌組織中l(wèi)ncRNA ADPGK-AS1、miR-1301-3p 表達(dá)均高于癌旁組織（P ＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 癌和癌旁組織中l(wèi)ncRNA ADPGK-AS1、miR-1301-3p 表達(dá)比較（n=142）

2.2 lncRNA ADPGK-AS1 與miR-1301-3p 表達(dá)的相關(guān)性及相互作用預(yù)測(cè)

lncRNA ADPGK-AS1 與miR-1301-3p 表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.601，P ＜0.001），見(jiàn)圖2。生物信息預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，lncRNA ADPGK-AS1 在2422～2443 堿基處有與miR-1301-3p 結(jié)合的核苷酸位點(diǎn)，見(jiàn)圖3。

圖2 lncRNA ADPGK-AS1 與miR-1301-3p 表達(dá)的相關(guān)性（n=142）

圖3 lncRNA ADPGK-AS1 與miR-1301-3p 的相互作用位點(diǎn)

2.3 lncRNA ADPGK-AS1、miR-1301-3p表達(dá)對(duì)胃腺癌患者生存預(yù)后的影響

隨訪3～36 個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為27.1 個(gè)月，中位生存時(shí)間為26.3 個(gè)月，失訪5 例，死亡60 例。lncRNA ADPGK-AS1 高表達(dá)組患者中位生存期為23.3 個(gè)月（95%CI：15.2～26.1），低于lncRNA ADPGK-AS1 低表達(dá)組的31.6 個(gè)月（95%CI：22.9～34.9）（χ2=11.221，P ＜0.001）。miR-1301-3p 高表達(dá)組患者中位生存期為24.2 個(gè)月（95%CI：17.6～28.5），低于miR-1301-3p 低表達(dá)組的30.5 個(gè)月（95%CI：21.6～34.5）（log-rank χ2=10.268，P ＜0.001）。見(jiàn)圖4。

圖4 不同lncRNA ADPGK-AS1、miR-1301-3p 表達(dá)水平患者的生存曲線

3 討論

胃腺癌是多因素共同作用的結(jié)果，涉及遺傳學(xué)和表觀遺傳等基因的表達(dá)變化[11]。胃腸道腫瘤的標(biāo)志物包括碳水化合物抗原（carbohydrate antigen，CA）19-9、CA72-4、癌胚抗原等，然而單一的胃腺癌腫瘤標(biāo)志物靈敏度和特異度較低，臨床應(yīng)用價(jià)值有限[12]。近年來(lái)隨著腫瘤免疫等基礎(chǔ)研究的進(jìn)展，研發(fā)出新的治療藥物如免疫檢查點(diǎn)抑制劑等，一定程度上改善了患者的生存預(yù)后[13]。因此，尋找新的影響胃腺癌進(jìn)展的分子靶點(diǎn)，有較高的臨床價(jià)值。

lncRNA 是參與正常細(xì)胞過(guò)程的重要調(diào)節(jié)因子，包括染色質(zhì)重塑過(guò)程、基因轉(zhuǎn)錄后修飾和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等[14-15]。lncRNA ADPGK-AS1 編碼基因位于15q24.1，含有3 個(gè)外顯子。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA ADPGKAS1 在腫瘤中表達(dá)升高，并作為一種促癌基因促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[6，9]。本研究中，癌組織lncRNA ADPGK-AS1的表達(dá)水平顯著上調(diào)，目前機(jī)制尚不清楚。有研究表明，lncRNA ADPGK-AS1 的表達(dá)上調(diào)與基因拷貝數(shù)增加有關(guān)，lncRNA ADPGK-AS1 基因拷貝數(shù)增加促進(jìn)惡性腫瘤的惡性進(jìn)展，在腫瘤發(fā)生中起驅(qū)動(dòng)作用[16]。另研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA ADPGK-AS1 作為miR-3196 的分子海綿，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中癌基因同源盒基因1 的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞由上皮樣表型向間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)[17]。本研究結(jié)果顯示，lncRNA ADPGK-AS1 高表達(dá)的患者預(yù)后較差，因此檢測(cè)lncRNA ADPGK-AS1 可能是新的胃腺癌潛在預(yù)后標(biāo)志物。

miR-1301-3p 是一種短片段的lncRNA，成熟的miR-1301-3p 能整合到RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物中，它通過(guò)不完全堿基配對(duì)識(shí)別靶基因mRNA，導(dǎo)致靶基因mRNA 的翻譯抑制或不穩(wěn)定[18]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，miR-1301-3p 在結(jié)直腸癌及肝癌中異常表達(dá)，其作為一種促癌因子，參與腫瘤進(jìn)展，導(dǎo)致患者的不良預(yù)后[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，胃腺癌癌組織miR-1301-3p 表達(dá)上調(diào)，目前機(jī)制尚不明確。有研究發(fā)現(xiàn)，zeste2 多梳抑制復(fù)合物2 亞基增強(qiáng)子能夠誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞miR-1301-3p 的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生存[21]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，miR-1301-3p 的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的貼壁依賴性生長(zhǎng)，抑制p27 表達(dá)并促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白D1 表達(dá)，通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞周期G1/S 轉(zhuǎn)變，促進(jìn)細(xì)胞增殖[22]。本研究結(jié)果顯示，miR-1301-3p 高表達(dá)患者預(yù)后更差，提示miR-1301-3p 可以反映患者的預(yù)后情況。

通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，胃腺癌中l(wèi)ncRNA ADPGKAS1 與miR-1301-3p 表達(dá)呈正相關(guān)，在線生物信息學(xué)軟件發(fā)現(xiàn)lncRNA ADPGK-AS1 序列2422-2443 堿基處含有與miR-1301-3p 相互結(jié)合的位點(diǎn)。研究表明，lncRNA ADPGK-AS1 能夠作為一種分子海綿，結(jié)合下游多種miRNA，促進(jìn)腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移[5，17]。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，lncRNA ADPGK-AS1 能夠調(diào)控胃腺癌細(xì)胞中miR-1301-3p 的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)胃腺癌細(xì)胞的增殖，抑制凋亡[23-24]。但兩者在胃腺癌中的相互調(diào)控關(guān)系有待深入研究。

綜上所述，胃腺癌中l(wèi)ncRNA ADPGK-AS1、miR-1301-3p 表達(dá)上調(diào)，兩者存在相互結(jié)合的位點(diǎn)，是胃癌預(yù)后預(yù)測(cè)的潛在分子標(biāo)志物。