李 敏 朱玥潔 胡金偉 顧 挺 于明凱 陳志強(qiáng) 丁劍冰 張峰波

1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，新疆烏魯木齊 830054；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖助孕中心，新疆烏魯木齊 830054；3.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，新疆烏魯木齊 830011

布魯氏菌是一種革蘭氏陰性球桿狀菌，屬于細(xì)胞內(nèi)寄生菌，可以引起人類布魯氏菌病的發(fā)生。近年突發(fā)的公共衛(wèi)生事件層出不窮，控制好布魯氏菌的發(fā)病率面臨著巨大挑戰(zhàn)[1]。因此，積極研發(fā)布魯氏菌疫苗，是減少布魯氏菌病發(fā)病最為有用的方式。與傳統(tǒng)疫苗比較，表位疫苗作為新興的疫苗研發(fā)技術(shù)，可以提高疫苗的安全性、有效性[2]。前期的研究證實(shí)，布魯氏菌的外膜蛋白（outer membrane proteins，Omps），如Omp25、Omp31、Omp2b、Omp10 和Omp19 具有良好的免疫原性和免疫反應(yīng)性，是研究布魯氏菌疫苗的良好選擇[3-7]。Omp2a 和Omp2b 的編碼基因在布魯氏菌基因組中關(guān)系密切。而Omp2a 的L5 環(huán)比Omp2b 的L5 環(huán)更短且?guī)ж?fù)電荷的殘基更少[8]，且具有良好的免疫原性，可以在宿主中激活體液免疫和細(xì)胞免疫[9]。布魯氏菌還編碼另一種含Toll 樣受體結(jié)構(gòu)域的BtpB，它可以抑制Toll 信號(hào)傳導(dǎo)[10]。將兩者的優(yōu)勢(shì)表位結(jié)合可以使疫苗的效價(jià)更高。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

在UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)中，查找羊種布魯氏菌屬Omp25和BtpB 的氨基酸序列。

1.2 研究方法

如圖1 所示，在對(duì)其進(jìn)行了一系列分析之后，選擇優(yōu)勢(shì)細(xì)胞表位進(jìn)行多表位疫苗的構(gòu)建，最后進(jìn)行評(píng)估。

圖1 多表位疫苗設(shè)計(jì)流程圖

1.2.1 理化性質(zhì)的預(yù)測(cè) 應(yīng)用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）在線分析理化性質(zhì)。

1.2.2 抗原性的預(yù)測(cè) 應(yīng)用VaxiJenv2.0[11]來(lái)分析抗原性，閾值為0.4。

1.2.3 信號(hào)肽的預(yù)測(cè) 應(yīng)用SignalP5.0 預(yù)測(cè)信號(hào)肽的位置。

1.2.4 二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè) 應(yīng)用SOPMA（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html）在線分析軟件分析二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.5 三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)及模型質(zhì)量評(píng)估 應(yīng)用I-TASSER[12-13]（https：//zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/）及Discover Studio（2019）構(gòu)建及展示三級(jí)結(jié)構(gòu)。應(yīng)用ProSA-web[14-15][ProSA-web-Protein Structure Analysis（sbg.ac.at）]和SWISS-MODEL[Structure Assessment（expasy.org）]的結(jié)構(gòu)評(píng)估服務(wù)來(lái)評(píng)估模型的質(zhì)量。

1.2.6 T 細(xì)胞表位的預(yù)測(cè) 通過(guò)應(yīng)用SYFPEITHI（http：//www.syfpeithi.de/bin/mhcserver.dll/epitopeprediction.htm）和IEDB（http：//tools.immuneepitope.org/main/）來(lái)預(yù)測(cè)T 細(xì)胞表位，軟件中相同的序列且評(píng)分高的表位為優(yōu)勢(shì)表位。

1.2.7 B 細(xì)胞表位的預(yù)測(cè) 應(yīng)用IEDB，BepiPred 1.0[16]和BCPREDS（http：//ailab-projects1.ist.psu.edu：8080/bcpred/predict.html）來(lái)預(yù)測(cè)B 細(xì)胞表位。在應(yīng)用上述軟件分析時(shí)，排除低于5 個(gè)氨基酸的序列；根據(jù)IEDB預(yù)測(cè)的β-折疊、表面可及性、靈活性和親水性的結(jié)果，去除了閾值以下的表位，最后得到了評(píng)分高的表位。其中，軟件中共同含有的表位為優(yōu)勢(shì)B 細(xì)胞表位。

1.2.8 多表位疫苗的構(gòu)建 選取AAY、GPGPG 和KK連接優(yōu)勢(shì)CTL、Th 和B 細(xì)胞表位。使用EAAAK 連接佐劑并插入到蛋白N 端以增強(qiáng)疫苗的免疫原性[17]，在C 端添加組氨酸標(biāo)記，最終得到完整的疫苗序列。

1.2.9 致敏性的預(yù)測(cè) 運(yùn)用AllergenFP1.0 來(lái)分析疫苗的致敏性。

1.2.10 免疫模擬 應(yīng)用C-ImmSim（https：//kraken.iac.rm.cnr.it/C-IMMSIM/）進(jìn)行免疫模擬[18]，模擬疫苗3 次注射時(shí)間。在哺乳動(dòng)物中，3 針注射時(shí)間間隔為4 周，注射時(shí)間步長(zhǎng)分別是1，84 和168[19]。

2 結(jié)果

2.1 氨基酸序列

在數(shù)據(jù)庫(kù)中，獲得了Omp2a（登記號(hào)：Q7CNU3）和BtpB（登記號(hào)：A0A5P3L3F0）的氨基酸序列。

2.2 氨基酸的抗原性

Omp2a 抗原性預(yù)測(cè)結(jié)果為0.54；BtpB 抗原性預(yù)測(cè)結(jié)果為0.49。兩種蛋白質(zhì)的預(yù)測(cè)結(jié)果可能具有抗原性，得分越高其抗原性越高。

2.3 氨基酸的基本結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)

兩種蛋白質(zhì)為親水性的穩(wěn)定蛋白（表1），適合作為抗原的備選。

表1 氨基酸的基本結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)

2.4 氨基酸的信號(hào)肽

分析結(jié)果可知，Omp2a 中可能具有信號(hào)肽，除去可能存在信號(hào)肽的1-30 肽段。在BtpB 中，存在信號(hào)肽的可能極低。見(jiàn)圖2。

圖2 Omp2a 的信號(hào)肽

2.5 二級(jí)結(jié)構(gòu)

分析軟件結(jié)果顯示，Omp2a 中β-轉(zhuǎn)角占8.17%，無(wú)規(guī)卷曲占40.60%；BtpB 中β-轉(zhuǎn)角占7.53%，無(wú)規(guī)卷曲占31.85%。見(jiàn)圖3。

圖3 蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)

2.6 三級(jí)結(jié)構(gòu)

建模后Omp2a 預(yù)測(cè)所得C 值為-2.04，TM值為（0.47±0.15）；BtpB預(yù)測(cè)所得C值為-1.72，TM值為（0.51±0.15）。C 值通常在-5～2 范圍內(nèi)，其中C 分?jǐn)?shù)越高代表模型越可靠。TM 值＞0.5 則意義較大，＜0.17 則模型的隨機(jī)性較大。見(jiàn)圖4。

圖4 蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)

2.7 T 細(xì)胞表位分析

選取SYFPEITHI 分值和IEDB 百分等級(jí)排名前10 位的表位，取其共有序列后從Omp2a 中獲得了3 個(gè)Th 優(yōu)勢(shì)表位和5 個(gè)CTL 優(yōu)勢(shì)表位，從BtpB 中獲得了1 個(gè)Th 優(yōu)勢(shì)表位和5 個(gè)CTL 優(yōu)勢(shì)表位。其中，分值越高，百分等級(jí)越低的表位為正確表位的可能性越大。

2.8 B 細(xì)胞表位分析

通過(guò)應(yīng)用IEDB，在Omp2a 中獲得了4 個(gè)B 細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位。為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，又選取了BepiPred 排名高及BCPred 得分>0.75 的表位，最終通過(guò)選取3 個(gè)軟件的共有序列后得到2 個(gè)優(yōu)勢(shì)表位。其中，β-轉(zhuǎn)角、表面可及性、可變形性、親水性在閾值以上，得分越高的表位為正確表位的可能性越大。同理，在BtpB 中使用這3 個(gè)軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)，最終得到了1 個(gè)優(yōu)勢(shì)表位。

2.9 多表位疫苗的構(gòu)建及其理化性質(zhì)

構(gòu)建的疫苗（圖5），由316 個(gè)氨基酸組成，為親水性的穩(wěn)定蛋白，其抗原性為0.66，具有良好的抗原性，且為非過(guò)敏原。

圖5 多表位疫苗構(gòu)建體示意圖

2.10 表位疫苗的三級(jí)結(jié)構(gòu)及模型質(zhì)量評(píng)估

三級(jí)結(jié)構(gòu)完成建模后所得C 值為-4.36，TM 值為（0.26±0.08）；模型的可信度較大。然后，將上述疫苗進(jìn)一步展示，模型中藍(lán)色越深代表親水可能性大，棕色越深代表疏水可能性大；顏色越粉代表為供體可能性大，顏色越綠代表為受體可能性大?？梢?jiàn)，設(shè)計(jì)的疫苗為親水性且為配體的可能性大。Z 分?jǐn)?shù)表示整個(gè)模型的質(zhì)量。疫苗的Z 分?jǐn)?shù)為-7.06，表示在天然蛋白質(zhì)的特征范圍，則為正確蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的可能性大。為保證結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性，又使用拉氏圖來(lái)進(jìn)一步評(píng)估模型的質(zhì)量。允許區(qū)即圖中的深綠色區(qū)域，最大允許區(qū)即圖中的淺綠色區(qū)域，不允許區(qū)即圖中的空白區(qū)域?？梢?jiàn)圖中的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)大部分落在區(qū)間范圍內(nèi)。故疫苗的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型的可信度大。見(jiàn)圖6。

圖6 疫苗三級(jí)結(jié)構(gòu)及模型質(zhì)量評(píng)估圖

2.11 免疫模擬

在線免疫模擬器用于評(píng)估實(shí)際疫苗注射入人體后所引起的免疫反應(yīng)水平。整體來(lái)看，初級(jí)免疫應(yīng)答主要是引起IgM 和IgG 的升高，次級(jí)免疫應(yīng)答主要是引起IgG1、IgG1+IgG2 和B 細(xì)胞的升高。另外，疫苗也可以引起高應(yīng)答的細(xì)胞因子反應(yīng)，其中最主要的是引起γ 干擾素、白細(xì)胞介素-23、白細(xì)胞介素-10 和白細(xì)胞介素-12 水平的升高。最重要的，疫苗中的T 細(xì)胞表位具有免疫原性，這和之前的預(yù)測(cè)結(jié)果保持一致。另外，在每次注射疫苗后，都會(huì)引起巨噬細(xì)胞的增加，而自然殺傷細(xì)胞在整個(gè)免疫過(guò)程中大多保持在一定的高水平。見(jiàn)圖7。

3 討論

人類布魯氏菌病的主要致病菌為羊種布魯氏菌[20]。人類可以通過(guò)吸入含布魯氏菌的氣溶膠、飲用未巴氏滅菌的患病羊奶等方式感染布魯氏菌。人感染布魯氏菌后，可以表現(xiàn)為發(fā)熱、乏力、關(guān)節(jié)痛和肌肉疼痛[21]。布魯氏菌病如治療不及時(shí)易導(dǎo)致疾病反復(fù)發(fā)作、慢性化，遷延數(shù)年甚至終生不愈，而目前尚未有預(yù)防人類布魯氏菌病的疫苗。因此，迫切需要研制相關(guān)疫苗來(lái)解決目前布魯氏菌病的臨床難題。

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與其功能密切相關(guān)，Omp2a 作為布魯氏菌的外膜蛋白，具有良好的免疫原性。BtpB 具有Toll 樣受體結(jié)構(gòu)域，與調(diào)節(jié)重要免疫通路的激活等有關(guān)[22]。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，兩種蛋白質(zhì)為親水性的穩(wěn)定蛋白。親水性良好，提示蛋白質(zhì)對(duì)水有較大的親和能力；穩(wěn)定性良好，說(shuō)明蛋白質(zhì)不容易發(fā)生變形，適合用來(lái)設(shè)計(jì)疫苗。在信號(hào)肽的預(yù)測(cè)中，發(fā)現(xiàn)Omp2a 可能存在信號(hào)肽，而BtpB 可能不存在信號(hào)肽。在蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，兩種蛋白質(zhì)的β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲所占比例較高，容易形成抗原表位[23]。

選擇布魯氏菌病高發(fā)地區(qū)人群高表達(dá)的HLAA*1101 和HLA-DRB1*0301 等位基因進(jìn)行分析細(xì)胞表位[24]。單個(gè)表位組成的疫苗抗原性低于T、B 細(xì)胞表位聯(lián)合后構(gòu)建的疫苗[25]。經(jīng)過(guò)分析，在Omp2a 和BtpB 中獲得了優(yōu)勢(shì)細(xì)胞表位。構(gòu)建的疫苗蛋白含有316 個(gè)氨基酸，為親水性的穩(wěn)定蛋白?？乖詾?.66，提示抗原性高，且為非致敏原；其三級(jí)結(jié)構(gòu)顯示蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性強(qiáng)，容易形成抗原表位，適合作為疫苗的備選。最后將疫苗的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)一步評(píng)估模型的質(zhì)量，可知模型可信度高。通過(guò)免疫模擬，本研究看出疫苗可能產(chǎn)生一定的免疫反應(yīng)。本研究后續(xù)需進(jìn)一步完善相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

綜上所述，本研究將Omp2a 和BtpB 的優(yōu)勢(shì)表位重組，且重組后的疫苗抗原性好，可以作為布魯氏菌病的候選疫苗，為今后相關(guān)疫苗的研究提供理論資料。