田井滿，李明慧，白曉利，李玉磊，劉麗娜，李雁冰，陳化蘭

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流感重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150069）

禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）屬于正黏病毒科A 型流感病毒屬，病毒粒子表面表達(dá)的兩種糖蛋白分別為血凝素（Hemagglutinin，HA）和神經(jīng)氨酸酶（Neuraminidase，NA）。在世界各地的野鳥中均可分離到AIVs，根據(jù)HA 可將其劃分為16 種亞型（H1～H16）； 根 據(jù)NA 可 將 其 劃 分 為9 種 亞 型（N1～N9），目前已經(jīng)檢測(cè)到140 多種HA-NA 亞型組合[1-2]。H8 亞型AIV 于1967 年首次在北美的火雞中分離到，隨后在全球均檢測(cè)到了該亞型病毒[3-5]。目前在AIV 數(shù)據(jù)（https://www.gisaid.org/）中H8 亞型AIV 共有271 株，其中最常見的亞型組合是H8N4，但H8 亞型也與N2、N3、N5 和N7 等NA 亞型組合。H8 亞型AIV 為低致病性禽流感病毒（LPAIV），按照其進(jìn)化關(guān)系可劃分為歐亞分支和北美分支。

為了解本團(tuán)隊(duì)2019 年于山東省榮成市分離到的一株H8N2 亞型AIV 的生物學(xué)特性，本研究對(duì)該H8N2 亞型AIV 進(jìn)行了全基因組測(cè)序，并對(duì)其特殊氨基酸位點(diǎn)和遺傳演化作了分析，評(píng)估了其對(duì)SPF 雞和BALB/c 小鼠的致病性，為H8N2 亞型AI 的綜合防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料600 份新鮮天鵝糞便樣品為2019 年1 月采集自山東省榮成市。9 日齡～11 日齡的普通雞胚、10 日齡的SPF 雞胚及SPF 雞紅細(xì)胞購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。RNA 提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；RNA 反轉(zhuǎn)錄酶購自日本TOYOBO 公司；rTaqDNA 聚合酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒美國OMEGA 公司；測(cè)序反應(yīng)試劑盒BigDye Terninator 3.1 購自美國ABI 公司。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成采用MEGA7 軟件對(duì)AIV數(shù)據(jù)庫中H8 亞型AIV 序列分析比對(duì)后，采用Primer Premier 5.0 軟件根據(jù)比對(duì)結(jié)果設(shè)計(jì)擴(kuò)增H8 亞型AIV8個(gè)內(nèi)部基因節(jié)段的引物（表1），引物均由吉林庫美生物有限公司合成。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.3 病毒分離及其亞型鑒定將600 份糞便樣品經(jīng)旋渦震蕩、離心后取上清液，以0.3 mL/枚接種9 日齡～11 日齡的普通雞胚， 37 ℃孵化72 h 后收獲雞胚尿囊液，按常規(guī)方法測(cè)定其血凝（HA）活性，HA陽性（HA≥21）的樣品再通過對(duì)H1～H16 單因子血清及新城疫（ND）標(biāo)準(zhǔn)血清的血凝抑制（HI）試驗(yàn)確定其HA 亞型。提取確定HA 亞型的AIV 樣品RNA，采用AIV 12 bp 通用引物反轉(zhuǎn)錄為cDNA，參照文獻(xiàn)[6]，利用RT-PCR 進(jìn)一步鑒定其NA 亞型。

1.4 病毒的純化及半數(shù)感染量（EID50）的測(cè)定將收獲的第1 代雞胚尿囊液用PBS 10 倍倍比稀釋后，每稀釋度接種3 枚9 日齡～11 日齡SPF 雞胚，置于37 ℃孵化器中培養(yǎng)48 h 后收集最高稀釋度最高血凝價(jià)的尿囊液，連續(xù)傳代純化3 代后的尿囊液以106倍稀釋后接種5 枚SPF 雞胚，收集全部尿囊液，無菌檢驗(yàn)后即為純化病毒。參考文獻(xiàn)[7]測(cè)定純化病毒的EID50。

1.5 病毒全基因組測(cè)序及進(jìn)化分析以1.3 中分離株病毒為模板，采用AIV 8 個(gè)內(nèi)部基因節(jié)段特異性引物分別擴(kuò)增各基因，回收純化擴(kuò)增產(chǎn)物后測(cè)序，利用Se-qMan 軟件根據(jù)測(cè)序結(jié)果拼接全基因組，參照GISAID數(shù)據(jù)庫中相關(guān)序列，經(jīng)MAFFT 多重序列比對(duì)軟件比對(duì)后，利用RAxMLv8.2.10 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.6 病毒對(duì)SPF 雞的致病性試驗(yàn)將8 只4 周齡SPF雞經(jīng)翅靜脈接種100 μL（106EID50）的該分離病毒液，24 h 后放入3 只未感染的SPF 雞，以檢測(cè)病毒的水平傳播能力；感染后第3 d 隨機(jī)迫殺3 只感染雞，無菌采集雞的大腦、脾臟、胰腺、盲腸扁桃體、腎臟、法氏囊、胸腺、氣管和肺臟，剩余的雞分別在感染后第3 d、5 d、7 d、9 d 采集喉拭子和泄殖腔拭子。將采集的樣品常規(guī)處理后（臟器樣品加入鋼珠后研磨處理；咽拭子及泄殖腔拭子經(jīng)旋渦震蕩處理），離心取上清液，通過病毒滴定試驗(yàn)檢測(cè)病毒在雞各臟器中的復(fù)制及排毒狀況，利用Reed-Muench 法計(jì)算病毒滴度。另外在感染后14 d 對(duì)存活雞經(jīng)翅靜脈采血分離血清，通過HI 試驗(yàn)來測(cè)定血清HI 抗體轉(zhuǎn)陽情況。

1.7 病毒對(duì)BALB/c 小鼠的致病性試驗(yàn)每組8 只6周齡的雌性BALB/c 小鼠，干冰麻醉后，感染組鼻腔接種50 μL（106EID50）病毒液，對(duì)照組鼻腔接種50 μL PBS。感染后第3 d 每組隨機(jī)剖殺3 只小鼠，無菌采集小鼠的大腦、脾臟、腎臟、肺臟、鼻甲，按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)研磨、離心后通過病毒滴定試驗(yàn)檢測(cè)小鼠各個(gè)臟器中的病毒復(fù)制情況，按Reed-Muench 法計(jì)算病毒在小鼠臟器內(nèi)的滴度。其余5 只小鼠連續(xù)稱重14 d，記錄其體質(zhì)量變化及死亡情況。

2 結(jié) 果

2.1 病毒的分離與鑒定將采集的野鳥糞便樣品接種雞胚后收獲雞胚尿囊液，進(jìn)行HA 試驗(yàn)。結(jié)果顯示有3 份樣品呈現(xiàn)HA 陽性，樣品編號(hào)分別為SD-134、SD-341、SD-442。對(duì)HA 陽性的樣品進(jìn)行HI 試驗(yàn)，結(jié)果顯示SD-341 和SD-442 為新城疫病毒；SD-134可被AIV H8 亞型單因子血清所抑制，HI 效價(jià)可達(dá)到1：64，而不能被陰性血清及AIV 其他亞型單因子血清所抑制，表明該樣品含有H8 亞型AIV。經(jīng)RTPCR 鑒定SD-134 的NA 亞型，結(jié)果顯示其為N2 亞型，表明該樣品為H8N2 亞型AIV，命名為A/whoop-er swan/Shandong/S1-134/2019（H8N2），簡稱WS/SD/S1-134/2019（H8N2）。經(jīng)純化后檢測(cè)該病毒的EID50為107.83EID50/100 μL。

2.2 WS/SD/S1-134/2019（H8N2）分離株全基因組的PCR 擴(kuò)增及序列分析對(duì)WS/SD/S1-134/2019（H8N2）采用特異性引物進(jìn)行內(nèi)部基因組的RT-PCR 擴(kuò)增，并測(cè)序后序列分析。結(jié)果顯示，其HA 基因的ORF 為1 701 bp，編碼566 個(gè)氨基酸，與孟加拉國的一株鴨源H8N4（A/duck/Bangladesh/37509/2019）同源性最高，為98.04%；其NA 基因的ORF 為1 401 bp，編碼467 個(gè)氨基酸，與鴨源H9N2（A/Duck/China/E1158/2014（H9N2））同源性最高，為98.92%；其內(nèi)部基因分別與H4N6、H6N2、H10N7、H11N2、H12N5 等亞型AIV 的部分基因具有最高核苷酸序列同源性。此外，分離株除PB2 和PA 基因與野鳥源的LPAIV 具有最高同源性外，其余基因均與鴨源的LPAIV 具有最高同源性（表2）。綜上表明，WS/SD/S1-134/2019（H8N2）分離株具有多亞型AIV 重組的特點(diǎn)。

2.3 WS/SD/S1-134/2019（H8N2）分離株氨基酸位點(diǎn)分析 對(duì)WS/SD/S1-134/2019（H8N2）進(jìn)行特殊氨基酸位點(diǎn)分析，結(jié)果顯示，HA 蛋白氨基酸的裂解位點(diǎn)為SIEPK/GLF，僅有一個(gè)堿性氨基酸，符合LPAIV 的分子特征；在受體結(jié)合位點(diǎn)aa222 與aa224 均未發(fā)生突變，均為典型的禽型受體結(jié)合位點(diǎn)。其N2 蛋白在aa62～aa69 位發(fā)生缺失，而PB2 蛋白的aa627 與aa701均未發(fā)生突變，但PB1 蛋白發(fā)生了D622G 的突變。另外該H8N2 亞型AIV NS1 蛋白在aa80～aa84 未發(fā)生缺失，但在aa42、aa101、aa138 均發(fā)生了突變，這可能會(huì)增加其對(duì)小鼠的致病性（表3）。上述結(jié)果表明，WS/SD/S1-134/2019（H8N2）分離株具有潛在增強(qiáng)小鼠致病性的能力。

表3 WS/SD/S1-134/2019（H8N2）株關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)分析Table 3 Key residues of WS/SD/S1-134/2019(H8N2)genome

2.4 WS/SD/S1-134/2019(H8N2）分離株基因遺傳進(jìn)化分析 對(duì)WS/SD/S1-134/2019（H8N2）全基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果顯示其HA 基因與H8N2、H8N4、H8N5 亞型AIV 的HA 基因同屬于一個(gè)分支，均可劃分為歐亞分支（圖1）。WS/SD/S1-134/2019（H8N2）的NA基因與我國家禽中廣泛流行的H9N2 亞型AIV 的NA 基因聚為一支，屬于歐亞分支（圖2）。對(duì)其內(nèi)部基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果顯示，除了WS/SD/S1-134/2019（H8N2）分離株的PB2 基因可以劃分為北美分支外，其余5 個(gè)內(nèi)部基因（PB1、PA、NP、M 以及NS 基因）均屬于歐亞分支（圖3）。上述結(jié)果表明WS/SD/S1-134/2019（H8N2）分離株的各個(gè)基因進(jìn)化具有跨大陸、跨物種及多亞型重組的特點(diǎn)。

圖1 WS/SD/S1-134/2019（H8N2）分離株HA基因進(jìn)化樹Fig.1 The HA gene phylogenetic tree of WS/SD/S1-134/2019(H8N2)

圖2 WS/SD/S1-134/2019（H8N2）分離株NA基因進(jìn)化樹Fig.2 The NA gene phylogenetic tree of WS/SD/S1-134/2019(H8N2)

圖3 WS/SD/S1-134/2019（H8N2）分離株內(nèi)部基因的進(jìn)化樹Fig.3 The internal genes phylogenetic trees of WS/SD/S1-134/2019(H8N2)

2.5 分離株對(duì)SPF 雞致病性試驗(yàn)結(jié)果WS/SD/S1-134/2019（H8N2）分離株感染SPF 雞后感染組和同居組均未出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，各臟器中也均未檢測(cè)到該病毒，表明該病毒株不能在SPF 雞中有效的復(fù)制和水平傳播。在感染后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集的喉拭子和泄殖腔拭子也均未檢測(cè)到病毒，表明感染組和同居組SPF 雞均不能向外界排毒。另外，感染14 d 后的各組雞抗體檢測(cè)中也未發(fā)現(xiàn)HI 抗體轉(zhuǎn)陽的情況。以上結(jié)果表明WS/SD/S1-134/2019（H8N2）分離株對(duì)SPF 雞呈現(xiàn)低致病力，對(duì)家禽的威脅較小。

2.6 分離株對(duì)小鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果WS/SD/S1-134/2019（H8N2）分離株感染小鼠3 d 后臟器病毒滴定檢測(cè)結(jié)果顯示，其能在小鼠肺臟和鼻甲中有效復(fù)制，病毒滴度分別為4.25 log10EID50/mL～5.5 log10EID50/mL 和3.25 log10EID50/mL～4.5 log10EID50/mL。對(duì)照組小鼠未檢測(cè)到病毒（圖4）。被檢3 只小鼠中兩只小鼠腎臟和一只小鼠脾臟中檢測(cè)到該病毒，病毒滴度分別為0.98 log10EID50/mL、2.75 log10EID50/mL 和1.5 log10EID50/mL。剩 余5 只小鼠連續(xù)觀察14 d，均未出現(xiàn)死亡，且無明顯臨床癥狀和體質(zhì)量下降。對(duì)照組小鼠也均正常（圖5）。表明該分離株對(duì)小鼠呈低致病力。

圖4 分離病毒感染3 d后小鼠臟器病毒滴定結(jié)果Fig.4 Viral titers in the organs of mice at 3 d post-inoculation

圖5 小鼠感染病毒后的體質(zhì)量變化Fig.5 Weight change of mice post-inoculation

3 討 論

野鳥是AIV 的自然宿主，H8 亞型AIV 主要分離自雁形目（野鴨、天鵝和鵝）鳥類[8]。在AIV 數(shù)據(jù)（https://www.gisaid.org/）中，全球共分離到271 株H8亞型AIV，其中北美大陸占64.21%（174/271），歐亞大陸占34.32%（93/271），其他地區(qū)占1.47%（4/271），不同地區(qū)的分離數(shù)量不同可能與野鳥的棲息地有關(guān)。同時(shí)隨著野鳥的遷徙可能會(huì)使LPAIV 在各大洲間傳播，并可能導(dǎo)致AIV 的進(jìn)化以及重組[9-10]，而在全球8 條候鳥的遷徙路線中有3 條經(jīng)過中國，家養(yǎng)水禽可能通過和野鳥共用水源被感染，目前已有研究報(bào)道H8 亞型AIV 在家養(yǎng)水禽和野鳥中均被檢測(cè)到[11]。因此，對(duì)該亞型AIV 的監(jiān)測(cè)尤為重要，本研究從野鳥糞便分離到AIV WS/SD/S1-134/2019（H8N2）株更說明了對(duì)H8亞型AIV 監(jiān)測(cè)的重要性。

本研究對(duì)分離得到的WS/SD/S1-134/2019（H8N2）株的遺傳進(jìn)化研究顯示，該H8N2 亞型AIV 的各基因節(jié)段來源于不同地區(qū)、不同宿主以及不同亞型AIV，說明該病毒株具有跨大陸、跨物種及多亞型AIV 重組的特點(diǎn)。綜上所述，野鳥對(duì)AIV 的進(jìn)化和傳播起著重要作用，越冬或中途?？康乜赡苁且傍B與家禽之間傳播AIV 的關(guān)鍵。因此，需要加強(qiáng)對(duì)野鳥越冬或中途?？康氐谋O(jiān)測(cè)密度及頻率。

為了進(jìn)一步了解WS/SD/S1-134/2019（H8N2）株分子進(jìn)化特征，本研究以A/Aichi/2/1968（H3N2）的NA蛋白為參考株，分析該分離病毒NA 的頸部缺失，其余的7 個(gè)蛋白均以A/goose/Guangdong/1/1996（H5N1）的蛋白序列為參考株，分析分離株的特殊氨基酸位點(diǎn)及序列。NA 蛋白的頸部缺失會(huì)影響病毒的感染性和復(fù)制能力[12]，本研究分離的H8N2 AIV N2蛋白在aa62～aa69 發(fā)生缺失，這可能會(huì)增強(qiáng)該病毒在小鼠體內(nèi)的復(fù)制能力。PB2 蛋白與病毒的宿主適應(yīng)性及傳播能力相關(guān)[13]，但本研究分離的WS/SD/S1-134/2019（H8N2）株P(guān)B2 蛋白的aa627 與aa701 均未發(fā)生突變。PB1 蛋白與PA 蛋白通過改變RNA 依賴的RNA 聚合酶（RdRP）組分之間的親和力而影響病毒的復(fù)制能力和聚合酶活性[14]，且許多單一氨基酸的突變會(huì)改變病毒對(duì)小鼠的致病性，如D622G 的突變可以增強(qiáng)病毒對(duì)小鼠的致病性，本研究分離的H8N2 AIV 發(fā)生了D622G 的 突 變。NS 基 因 編 碼NS1、NS2 和NS3 蛋 白，其中NS1 蛋白中的單個(gè)氨基酸缺失或突變可能會(huì)影響AIV 對(duì)小鼠的致病性[15]，本研究分離的H8N2 亞型AIV 在aa80～aa84 未發(fā)生缺失，但在aa42、aa101、aa138 均發(fā)生了突變，這可能會(huì)增強(qiáng)該病毒對(duì)小鼠的致病性。

動(dòng)物致病性試驗(yàn)顯示，本研究分離的該新型重組H8N2 亞型AIV 雖然對(duì)家禽（雞）和哺乳動(dòng)物（小鼠）呈低致病力，但是該病毒已可以在小鼠體內(nèi)有效復(fù)制，且其基因組攜帶多個(gè)AIV 增強(qiáng)哺乳動(dòng)物致病性的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)，具有感染人的潛在風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)加大監(jiān)測(cè)力度，密切關(guān)注其在野鳥以及家禽中出現(xiàn)的頻率和波及面，以及對(duì)哺乳動(dòng)物的致病性。本研究為我國AI的綜合防控及公共衛(wèi)生安全提供參考數(shù)據(jù)。