葉麗萍，胡靜濤，石春衛(wèi)

（吉林農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院/吉林省動物微生態(tài)制劑工程研究中心，吉林 長春 130118）

輪狀病毒（Rotavirus，RV）屬于呼腸孤病毒科（Reoviridae）輪狀病毒屬的雙鏈RNA 病毒，是引起嬰幼兒和其他幼齡動物病毒性腹瀉的主要病原之一。RV 感染主要侵入腸道絨毛上皮細胞從而導致細胞空泡變性、小腸絨毛萎縮脫落和腸壁變薄等癥狀以致腹瀉發(fā)生。RV 感染宿主腸上皮細胞可被不同的模式識別受體（Pattern recognition receptor，PRR）特異性識別，而Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLRs）作為宿主免疫系統(tǒng)中重要的PRR，其在RV 感染并誘導樹突狀細胞（Dendritic cells，DCs）成熟及激活固有免疫應答的過程中發(fā)揮重要作用。本文較全面探究了RV 感染與宿主TLRs 信號通路的互作機制，將有助于了解宿主抗RV 感染的固有免疫反應，為RV 感染的防控和治療提供新思路。

1 與RV 感染相關的TLRs

TLRs 是免疫細胞中主要的跨膜蛋白，在病毒和細菌的感染與識別中具有重要作用，是連接機體固有免疫和獲得性免疫反應的橋梁[1]。目前在哺乳動物中共發(fā)現(xiàn)了15 個TLRs（TLR1～TLR15），其中人類共有11 個TLRs[2]。不同的TLRs 識別不同的病原體相關模式分子（Pathogen-associated molecular patterns，PAMP）[3]，如TLR1 識別細菌脂蛋白和三酰脂質(zhì)肽；TLR2 識別革蘭氏陽性菌糖肽；TLR5 識別鞭毛蛋白；而TLR3 能特異性識別病毒感染的中間產(chǎn)物dsRNA[4]和poly(I:C)，促進炎性細胞因子和I 型干擾素的產(chǎn)生。在 眾 多 的TLRs 中，TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8 和TLR9 參與識別病毒和抗病毒感染的固有免疫反應，其中TLR2 和TLR4 位于細胞膜表面參與識別病毒糖蛋白，TLR3、TLR7、TLR8 和TLR9 位于細胞內(nèi)參與識別病毒核酸，誘導宿主產(chǎn)生I 型干擾素[5]。

哪種或哪幾種TLRs 參與RV 感染后的病毒識別及抗病毒的固有免疫應答，目前尚無定論。RV 感染后單核細胞所表達的TLRs 識別dsRNA，激活NF-κB和干擾素途徑，進而導致多種細胞因子及輔助刺激分子的分泌，以調(diào)節(jié)機體非特異性免疫應答[6]。Xu等研究RV 嚴重感染的腹瀉兒童的外周血單核細胞發(fā)現(xiàn)，發(fā)病3 d 內(nèi)有41% 的患者體內(nèi)TLR2～TLR4、TLR7和TLR8的mRNA 轉錄水平升高；3 d 后只有TLR3和TLR8基因mRNA 轉錄水平保持較高水平[7]。RV 感染人腸上皮細胞（HT29）細胞24 h～48 h 只有TLR4基因轉錄水平輕微上調(diào)，而TLR2、TLR3、TLR7和TLR8基因的轉錄水平則隨著感染時間的延長而顯著升高，提示TLR4 在RV 感染的免疫應答中并未起主要作用[8]。Pott 等的研究表明，RV 感染導致小鼠腸上皮細胞中TLR3基因的轉錄水平明顯升高，而TLR3缺失成年小鼠的腸上皮細胞分泌抗病毒或促炎性細胞因子則明顯減少[9]。Lopez-Guerrero 等則認為病毒感染后TLR3、TLR7 和TLR9 可能參與了宿主的固有免疫應答[10]。恒河猴輪狀病毒（Rhesus monkey rotavirus，RRV）刺激非肥胖糖尿?。∟on obese diabe-tes，NOD）小鼠的脾細胞，可誘導抗原遞呈細胞（An-tigen presenting cell，APC）和B 細胞的活化，從而干擾TLR7 或干擾素α 受體（Interferon alpha receptor，IF-NAR）的信號通路；而感染RRV 的NOD 小鼠的漿細胞樣樹突狀細胞（Plasmacytoid dendritic cells，pDCs）則能夠觸發(fā)TLR7 信號通路的活化[11]。Vlasova 等用鼠李糖乳桿菌GG 株免疫SPF 仔豬，再進行RV 攻毒試驗的結果顯示，攻毒后小鼠的TLR3基因轉錄水平上調(diào)，而TLR2和TLR4基因的轉錄水平下調(diào)[12]。本研究室檢測豬輪狀病毒（PRV）感染的小鼠骨髓樹突狀細胞（Murine bone marrow-derived DCs，BMDCs）發(fā)現(xiàn)，其中的TLR2和TLR3基因的轉錄水平均隨作用時間的延長而上調(diào)，而TLR4和TLR8基因的轉錄水平均低于對照組，表明TLR2 和TLR3 可能參與PRV 感染BMDCs 的免疫應答，而TLR4 和TLR8 在PRV 感染后并未起主要作用[13]。

2 與RV 感染相關的TLRs 途徑

TLRs 通過病原體相關分子模式（Pathogen-associ-ated molecular patterns，PAMP）與β 干擾素TIR 結構域銜接蛋白（TIR domain-containing adaptor inducing interferon-β，TRIF）、TLRs 接頭蛋白髓樣分化因子88（Myeloid differentiation factor 88，MyD88）、TIR 結構域銜接蛋白（TIR domain-containing adaptor protein，TIRAP）、TIR 結構域銜接分子2（TIR domain-contain-ing adaptor molecule 2，TICAM2）等結合，激活下游NF-κB 和干擾素調(diào)節(jié)因子3（Interferon regulatory fac-tors，IFR3）等參與宿主的固有免疫應答[14]。MyD88和TRIF 是TLRs 信號通路中2 個重要的接頭蛋白，TLRs 通過MyD88 依賴/非依賴型信號途徑活化NFκB，并分泌多種炎癥因子產(chǎn)生抗病毒的免疫應答。

2.1 MyD88 依賴型TLRs 信號轉導的通路MyD88包含N 端DD、中間結構域ID 和C 端Toll/IL-1 受體結構域，其通過C 端結構域與TLRs 結合，激活NF-κB和促分裂素原活化蛋白激酶（Mitogen-activated pro-tein kinases，MAPK）信號通路，誘導促炎性細胞因子的分泌，該途徑屬于MyD88 依賴型TLRs 信號轉導通路[15]。TLR-MyD88/IRAK-NF-κB 誘導激酶（NIK）/NF-κB 和TLR-MyD88/IRAK-MAPK 信號途徑，均能夠促進DCs 分泌MHC I 和MHC II 類分子，從而誘導促炎性細胞因子（如TNF、IL-6、IL-1 等）和趨化因子（如CCL4）等的表達[16]。

MyD88缺失小鼠的小腸上皮細胞對RV 易感，導致RV 的傳播能力增強，機體的免疫應答水平降低，IL-β 和IL-18 的轉錄水平無明顯變化，表明RV 感染后小鼠的MyD88 信號通路是參與其固有免疫反應的關鍵[17]。Walther 等的研究結果顯示， RRV 感染MyD88缺失的小鼠，小鼠全部死亡，其肝臟中IFNγ 和腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factor-α，TNFα）的轉錄水平與對照組無明顯差異，表明其免疫應答水平較低[18]。RRV 感染小鼠的膽管細胞能分泌高水平的遷移率族蛋白B1（High mobility group protein box-1，HMGB1），HMGB1 通過TLR2 和TLR4 可以誘導活化NK 細胞，與野生B6 小鼠比較，TLR基因缺失的成年小鼠可通過HMGB1-TLRs-MAPK 信號通路升高CD69、TNF-α 和IFN-γ 的基因轉錄水平[19]。上述結果表明，MyD88基因缺失小鼠對RV 感染的敏感性可能增加，這可能與小鼠機體內(nèi)的微生物群與RV感染復雜的相互作用有關[20]。RV 感染后，宿主MyD88 介導的TLRs 信號轉導通路能夠抑制病毒的感染與傳播，但MyD88基因缺失小鼠能否直接識別RV的成分尚不清楚。

2.2 MyD88 非依賴型TLRs 信號轉導的通路MyD88非依賴型TLR 信號轉導通路又稱TRIF（IFN-β）依賴型信號轉導通路。與TLR2、TLR7、TLR8 均屬于MyD88依賴型信號通路不同，TLR3屬于TRIF依賴型的TLRs/NF-κB 信號通路，誘導NF-κB 的活化。而TLR4 卻有MyD88 依賴型和TRIF 依賴型兩種信號通路[21]。

TLR3 被蛋白酪氨酸激酶磷酸化后募集TRIF，活化的TRIF 從TLR3 中分離出來，通過與腫瘤壞死因子受體作用因子3（TNF receptor associated factors 3，TRAF3）和TRAF6 相互作用并向下游傳遞信號，誘導IRF3 和NF-κB 的活化，促進炎性細胞因子的表達。TLR3 募集TRIF 有兩條信號通路：一是TRIF 的氨基端與TRAF6 的梭基端結合，再與受體蛋白激酶1（Receptor interacting protein kinase 1，RIPK-1）相互作用，從而誘導NF-κB 的活化；二是磷酸化的TRAF3、二聚化的Kappa B 抑制因子激酶（Inhibitor of kappa B kinase，IKK）與IRF3 結合，誘導I 型干擾素基因的表達[22]。

TRIF基因缺失小鼠的信號通路研究中，TLR4 激活IRF3 和產(chǎn)生IFN-β 的能力減弱，炎性細胞因子的分泌減少；而脂多糖刺激TRIF和MyD88基因雙缺失的巨噬細胞，NF-κB 的活化和炎癥細胞因子的表達均受到抑制[23]。Bagchi 等研究牛RV 與HT29 細胞的相互作用機制發(fā)現(xiàn)，RV 感染4 h 即可在HT29 細胞中檢測到腫瘤壞死因子受體作用因子2（TRAF2）的降解，但在非結構性蛋白質(zhì)1（Nonstructural protein 1，NSP1）突變株感染RV 的HT29 細胞中并未檢測到TRAF2 的降解，表明NSP1 通過降解TRAF2 的作用，抑制NF-κB 的活化和IFN 的表達，導致RV 的增殖且逃避宿主的固有免疫反應[24]。本研究室檢測PRV 感染48 h 的TRIF基因缺失小鼠腸系膜淋巴結（Mesenter-ic lymph node，MLN）中MyD88、NF-κB、TRAF3和TRAF6基因的轉錄水平，結果顯示TRIF基因缺失抑制了NF-κB和TRAF3基因的轉錄水平，但對MyD88和TRAF6基因的轉錄水平影響較小，減弱了MLN 中DCs 向不同亞群分化的能力，抑制MHC II 類分子和共刺激分子CD40、CD80 和CD86 的表達[25]。綜上所述，TRIF基因缺失對TRAF3/NF-κB 信號轉導通路有抑制作用，TRIF 及其介導的信號通路在抗RV 的感染中發(fā)揮重要作用。

2.3 與RV 感染相關的干擾素途徑病毒感染可通過TLRs 和維甲酸誘導基因I 受體（RIG-I like recep-tors，RLR）通路啟動IRFs，表達I 型IFN（IFN-α 和IFN-β）或II 型IFN（IFN-γ）參與抗病毒反應。RV 能促進鼠胚胎成纖維細胞和BMDCs 的活化，上調(diào)表達細胞表面標志，促進I 型IFNs 的產(chǎn)生。RRV 感染IRF3缺失小鼠的BMDCs 后，可通過IRF3 依賴途徑調(diào)節(jié)I 型IFN 的表達，而TLR3和MyD88基因均缺失小鼠的BMDCs 表達的I 型IFNs 與對照組相同，表明這些反應不依賴TLRs 信號通路[26]。Hakim 等利用英夫利昔單抗阻斷TNF-α 發(fā)揮作用，結果導致IFN-α 和IFN-β1 的表達量均降低，進一步研究表明TNF-α 具有潛在的抗RV 效應，而該效應是通過NF-κB 信號通路實現(xiàn)的[27]。不同RV 的NSP1 蛋白可降解不同的IRFs，人RV 的NSP1 主要通過降解IRF5 和IRF7 來抑制IFN 信號通路，而動物RV 的NSP1 主要通過降解IRF3、IRF5 和IRF7 來抑制IFN-β 的產(chǎn)生。與高劑量的IFN-γ 單刺激相比，IL-22 和低劑量的IFN-γ聯(lián)合刺激誘導信號轉導與轉錄激活因子1（Signal transducerand activator of transcription 1，STAT1）磷酸化的能力較強，表明IL-22 和IFN-λ 協(xié)作能夠促進STAT1 的活化，從而抑制RV 的復制[28]。以上研究表明，III 型IFNs 在抗RV 感染的固有免疫反應中也起重要作用。

2.4 RV 感染后宿主的T 細胞、B 細胞免疫反應TLRs 可通過激活NF-κB 和IRF3 等誘導多種抗炎細胞因子分泌和I 型IFN 表達，激活固有免疫反應。嬰幼兒急性RV 感染的血清中IL-6、IL-10 和IFN-γ 表達量明顯增加，Th1 和Th2 類細胞因子均參與了宿主的免疫應答[29]，RV 感染通過MyD88 信號通路能夠誘導宿主Th1 反應，MyD88基因缺失不能阻斷IL-1β 和IL-18 信號的產(chǎn)生，導致RV 特異性IgA、IgG2 和IgG1的分泌減少[30]。細菌鞭毛蛋白能夠預防小鼠感染RV，這是因為鞭毛蛋白能夠通過DCs 表達TLR5/NL-RC4 途徑，調(diào)節(jié)IL-22 和IL-18 的分泌[31]。RV 與人外周血單核細胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMC）相互作用時，PBMC 中的pDCs 減少了91%，結果導致IFN-α 的分泌量減少95%，IFN-γ 的分泌量也相應減少，表明pDCs 在刺激宿主產(chǎn)生RV 特異記憶性T 細胞中起重要作用[32]。

RV 感染小鼠小腸的pDCs 通過分泌I 型IFN（IFN-α 和IFN-β）調(diào)節(jié)B 細胞活化并參與免疫應答反應，利于RV 的清除[33]。RRV 能刺激宿主B 細胞的活化， 誘 導CD69 的 表 達， 但B 細 胞 的 活 化 需CD11c+DCs 的參與[34]。阻斷TRIF 信號通路的傳導或TRIF基因的缺失，細胞因子IL-6、IL-10、IL-12 和IFN-γ 的分泌量降低，DCs 分泌細胞因子和刺激T 淋巴細胞增殖的能力減弱[25]。上述結果表明，RV 感染時Th1 和Th2 型細胞因子均發(fā)揮作用，且急性感染后期以Th1 型細胞反應為主。

3 小結與展望

RV 通過影響與宿主TLRs 信號通路轉導相關基因的表達，刺激宿主炎性細胞的分泌造成黏膜損傷，其NSP1 可通過降解宿主IRFs 來拮抗IFN-β 的產(chǎn)生，從而抑制STAT1、STAT2 和NF-κB 的表達，逃避宿主抗病毒的固有免疫反應。TLRs 下游基因的缺失也將影響RV 感染后宿主DCs 所誘導的黏膜免疫分子機制。阻斷TRIF 信號可抑制TRAF3 和TRAF6 的泛素化過程，使NF-κB 的活化受阻，促炎細胞因子分泌的減少。本研究室利用TRIF 阻斷劑（Pepinh-TRIF）阻斷TLRs 關鍵接頭分子的TRIF 信號后發(fā)現(xiàn)，PRV 感染小鼠BMDCs 的表型分化、基因轉錄以及細胞因子的分泌均受到影響，且抑制了TRAF3/NF-κB 信號通路的轉導，表明TRIF 信號通路在抗PRV 感染中發(fā)揮重要作用（數(shù)據(jù)未發(fā)表）。進一步探究缺失MyD88基因或雙阻斷TRIF 和MyD88 信號通路后，RV 感染宿主DCs所介導的TLRs 信號轉導通路的變化，對了解宿主抗RV 感染的固有免疫機制，促進RV 疫苗的研究有重要意義。