王以欣，姜曉霞，孫曉波，韓美婧，張曉梅，喬薪瑗，賈 爍*，徐義剛

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.浙江省畜禽綠色生態(tài)健康養(yǎng)殖應(yīng)用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室浙江農(nóng)林大學(xué)動物科技學(xué)院動物醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 311300）

牛病毒性腹瀉-黏膜病（Bovine viral diarrhea-mu-cosal disease，BVD-MD）又稱牛病毒性腹瀉?。˙VD），是由BVD 病毒（BVDV）感染牛引起的一種接觸性、熱性傳染病，該病在世界范圍內(nèi)廣泛分布，是造成全球養(yǎng)牛業(yè)經(jīng)濟(jì)損失的主要疫病之一[1]。BVD 的臨床癥狀主要表現(xiàn)為腹瀉、高熱、白細(xì)胞減少、急性或慢性黏膜病、免疫抑制、持續(xù)性感染（Persistent infec-tion，PI）、母畜流產(chǎn)等[2]。其中，PI 牛是BVD 的主要傳染源，持續(xù)排毒感染其他健康牛致其免疫抑制，PI 牛免疫力下降，易繼發(fā)感染其他病原，從而造成更大的經(jīng)濟(jì)損失。BVDV 屬于黃病毒科瘟病毒屬成員，為單股正鏈RNA 病毒，基因組全長約12.3 kb～12.5 kb，由5'-非翻譯區(qū)、3'-非翻譯區(qū)和一個大開放閱讀框組成，編碼12 種蛋白，包括4 種結(jié)構(gòu)蛋白和8種非結(jié)構(gòu)蛋白[3]。

BVDV 致病機(jī)理非常復(fù)雜，給BVD 的防控和凈化帶來極大的困難和挑戰(zhàn)。目前針對BVD 的防控，一方面通過疫苗接種預(yù)防，但由于PI 牛的存在，常常導(dǎo)致免疫失??；另一方面通過篩查和淘汰PI 牛的方式剔除傳染源并切斷傳播途徑以凈化畜群[4]，其中病原檢測在防控BVDV 感染和畜群疫病凈化方面發(fā)揮著重要作用。此外，BVDV 也是引起牛呼吸道疾病綜合征（BRDC）的主要病原之一，在臨床上，BVDV引起B(yǎng)RDC 的癥狀與牛傳染性鼻氣管炎病毒、牛副流感病毒3 型和牛呼吸道合胞體病毒引起B(yǎng)RDC 的癥狀相似，且常見混合感染，極大地增加了疫病診斷與防制難度[5]。因此，建立BVDV 快速準(zhǔn)確的檢測方法尤為重要。本研究利用BVDV 全病毒為免疫原制備BVDV 單克隆抗體（MAb），并初步用于該病毒檢測，為BVDV 快速檢測方法的建立提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒株、菌株、細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動物BVDV ZD-2018 株、牛細(xì)小病毒（BPV）、牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）、牛輪狀病毒（BRV）、牛呼吸道合胞體病毒（BRSV）、牛副流感病毒3 型（BPIV3）、MDBK 細(xì)胞和骨髓瘤（SP2/0）細(xì)胞、pCold-TF 質(zhì)粒均由本實(shí)驗(yàn)室保存；豬瘟病毒（CSFV）活疫苗株購自齊魯動物保健品有限公司；大腸桿菌BL21 感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金公司；6 周齡～8 周齡BALB/c 小鼠購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心；10 日齡健康新生犢牛購自黑龍江省雙城市雀巢有限公司；實(shí)驗(yàn)動物的使用按照東北農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)實(shí)驗(yàn)動物福利與倫理的規(guī)定進(jìn)行。

1.2 主要試劑弗氏完全/不完全佐劑、聚乙二醇6000、HAT、HT、IPTG、辣根過氧化物酶（HRP）、3C Protease，均購自Sigma 公司；HiTrapTMProtein G HP 抗體純化親和柱購自GE 公司；HisPureTMNi-NTR Resin、LinKineTMHRP 標(biāo)記試劑盒和MAb 亞類鑒定試劑盒購自Thermo Fisher 公司；FITC 標(biāo)記山羊抗鼠IgG和HRP 標(biāo)記山羊抗鼠IgG 購自北京中杉金橋公司；DMEM 培養(yǎng)基購自源培生物科技有限公司；胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司。BVDV 結(jié)構(gòu)蛋白C、E0、E1、E2 為本實(shí)驗(yàn)室前期原核表達(dá)純化后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 動物免疫采用蔗糖密度梯度離心法純化BVDV ZD-2018 株， 經(jīng)超微量紫外分光光度計測定病毒總蛋白濃度，取400 μg 與等體積的弗氏完全佐劑混合，充分乳化后經(jīng)腹腔注射免疫BALB/c 小鼠，劑量為100 μg/只；每間隔兩周使用弗氏不完全佐劑乳化后進(jìn)行第二次免疫和第三次免疫。第三次免疫后7 d 斷尾采血，以純化的BVDV 全病毒為包被抗原，以采集的待檢小鼠血清為一抗，HRP 標(biāo)記山羊抗鼠IgG（1：5 000）為二抗，采用間接ELISA 方法檢測小鼠血清抗體效價，當(dāng)抗體效價小于1：12 800 時，加強(qiáng)免疫一次。

1.4 MAb 的制備、穩(wěn)定性及亞類的鑒定于加強(qiáng)免疫后第5 d，無菌取小鼠脾細(xì)胞與SP2/0 細(xì)胞融合，以純化的BVDV 全病毒為包被抗原， 雜交瘤細(xì)胞上清液為一抗，HRP 標(biāo)記山羊抗鼠IgG（1：5 000）為二抗，采用間接ELISA 方法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)有限稀釋法連續(xù)克隆純化5 次后，當(dāng)細(xì)胞上清陽性率為100%時，則表明獲得了分泌MAb 的雜交瘤細(xì)胞株，將陽性雜交瘤細(xì)胞連續(xù)傳20 代，并將細(xì)胞株凍存3 個月后復(fù)蘇，采用間接ELISA 方法（方法同上）評價該雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定性，并采用MAb 亞類鑒定試劑盒鑒定制備的MAb 亞類。

1.5 MAb 的特異性試驗(yàn)分別將BVDV、IBRV、BPV、BPV、BRV、BRSV、BPIV3 和CSFV 全病毒（103TCID50/0.1 mL）包被ELISA 反應(yīng)板，以制備的雜交瘤細(xì)胞上清原液為一抗，HRP 標(biāo)記山羊抗鼠IgG（1：5 000）為二抗，通過間接ELISA 法檢測制備的MAb 的特異性。

1.6 MAb 與BVDV 反應(yīng)性的間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）將BVDV ZD-2018 株接種于96 孔細(xì)胞板中長滿單層的MDBK 細(xì)胞，同時設(shè)MDBK 細(xì)胞對照組，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)30 h，棄培養(yǎng)液，每孔加入100 μL預(yù)冷的無水乙醇，室溫固定30 min；每孔加入2%的Triton-X100，透膜10 min；然后加入0.3%的BSA 37 ℃封閉30 min。以雜交瘤細(xì)胞上清原液為一抗，以FITC 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（1：200）為二抗，經(jīng)IFA 檢測MAb與BVDV 反應(yīng)性。

1.7 MAb 用于檢測BVDV 結(jié)構(gòu)蛋白的western blot 方法將BVDV 病毒結(jié)構(gòu)蛋白C、E、E1、E2 分別進(jìn)行SDS-PAGE 后，分別以制備的6 株MAb（1：100）為一抗，以HRP 標(biāo)記山羊抗鼠IgG（1：1 000）為二抗，通過western blot 分別檢測制備的MAb 與BVDV 病毒結(jié)構(gòu)蛋白C、E、E1、E2 的反應(yīng)性。

1.8 MAb 4H6A6 腹水的制備及其效價的檢測選擇MAb 4H6A6 雜交瘤細(xì)胞經(jīng)腹腔注射小鼠，當(dāng)其腹部膨脹明顯時抽取腹水，利用HiTrapTMProtein G HP 抗體純化柱純化MAb 4H6A6 腹水，經(jīng)SDS-PAGE 檢測后，以BVDV全病毒為包被抗原，以純化的MAb 4H6A6腹水（10 倍倍比稀釋）為一抗，HRP 標(biāo)記山羊抗鼠IgG（1：5 000）為二抗，采用間接ELISA 測定純化后的MAb 4H6A6腹水效價，設(shè)SP2/0制備的小鼠腹水為陰性對照。

1.9 利用HRP 標(biāo)記的MAb 4H6A6 檢測BVDV 的免疫組化試驗(yàn)將健康犢牛分為兩組（實(shí)驗(yàn)組和對照組），每組1 頭，實(shí)驗(yàn)組經(jīng)口服途徑感染2 mL 106TCID50/0.1 mL 的BVDV ZD-2018 株，對照組口服同體積的DMEM 培養(yǎng)液作為對照，逐日觀察犢牛臨床癥狀，當(dāng)實(shí)驗(yàn)組犢牛出現(xiàn)腹瀉癥狀時，將兩組犢牛迫殺后采集腸道組織制備石蠟切片。利用LinKineTMHRP 試劑盒標(biāo)記純化的MAb 4H6A6 后，進(jìn)行免疫組化檢測，標(biāo)準(zhǔn)操作過程包括：石蠟包埋腸道組織、切片、脫蠟、抗原修復(fù)、3%過氧化氫孵育、山羊血清封閉、HRP 標(biāo)記4H6A6 孵育（1：100）、DAB 顯色、蘇木素復(fù)染、透明、封片和鏡檢。

2 結(jié) 果

2.1 分泌BVDV MAb 陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選、MAb穩(wěn)定性及亞類鑒定結(jié)果以BVDV 免疫小鼠，取脾細(xì)胞與SP2/0 細(xì)胞融合，采用間接ELISA 方法（以純化的BVDV 全病毒為包被抗原）篩選陽性雜交瘤細(xì)胞、有限稀釋法進(jìn)行亞克隆。結(jié)果顯示，共獲得6株分泌BVDV MAbs 的雜交瘤細(xì)胞株，命名為6D2F2、4H6A6、1D8C7、1GBD8、1C7E7 和3A8E1。將6 株 陽性雜交瘤細(xì)胞連續(xù)傳20 代，采用間接ELISA 方法測定每代細(xì)胞上清的OD450nm值，同時將細(xì)胞株凍存3個月，復(fù)蘇細(xì)胞后再檢測其分泌MAb 能力。結(jié)果顯示，陽性雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的能力在連續(xù)傳代（以F1、F2 和F20 代結(jié)果為例）和凍存后未見顯著變化（表1），顯示了其良好的穩(wěn)定性。利用MAb 亞類鑒定試劑盒鑒定所制備的MAbs 亞類，結(jié)果顯示，獲得的6株MAb 均為IgG 類抗體，其中6D2F2、1G8D8、1C7E7和3A8E1 屬 于IgG2α 亞 類，4H6A6 屬 于IgG1 亞 類，1D8C7屬于IgG2b亞類。

表1 雜交瘤細(xì)胞分泌MAb的穩(wěn)定性檢測結(jié)果Table 1 Stability test of hybridoma cells secreting MAbs

2.2 MAb 的特異性檢測結(jié)果分別將CSFV、IBRV、BPV、BRV、BRSV、BPIV3 和BVDV 作為包被抗原，采用間接ELISA方法檢測該6株MAb的特異性，結(jié)果顯示，制備的MAb僅與BVDV發(fā)生特異性反應(yīng)（圖1），表明獲得的6 株MAb 特異性良好。

圖1 MAb特異性的ELISA檢測結(jié)果Fig.1 Specificity of MAbs detected by ELISA

2.3 MAb 與BVDV 反應(yīng)性的IFA 鑒定結(jié)果將BVDV ZD-2018 株接種至MDBK 細(xì)胞，采用IFA 分別鑒定各MAb 與BVDV 的反應(yīng)性。結(jié)果顯示，6D2F2、4H6A6、1D8C7、1G8D8、1C7E7 和3A8E1 均 能 特 異 性 識 別BVDV，感染病毒組細(xì)胞呈現(xiàn)特異性綠色熒光，而對照組未見熒光（圖2），表明制備的6 株MAb 均能用于IFA 檢測BVDV。

圖2 MAb的IFA鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of monoclonal antibodies by IFA

2.4 MAb 用于檢測BVDV 結(jié)構(gòu)蛋白的western blot鑒定結(jié)果通過western blot 鑒定制備的6 株MAbs 與BVDV 結(jié)構(gòu)蛋白C、E0、E1、E2的反應(yīng)性，結(jié)果顯示，MAb 6D2F2、4H6A6、1D8C7和1G8D8能夠特異性地識別BVDV E2 蛋白，MAb 1C7E7 和3A8E1 能夠特異性地識別BVDV E0蛋白（圖3），表明制備的各MAb 可用于建立western blot 方法鑒定BVDV 相應(yīng)的結(jié)構(gòu)蛋白。

圖3 MAb與BVDV結(jié)構(gòu)蛋白反應(yīng)的western blot鑒定結(jié)果Fig.3 Identification of monoclonal antibodiesagainst viral structure proteins by western blot

2.5 MAb 4H6A6 腹水的制備、純化及效價的測定結(jié)果將4H6A6雜交瘤細(xì)胞經(jīng)腹腔注射BALB/c 小鼠，制備腹水，經(jīng)純化獲得總濃度為1.07 mg/mL 的腹水；SDS-PAGE 分析顯示，抗體重、輕鏈清晰可見，且雜蛋白較少（圖4），通過ELISA 方法測定MAb 4H6A6 腹水效價為1：106。

圖4 MAb 4H6A6腹水純化的SDS-PAGE檢測Fig.4 Purification result of MAb 4H6A6 ascites analyzed by SDS-PAGE

2.6 HRP標(biāo)記的4H6A6用于免疫組化試驗(yàn)檢測BVDV的結(jié)果采集BVDV 感染的犢牛腸道組織樣品，制作石蠟切片，利用HRP標(biāo)記4H6A6腹水作為一抗，經(jīng)免疫組化試驗(yàn)檢測腸道組織中的BVDV，結(jié)果顯示，HRP 標(biāo)記的4H6A6 能夠特異性識別組織中的病毒，呈現(xiàn)棕褐色，而正常對照組未見棕褐色（圖5），表明HRP 標(biāo)記MAb 4H6A6 可用于免疫組化試驗(yàn)檢測組織中的VDV。

圖5 腸道組織中BVDV的免疫組化檢測結(jié)果Fig.5 Immunohistochemical result of BVDV infection in intestinal tissue

3 討 論

BVDV 是危害養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展的主要病原之一，其感染呈世界性分布。BVDV 可抑制牛免疫系統(tǒng)，使其易受其他致病微生物侵襲，導(dǎo)致牛群生產(chǎn)力、健康和繁殖效率降低，造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大[6-7]。目前BVDV 感染在我國牛群中較為普遍，由于PI 牛的存在，其體內(nèi)抗體滴度低以及母源抗體影響等因素，在生產(chǎn)實(shí)踐中檢測病原具有實(shí)際意義。國內(nèi)外學(xué)者針對BVDV 遺傳物質(zhì)建立了多種檢測方法，如RTPCR 方法、熒光定量RT-PCR 方法、等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)（IAT）、重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（RPA）等[8]，為疫病診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了必要的技術(shù)支持。此外，捕獲ELISA 也是BVDV 最常使用的檢測方法之一[9-10]，而建立有效的捕獲ELISA 方法需要制備能夠特異識別病原的MAb。

BVDV、CSFV 和綿羊邊界病毒（BDV）同為黃病毒科瘟病毒屬成員，抗原表位存在相似性，制備出特異性良好的BVDV MAb 存在概率性。王新華等通過聚乙二醇濃縮法濃縮BVDV，免疫小鼠獲得8 株BVDV 的MAb，均與CSFV存在交叉反應(yīng)[11]。王富饒等用蔗糖密度梯度離心法純化BVDV，免疫小鼠制得1 株MAb，與CSFV 和BDV 均不發(fā)生交叉反應(yīng)[12]。聶明非等利用表達(dá)BVDV E2 蛋白的重組真核表達(dá)質(zhì)粒獲得2 株MAb，且與CSFV 和BDV 均無交叉反應(yīng)[13]。楊立新等利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)BVDV 非結(jié)構(gòu)蛋白NS3，以此免疫小鼠獲得8 株穩(wěn)定分泌BVDV NS3 蛋白MAb 的雜交瘤細(xì)胞，均與CSFV無交叉反應(yīng)[14]。以往研究結(jié)果顯示，目前用于制備BVDV MAb 的免疫原主要有3 種形式，包括原核表達(dá)的蛋白、真核表達(dá)的蛋白和濃縮的BVDV 全病毒。其中，利用原核表達(dá)的蛋白制備MAb，優(yōu)點(diǎn)是免疫原較為純凈，且獲取方法相對簡單，而且但原核表達(dá)的蛋白構(gòu)象簡單，與真實(shí)的蛋白結(jié)構(gòu)存在明顯差異，由其制備的MAb 與靶抗原結(jié)合力不強(qiáng)；用真核表達(dá)的蛋白制備MAb，雖然真核系統(tǒng)表達(dá)蛋白的構(gòu)象接近于天然蛋白，但蛋白表達(dá)量相對較少；與利用重組蛋白制備MAb 的方法相比，利用全病毒免疫制備的MAb 更加接近病毒的天然結(jié)構(gòu)，能更好地識別病毒，其敏感性更高和結(jié)合力更強(qiáng)[15]。因此，本研究選用BVDV 全病毒作為免疫原以制備BVDV MAb。本研究采用超速離心和蔗糖密度梯度離心法純化BVDV，免疫小鼠，經(jīng)過篩選獲得6 株穩(wěn)定分泌BVDV MAb的雜交瘤細(xì)胞，分別為6D2F2、4H6A6、1D8C7、1G8D8、1C7E7 和3A8E1。經(jīng)IFA、ELISA 方法檢測顯示，所獲6株IgG型MAb均能特異性識別BVDV，且與CSFV、IBRV、BPV、BRV、BRSV 和BPIV3 等均無交叉反應(yīng)，顯示了良好的特異性。制備的6 株MAb 可以用于IFA特異性檢測BVDV。

目前常見以BVDV 全病毒免疫，在誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答過程中，BVDV 囊膜蛋白E0 和E2 發(fā)揮了重要作用，這與病毒自然感染過程中，機(jī)體產(chǎn)生病毒抗體的規(guī)律相符；結(jié)構(gòu)蛋白E0 和E2 是BVDV 主要的保護(hù)性抗原，含有中和表位，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[16-18]。本研究獲得的6 株MAb 中，6D2F2、4H6A6、1D8C7 和1G8D8 能夠特異性識別BVDV E2 蛋白，1C7E7 和3A8E1 能夠特異性識別BVDV E0 蛋白。所獲得的可識別E0 和E2 蛋白的MAb 是否具有中和活性，需要后續(xù)評估，但本研究結(jié)果表明制備的MAb可用于western blot 實(shí)驗(yàn)檢測相應(yīng)BVDV 結(jié)構(gòu)蛋白。為進(jìn)一步開發(fā)利用制備的MAb，本研究利用HRP 標(biāo)記MAb 4H6A6 經(jīng)免疫組化方法檢測感染組織中的BVDV，結(jié)果顯示，HRP 標(biāo)記4H6A6 能夠特異性識別組織中的病毒，顯示了較好的應(yīng)用潛力。

綜上所述，本研究制備的BVDV MAb 不僅可用于建立BVDV 的快速檢測方法，也可用于病毒的基礎(chǔ)研究，為BVDV 的快速檢測及致病機(jī)制研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。