劉彥玲，裴艷艷，李敏杰，楊德成，王海偉，于 力，田志軍，周國輝

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所豬病綜合防控創(chuàng)新團(tuán)隊，黑龍江 哈爾濱 150069）

口蹄疫（Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒（FMDV）感染引起的偶蹄動物共患的急性、熱性、高度接觸性傳染病[1]。鑒于FMD 對世界經(jīng)濟(jì)造成的嚴(yán)重危害，國際獸疫局（OIE）和聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）將其列為A 類傳染病，我國也將其列為一類動物傳染病。疫苗接種是特異性預(yù)防FMD 的有效手段，因此安全有效的疫苗是預(yù)防、控制乃至最終消滅FMD 的先決條件。雖然OIE 推薦的FMDV 滅活疫苗在消滅歐洲的FMD 以及控制世界其他國家的FMD 過程中發(fā)揮了重要作用，但其存在一些不足之處，如：疫苗生產(chǎn)過程中存在病毒滅活不徹底導(dǎo)致FMD 暴發(fā)可能性；不能鑒別診斷感染動物和免疫動物等。因此急需一種更加安全有效的FMD 疫苗。目前利用缺陷型腺病毒活載體構(gòu)建的FMDV 衣殼蛋白疫苗已逐漸成為研究的熱點，有望成為第二代FMD 疫苗。

FMDV 衣殼蛋白前體P1-2A 含有FMDV 的主要抗原決定簇，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，從而保護(hù)動物免受FMDV 的攻擊[2-3]。目前，國內(nèi)外有關(guān)利用不同活載體構(gòu)建FMDV 衣殼蛋白活載體疫苗的報道較多，所用的病毒載體有雞痘病毒、偽狂犬病病毒、腺病毒和桿狀病毒。其中以缺陷型腺病毒5 型構(gòu)建的FMDV 衣殼蛋白活載體疫苗的研究最為深入，也取得了很好的免疫效果。

FMD 防控的艱巨性，在很大程度上源自病毒本身的結(jié)構(gòu)和流行特點。FMDV 是高度變異的病毒，在迄今已鑒定的7 種血清型病毒之間無交叉保護(hù)，意味著要針對性制備相應(yīng)疫苗；同一血清型的病毒株又可分成若干基因型，如O 型FMDV 目前分為8 個基因型（或稱拓?fù)湫停?，這些基因型之間的病毒株可能不能提供交叉保護(hù)。目前國內(nèi)外多用腺病毒載體構(gòu)建A 型（A12 和A24）和O 型（O1 Campos）FMDV 衣殼蛋白用于免疫動物，并取得了一定的免疫保護(hù)效果[4-6]。但尚未見到有關(guān)O 型新發(fā)泛亞譜系FMDV 衣殼蛋白的報道。而根據(jù)O 型新發(fā)泛亞譜系FMD 在我國的流行趨勢，有關(guān)該譜系FMD 疫苗的研究顯得尤為重要?；诖耍狙芯繕?gòu)建了表達(dá)O 型新發(fā)泛亞譜系FMDV P1-2A-3C 基因的重組腺病毒，并在BALB/c 鼠體內(nèi)評價了該O 型新發(fā)泛亞譜系FMDV 衣殼蛋白的免疫原性，為表達(dá)O 型FMDV 衣殼蛋白重組腺病毒活載體疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料腺病毒骨架載體pAdEasy-1、腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV、大腸桿菌BJ5183 感受態(tài)細(xì)胞以及AD-293 細(xì)胞均購自Stratagene 公司；大腸桿菌JM109、DH5 α 感受態(tài)細(xì)胞和pOK 質(zhì)粒由本實驗室保存；PmeI 購自NEB BioLabs 產(chǎn)品；轉(zhuǎn)染試劑Effectene Transfection Reagent 購自QIAGEN 公司；FMDV VP2 MAb 10B10 由本實驗室制備及保存；206佐劑購自Seppic 公司；HRP 標(biāo)記兔抗鼠IgG，F(xiàn)ITC-標(biāo)記羊抗鼠IgG 購自Sigma 公司；無外源基因表達(dá)的野生型腺病毒（wtAdv）由本實驗室構(gòu)建并保存；O 型FMDV 滅活疫苗（內(nèi)含146S 蛋白）購自楊凌金海技術(shù)有限公司；O 型FMDV VP1 抗體ELISA 試劑盒購自北京標(biāo)馳澤惠公司。

1.2 重組腺病毒穿梭載體的構(gòu)建與鑒定由吉林省庫美生物科技公司合成FMDV 泛亞型O/YS/CHA/05 株（HM008917）P1-2A-3C 基 因，分 別 引 入Hind Ⅲ、EcoR V 酶切位點，并且在起始密碼子ATG 前引入ko-zak 序列，克隆至pOK 載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pOK-P1-2A-3C。將質(zhì)粒pOK-P1-2A-3C 和腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV 分別經(jīng)Hind III 和EcoR V 雙酶切后回收純化并連接，轉(zhuǎn)化至JM109 感受態(tài)細(xì)胞構(gòu)建重組腺病毒穿梭載體，經(jīng)酶切鑒定正確的質(zhì)粒命名為pShut-tle-P12A3C。

1.3 重組腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建、傳代及PCR 鑒定將pShuttle-P12A3C 用PmeI 線性化，電轉(zhuǎn)化至含有腺病毒骨架載體AdEasy-1 的BJ5183 感受態(tài)細(xì)胞中，構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒，經(jīng)測序鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pAdV-P12A3C。將5 μg 質(zhì)粒pAdV-P12A3C 利用Effectene Transfection Reagent 試劑轉(zhuǎn)染到293 細(xì)胞中，9 d 后收獲上清液，即為初代重組腺病毒（命名為rAdV-P12A3C）。將其反復(fù)凍融后，離心取上清，接種于293 細(xì)胞，連續(xù)傳8 代，觀察細(xì)胞病變情況；取4、6 和8 代重組腺病毒，用蛋白酶K 處理后提取DNA 作為模板，利用引物P12A3CF：5'-CTTAAGCT TCCACCATGGGTGCCGGGCAATCCAGCCCGGCGAC-3'/P12A3CR：5'-CTCGATATCTTACTCGTGGTGTGGTTCG GGATC-3'進(jìn) 行PCR 鑒定。

1.4 不同代次rAdV-P12A3C 遺傳穩(wěn)定性的鑒定取2、4、6、8 代rAdV-P12A3C，分別以MOI 15 接種于96 孔板中長至90%單層的293 細(xì)胞，24 h 后棄去培養(yǎng)基，PBS 洗滌細(xì)胞3 次后，用預(yù)冷的無水乙醇固定15 min，以FMDV VP2 的MAb 10B10[7]（1：1 000）為一抗， FITC 標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1：200）為二抗，以wtAdV 感染的293 細(xì)胞和正常的293 細(xì)胞作為對照，通過間接免疫熒光試驗（IFA）鑒定rAdV-P12A3C 外源蛋白表達(dá)的穩(wěn)定性。

同時，收集2、4、6、8 代感染rAdV-P12A3C 的293 細(xì)胞，以VP2 MAb 10B10（1：1 000）為一抗，HRP標(biāo)記兔抗鼠IgG（1：10 000）為二抗，通過western blot進(jìn)一步鑒定重組腺病毒的穩(wěn)定性，設(shè)FMDV 疫苗146S 蛋白作為陽性對照，野生型腺病毒感染的293細(xì)胞作為陰性對照。

1.5 rAdV-P12A3C 生長曲線的測定分別用MOI 10 劑量的第8 代重組腺病毒（rAdV-P12A3C）和野生型腺病毒（wtAdV）接種293 細(xì)胞，在接種后12 h、24 h、36 h、48 h、60 h 和72 h 收取上清液，參照文獻(xiàn)[8]方法進(jìn)行病毒效價測定，并繪制重組腺病毒與野生型腺病毒的一步生長曲線。

1.6 BALB/c 小鼠的免疫試驗及VP1 抗體檢測取7周齡BALB/c 小鼠20 只，采用IFA 檢測Ad5 抗體為陰性后隨機(jī)分成4 組，每組5 只。A 組接種本研究制備的重組腺病毒（5×107TCID50/mL），200 μL/只，在首免后第4 周以相同劑量加強(qiáng)免疫；B 組接種O 型FMDV 滅活疫苗，200 μL/只，在首免后第4 周以相同劑量加強(qiáng)免疫；C 組接種與等體積206 佐劑乳化后的重組腺病毒（5×107TCID50/mL），200 μL/只，在首免后第4 周以相同劑量加強(qiáng)免疫；D 組接種同劑量的Ad5 野生型腺病毒，200 μL/只。各組小鼠均采用后腿肌肉注射免疫。將上述BALB/c 小鼠從首免后開始每間隔一周經(jīng)斷尾采血并分離血清，采用O 型FMDV VP1 抗體ELISA 試劑盒檢測BALB/c 小鼠血清中的抗體水平。

2 結(jié) 果

2.1 重組腺病毒穿梭載體的鑒定結(jié)果將質(zhì)粒pOK-P1-2A-3C 和腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV 雙酶切后連接轉(zhuǎn)化至JM109 感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建重組腺病毒穿梭載體質(zhì)粒。酶切鑒定結(jié)果顯示，在約7 500 bp和2 500 bp 處有兩條目的條帶（圖1），與重組腺病毒穿梭載體預(yù)期大小相符，初步表明重組腺病毒穿梭載體構(gòu)建正確。

圖1 重組腺病毒穿梭載體的酶切鑒定結(jié)果Fig.1 Restriction enzyme digestion result of recombinant adenovirus pShuttle vector

2.2 重組腺病毒的構(gòu)建、傳代及PCR 鑒定結(jié)果將重組腺病毒穿梭載體用限制性內(nèi)切酶PmeI 線性化，電轉(zhuǎn)化至含有腺病毒骨架載體AdEasy-1 的BJ5183 感受態(tài)細(xì)胞中，構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒pAdVP12A3C。將質(zhì)粒pAdV-P12A3C 轉(zhuǎn)染至293 細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后9 d 細(xì)胞開始出現(xiàn)變圓、變大、脫落等細(xì)胞病變（CPE）。第9 d 收獲上清液傳代，每代均出現(xiàn)CPE，當(dāng)傳至第5 代時，細(xì)胞于接種病毒后24 h～48 h 均出現(xiàn)CPE（圖2B）。取第4、6 和8 代重組腺病毒，提取重組病毒DNA，經(jīng)PCR 鑒定結(jié)果顯示，每代均能擴(kuò)增到3.5 kb 的目的條帶，與重組腺病毒rAdV-P12A3C預(yù)期相符；而野生型腺病毒無該目的條帶（圖3）。初步表明獲得了重組腺病毒rAdV-P12A3C。

圖2 重組腺病毒rAdV-P12A3C感染293細(xì)胞引起的CPEFig.2 CPE of rAdV-P12A3C infected 293 cells

圖3 不同代次重組腺病毒rAdV-P12A3C的PCR鑒定結(jié)果Fig.3 PCR identification results of recombinant adenovirus rAdV-P12A3C

2.3 rAdV-P12A3C 遺傳穩(wěn)定性鑒定結(jié)果將2、4、6、8 代rAdV-P12A3C 分別以MOI 15 接種于293 細(xì)胞后經(jīng)IFA 檢測，結(jié)果顯示，2、4、6、8 代重組腺病毒感染的細(xì)胞均出現(xiàn)明顯的綠色熒光，而對照組無該熒光（圖4）。表明獲得了能夠穩(wěn)定表達(dá)FMDV-VP2蛋白的重組腺病毒rAdV-P12A3C。

圖4 重組腺病毒rAdV-P12A3C遺傳穩(wěn)定性的IFA檢測Fig.4 Detection of genetic stability of recombinant adenovirus rAdV-P12A3C by IFA

對不同代次重組腺病毒感染的293 細(xì)胞進(jìn)行western blot 分析，結(jié)果顯示：感染2、4、6、8 代重組腺病毒的293 細(xì)胞在約24 ku 和37 ku 處均出現(xiàn)VP3、VP0 目的條帶，與FMDV 疫苗146S 蛋白結(jié)果一致，而野生型腺病毒感染的293 細(xì)胞無目的條帶（圖5）。進(jìn)一步表明rAdV-P12A3C能夠穩(wěn)定表達(dá)FMDV衣殼蛋白。

圖5 重組腺病毒rAdV-P12A3C遺傳穩(wěn)定性的western blot檢測Fig.5 Detection of genetic stability of recombinant adenovirus rAdV-P12A3C by western blot

2.4 rAdV-P12A3C 生長曲線的測定結(jié)果經(jīng)測定不同時間點的病毒滴度，并繪制重組腺病毒rAdVP12A3C 與其親本病毒wtAdV 的一步生長曲線。結(jié)果顯示，隨著感染時間的延長，重組腺病毒的病毒滴度逐漸升高，在60 h 時病毒滴度達(dá)到峰值7.2×108TCID50/mL，隨后開始下降（圖6）；而親本病毒wtAdV各時間點的病毒滴度均略高于重組腺病毒，但二者差異不顯著。表明外源基因插入后對重組腺病毒的復(fù)制未造成明顯影響。

圖6 重組腺病毒rAdV-P12A3C的生長曲線Fig.6 The growth curve of recombinant adenovirus rAdV-P12A3C in 293 cells

2.5 BALB/c 小鼠的免疫試驗及VP1 抗體檢測結(jié)果分別采集接種重組腺病毒rAdV-P12A3C 免疫組（A 組）、O 型FMDV 滅活苗組（B 組）、重組腺病毒rAdV-P12A3C 與等體積206 佐劑乳化組（C 組）和Ad5 野生型腺病毒組（D 組）BALB/c 小鼠血清，采用間接ELISA 試劑盒檢測各組BALB/c 小鼠血清抗體水平。結(jié)果顯示，A 組、B 組和C 組BALB/c 小鼠均在接種后3 周出現(xiàn)FMDV 特異性VP1 抗體，隨后抗體水平逐漸升高，在二免后3 周（一免后7 周）抗體水平達(dá)到峰值，到一免后24周抗體水平接近陰性；并且C 組 抗 體 水 平 極 顯 著 高 于A 組（P<0.01）和B 組（P<0.01）；而D 組未產(chǎn)生任何針對FMDV 的抗體（圖7）。表明重組腺病毒能夠刺激BALB/c 小鼠機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體。

圖7 各組BALB/c小鼠血清VP1抗體的動態(tài)變化Fig.7 Dynamic change of antibody levels in immunized mice

3 討 論

FMDV 滅活疫苗具有良好的免疫原性，在預(yù)防和控制FMD 的過程中發(fā)揮著重要作用，但由于其免疫期較短、副作用較強(qiáng)、存在安全隱患、難以鑒別診斷感染動物和免疫動物等缺點，需要一種更加安全有效的FMD 疫苗。目前，F(xiàn)MDV 活載體疫苗研究是熱點，而腺病毒載體疫苗是最有效的遞呈外源抗原的表達(dá)系統(tǒng)，可誘導(dǎo)人和多種動物特異性體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。FMDV 衣殼蛋白具有與完整病毒相同的免疫學(xué)特性，且不存在散毒的風(fēng)險，因而利用各種表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)FMDV 衣殼蛋白一直是國內(nèi)外研究的熱點。FMDV 活載體疫苗有望能克服FMD 傳統(tǒng)疫苗的缺點，成為FMD 第二代新型疫苗。

與其他表達(dá)載體相比，腺病毒表達(dá)載體具有許多優(yōu)點：腺病毒基因結(jié)構(gòu)和功能研究比較清楚、感染譜廣、病毒滴度高、可插入外源基因容量大、不用佐劑、不需要提純、制作成本低、可折疊和修飾表達(dá)蛋白、表達(dá)蛋白活性良好[9]；重組腺病毒免疫接種7 d 后攻毒即可誘導(dǎo)完全的保護(hù)性免疫，此時IgG抗體水平并不太高，說明有其他免疫因素參與，如細(xì)胞免疫、黏膜免疫、天然免疫等[10]，這就使得與其他的活載體疫苗相比較，腺病毒表達(dá)載體的優(yōu)勢更加突出。因此本研究選擇腺病毒表達(dá)載體構(gòu)建rAdV-P12A3C，用于免疫小鼠，檢測其免疫效果。

FMDV P1-2A-3C 基因序列的正確拼接，以及3C蛋白酶充分發(fā)揮裂解FMDV 前體蛋白作用，會對后期動物免疫試驗的效果產(chǎn)生重要影響。Mayr 等構(gòu)建了含A 型FMDV 基因組P1-2A-3C 的重組腺病毒，并對構(gòu)建的一株重組腺病毒的3C 蛋白酶基因進(jìn)行了突變，從而使3C 蛋白酶不能發(fā)揮裂解蛋白的作用，在后期的動物免疫試驗中此株重組腺病毒就不能夠誘導(dǎo)動物產(chǎn)生中和抗體[4]。本研究中重組腺病毒rAdVP12A3C 在體外通過IFA 和western blot 均鑒定了其正確的表達(dá)和裂解；免疫接種BALB/c 小鼠后再采用間接ELISA 檢測小鼠血清中產(chǎn)生的較高水平的IgG 抗體。這些結(jié)果表明本研究中FMDV P1-2A-3C 基因在重組腺病毒中的正確表達(dá)，并且3C 蛋白酶發(fā)揮了其裂解作用。

真核核糖體RNA 對翻譯起始位點序列的識別受到ATG 起始密碼子兩側(cè)mRNA 序列的影響。如果在ATG 起始密碼子的前面插入Kozak 序列會顯著提高目的基因的表達(dá)水平。本研究設(shè)計目的基因時在ATG翻譯起始位點引入了Kozak 序列，從而保證目的基因能夠正確的起始翻譯和提高表達(dá)水平。另外，在本研究中重組腺病毒rAdV-P12A3C 與等體積206 佐劑乳化組（C 組）的IgG 抗體水平略高于重組腺病毒rAdV-P12A3C 免疫組（A 組），可見商品化的油佐劑可增強(qiáng)重組腺病毒rAdV-P12A3C 免疫效果，具體機(jī)理需進(jìn)一步研究。

復(fù)制缺陷型人腺病毒（5 型）由于缺失了與復(fù)制相關(guān)的E1 基因，構(gòu)建的重組腺病毒只能在表達(dá)E1 的細(xì)胞中復(fù)制，即需要293 細(xì)胞的輔助，因此該重組病毒在動物體內(nèi)或自然環(huán)境中不能生長復(fù)制，不會散毒污染環(huán)境，并且在動物體內(nèi)不存在人腺病毒抗體，因此不必考慮母源抗體的干擾問題。在本研究中BALB/c 小鼠加強(qiáng)免疫后誘導(dǎo)的抗體水平明顯升高，這也表明不存在腺病毒載體抗體干擾的問題。

本研究首次構(gòu)建了表達(dá)O 型FMDV 衣殼蛋白的重組腺病毒rAdV-P12A3C，免疫一定劑量的重組腺病毒后BALB/c 小鼠產(chǎn)生了較高水平的體液免疫應(yīng)答，為FMD 活載體疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。