張會會，昝亞楠，金明潔，梁思宇，劉思國，謝 芳

（中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/動物細菌病研究創(chuàng)新團隊，黑龍江 哈爾濱 150069）

耐藥性致病菌的流行會嚴重影響?zhàn)B殖業(yè)的正常運轉(zhuǎn)，給食品安全和生態(tài)環(huán)境帶來嚴重危害，從而威脅人類的健康，制約經(jīng)濟的可持續(xù)發(fā)展[1-3]。因此，迫切需要研究和開發(fā)出針對耐藥菌感染的抗菌治療藥物，來對抗日益流行的細菌耐藥現(xiàn)象。趨化因子是一類參與多種免疫功能的低分子量蛋白質(zhì)。近年來發(fā)現(xiàn)，許多趨化因子具有抗菌活性。趨化因子CXCL9、CXCL10 和CXCL11 能有效地殺死大腸桿菌和單核細胞增生李斯特菌[4]。隨后，Yang 等對人源趨化因子進行了系統(tǒng)的篩選，發(fā)現(xiàn)45 種人源趨化因子中，有23 種（10 種CXC 型和13 種CC 型趨化因子）表現(xiàn)出抗菌活性[5]。其中趨化因子CCL26 具有抗菌肽在中性pH 中帶正電（pI=10.85）的特性，此外其二級結(jié)構(gòu)由N 端的無規(guī)則卷曲，反平行的β-鏈和C端的α-螺旋組成，這與抗菌肽中防御素的結(jié)構(gòu)非常相似，甚至其C 末端結(jié)構(gòu)域也與抗菌肽LL-37 具有高度的結(jié)構(gòu)相似性[6]。研究發(fā)現(xiàn)，CCL26 在低鹽濃度下對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MASA）能夠達到80%抑菌效果[7]。因此，本研究以人源抗菌趨化因子CCL26 完整序列為模板，合成具有與傳統(tǒng)抗菌肽結(jié)構(gòu)高度相似的C 末端區(qū)域的截短肽26C 作為研究對象，探究26C 的體外生物學活性，以期為新型抗菌肽的研發(fā)提供思路，為治療耐藥菌感染的臨床用藥奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料腸道外致病性大腸桿菌K1 為耐多粘菌素B（PxB）的臨床分離菌株，銅綠假單胞菌ATCC 27853、人表皮角質(zhì)形成細胞HaCaT 由本實驗室保存；CCL26 C 端截短肽（26C，KKWVQKYISLLK-TPKQL），由上海吉爾生化有限公司合成，經(jīng)過高效液相色譜純化后純度>98%；LB 固體和液體培養(yǎng)基購自美國BD 公司；胰蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）和胰蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）購自英國OXOID 公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）購自北京Coolaber 公司；MEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）、鏈霉素和青霉素購自美國Gibco 公司；結(jié)晶紫、DMSO、3-（4, 5-二甲基噻唑-2）-2, 5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）購自哈爾濱市牧樂生物試劑有限公司；1-N-苯基萘胺（NPN）、PxB 購自上海麥克林生化科技有限公司；細胞凋亡誘導劑（CCCP，50 mmol/L）購自北京索萊寶生物科技有限公司；Triton X-100、HEPES、Adenosine 5'-triphosphate（ATP）Bioluminescent Assay Kit 購 自 美國Sigma-Aldrich 公司。

1.2 26C 對大腸桿菌K1 的濃度-殺菌曲線的測定待大腸桿菌K1 株培養(yǎng)至對數(shù)生長期時收集菌體，用PBS 清洗3 次并調(diào)整為2×105cfu/mL，加入終濃度分別為0、1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L 的26C，置于37 ℃孵育3 h。取100 μL 菌液，10 倍倍比稀釋后涂板。待干燥后倒置放入37 ℃孵育24 h 后，參照De Breij 等的方法測定26C 在不同濃度下對大腸桿菌K1的殺菌效率[8]，繪制濃度-殺菌曲線。

1.3 26C 對大腸桿菌外膜通透性影響的測定將培養(yǎng)至對數(shù)期的大腸桿菌K1 重懸于含有5 μmol/L CCCP、5 mmol/L 葡萄糖的HEPES 緩沖液中，調(diào)整OD600nm約為0.5 后，于96 孔板中每孔加入100 μL 菌液，然后加入10 μmol/L NPN 平衡30 s，再加入終濃度為2 μmol/L的26C，在37 ℃條件下使用多功能酶標儀每隔30 min檢測一次熒光強度，以相同濃度的PxB 作為陽性對照，采用NPN 測定26C 對細菌外膜的通透性[9]。試驗重復3次，根據(jù)多功能酶標儀測定的熒光值繪圖。

1.4 26C對大腸桿菌ATP泄露影響的測定取對數(shù)生長期的大腸桿菌K1，收集菌體后用PBS 和50 mmol/L的HEPES各洗一遍，采用HEPES重懸至OD600nm約為1，加入0.2%的glucose 活化10 min，立即用26C 處理細菌懸液，每孔加入100 μL的ATP檢測液，靜置3 min，將80 μL DMSO 透化加入20 μL 上述細菌懸液，稀釋于4.9 mL 無菌水中，利用ATP Bioluminescent Assay Kit檢測ATP 總量；同時將80 μL 無菌水加入20 μL 大腸桿菌K1 細菌懸液中后稀釋于4.9 mL 無菌水中，利用ATP Bioluminescent Assay Kit 測定胞外ATP（ATP EC）的含量，通過多功能酶標儀讀取熒光值，并計算胞內(nèi)ATP（ATP IC）的含量，胞內(nèi)ATP=ATP 總量-胞外ATP，通過比較胞外ATP 和胞內(nèi)ATP 的差異繪圖。

1.5 通過透射電鏡觀察26C 對大腸桿菌細胞膜的影響細菌處理方法如1.2，將重懸菌液與2 μmol/L 的26C 作用，37 ℃孵育1 h 后用PBS 洗滌2 次后離心棄上清，收集菌體，2.5%戊二醛4 ℃靜止過夜。PBS 緩沖液沖洗3 次。2%的四氧化二鋨固定2 h，PBS 緩沖液沖洗2 次。分別利用50%、70%、90%和100%乙醇各脫水10 min。100%丙酮處理20 min，再用丙酮（1：1）樹脂（1：3）混合液處理1 h 后用純樹脂包埋過夜。將其制成超薄切片并用醋酸鈾酰和檸檬酸鉛染色，以不加26C 的大腸桿菌為對照室溫干燥后采用透射電鏡觀察26C 對大腸桿菌細胞膜的影響并拍照。

1.6 26C 對銅綠假單胞菌生物被膜（BF）形成影響的測定于96 孔板中分別加入濃度為8 μmol/L、4 μmol/L、2 μmol/L、1 μmol/L、0 的26C 后，各孔分別 加 入50 μL 濃 度 為2×106cfu/mL 銅 綠 假 單 胞 菌 菌液，混勻后置于37 ℃孵育36 h，棄去浮游細菌，PBS 洗3 遍，甲醇固定晾干后加150 μL 結(jié)晶紫，作用5 min，純水洗3 遍，晾干后加150 μL 33%冰醋酸溶液溶解，輕輕混勻，測定OD490nm值，參考Rajasek-aran 等的方法測定26C 對細菌BF 形成的影響[10]。

同時將500 μL 濃度為2×106cfu/mL 銅綠假單胞菌菌液加入共聚焦小皿，加入26C 使其終濃度為2 μmol/L、1 μmol/L、0，37 ℃靜置培養(yǎng)36 h，PBS 洗滌2 次后，利用細菌活力檢測試劑盒染色，通過激光共聚焦顯微鏡觀察26C 對BF 形成的影響。

1.7 26C 對紅細胞溶血活性影響的測定靜脈采集人的新鮮血液，制備成4%的人紅細胞懸液。將200 μL 濃度分別為2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L、32 μmol/L、64 μmol/L 和128 μmol/L 的26C 或0.2% Triton X-100 與200 μL 的 紅 細 胞 懸 液 在37 ℃孵育1 h后，室溫800 r/min離心10 min，取100 μL上清測定OD415nm值。設(shè)等體積的PBS（pH7.4）處理組作為陰性對照，以0.2% Triton X-100 處理組作為陽性對照。根據(jù)式（1）計算溶血率后作圖。

式（1）：%溶血率=100×[(A-A0)]/[(AT-A0)]，式中：A 為加肽樣品OD415nm值；A0和AT分別代表陰性值和陽性值。

1.8 26C對HaCaT細胞毒性的測定HaCaT細胞采用1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L、32 μmol/L、64 μmol/L 的26C 在MEM 培養(yǎng)基中37 ℃、5%CO2孵育24 h后，采用MTT法評價26C的細胞毒性[9]。試驗以無肽處理的細胞作為空白對照組，并按式（2）計算抑制率后作圖。式（2）抑制率（%）=（對照組OD570nm均值-給藥組OD570nm均值）/對照組OD570nm均值×100%。

1.9 統(tǒng)計學分析采用GraphPad Prism 8.0 軟件對實驗結(jié)果進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，采用t檢驗法進行組間顯著性分析并作圖，P>0.05 為差異不顯著；P≤0.05 為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 26C 濃度-殺菌曲線的測定結(jié)果為探究26C在不同濃度下的殺菌能力，本研究將不同濃度的26C與大腸桿菌菌株K1 共同孵育3 h，根據(jù)殺菌效果繪制濃度-殺菌曲線。結(jié)果顯示，與對照組相比，1 μmol/L 的26C 與K1 菌株作用3 h 具有一定的殺菌效果（P<0.05），2 μmol/L 和4 μmol/L 的26C 與K1 菌株作用3 h 后可以有效地殺滅細菌（P<0.001），抗菌效果呈劑量依賴性，且在4 μmol/L 時即可完全殺滅細菌，使得細菌活菌數(shù)降低4log（圖1）。結(jié)果表明，26C 在不同濃度下均可有效殺滅細菌。

圖1 26C對E.coli 菌株K1的濃度-殺菌曲線Fig.1 Concentration-kill curve of 26C to E.coli K1

2.2 26C 對大腸桿菌外膜通透性影響的測定結(jié)果疏水探針NPN 在非極性或疏水環(huán)境中會發(fā)出強烈的熒光，因此常用來檢測細胞膜的完整性。本研究通過NPN 攝取量檢測26C 對細菌的損傷程度，并以對大多數(shù)革蘭氏陰性桿菌具有殺菌作用的多肽分子PxB作為研究細菌外膜通透性的陽性對照。結(jié)果顯示，與陽性對照組相比，26C 作用細菌30 min 后觀察到熒光強度顯著增加（P<0.01），在作用后60 min～240 min內(nèi)熒光強度極顯著增加（P<0.001），并且隨著26C 作用時間延長，NPN 的熒光強度逐漸增加，說明細菌外膜的通透性逐漸變大，且呈現(xiàn)時間依賴性。陽性對照PxB 也改變了細菌外膜通透性，但其效果明顯不如26C（圖2）。結(jié)果表明，隨著作用時間的延長，26C 可有效改變大腸桿菌細胞膜的通透性。

圖2 26C對大腸桿菌的外膜通透性影響的檢測結(jié)果Fig.2 The effect of 26C on the permeability of the outer membrane of E.coli

2.3 26C 對大腸桿菌ATP 泄露影響的測定結(jié)果當細菌細胞膜損傷后，會導致菌體內(nèi)容物泄露，繼而殺死細菌。因此，ATP 泄漏分析可用于評估26C干擾細菌的能力。本研究利用ATP 泄露實驗測定了26C對大腸桿菌的干擾能力，結(jié)果顯示，在2 μmol/L時大腸桿菌胞外ATP 顯著增加（P<0.05），4 μmol/L 時胞外ATP 極顯著增加（P<0.001），說明細胞膜被嚴重破壞，導致菌體內(nèi)容物及代謝產(chǎn)物泄露；在較低濃度時（1 μmol/L），觀察到胞外ATP的泄露有限，說明細胞膜未被完全破壞或存在其他作用靶標（圖3）。結(jié)果表明，2 μmol/L 的26C 作用于大腸桿菌即可顯著破壞細菌細胞膜，導致菌體內(nèi)ATP外泄，降低細菌存活率。

圖3 26C處理細菌細胞后細胞內(nèi)（IC）和細胞外（EC）ATP的測定Fig.3 Measurement of intracellular(IC)and extracellular(EC)of level ATP after 26C treatment

2.4 26C 對細菌細胞膜的損傷作用將2 μmol/L 26C 與大腸桿菌共孵育1 h 后，制成超薄切片并在透射電子顯微鏡下觀察細菌細胞膜形態(tài)。結(jié)果顯示，對照組菌體保持完好的細胞形態(tài)，胞質(zhì)均勻，內(nèi)容物充實，無胞漿外泄現(xiàn)象。經(jīng)26C 作用后，菌體出現(xiàn)明顯的質(zhì)壁分離并伴有不同程度的膜損傷（箭頭所示），導致菌體內(nèi)容物泄露（圖4）。結(jié)果表明，26C可破壞細菌細胞膜，從而有效地殺傷細菌。

圖4 透射電鏡觀察26C對細菌細胞膜的損傷作用Fig.4 Effects of 26C on bacterial cell membrane by TEM

2.5 26C 對銅綠假單胞菌BF 形成能力影響的測定銅綠假單胞菌為適應(yīng)環(huán)境所形成的BF 大大削弱了抗生素的殺菌效果，本研究測定了不同濃度水平下26C抑制BF形成的能力。通過結(jié)晶紫染色法檢測發(fā)現(xiàn)，26C在1 μmol/L～2 μmol/L 可有效抑制銅綠假單胞菌BF 的形成（P<0.01），在4 μmol/L～8 μmol/L 時26C 抑制BF 形成的能力極顯著高于對照組（P<0.001）（圖5A）。采用激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，26C 在1 μmol/L 濃度下即可顯著抑制銅綠假單胞菌的BF 的形成（圖5B）。結(jié)果表明，26C 在低濃度即可顯著抑制銅綠假單胞菌BF 的形成，且抑制效果呈現(xiàn)劑量依賴性。

圖5 利用結(jié)晶紫法（A）和激光共聚焦顯微鏡（B）觀察26C抑制細菌BF形成的能力Fig.5 The antibiofilm ability of 26C was observed by crystal violet method(A)and laser confocal microscope(B)

2.6 26C 對人紅細胞的溶血活性及細胞毒性測定結(jié)果天然抗菌肽因易溶解紅細胞引起全身毒性而限制了其用于臨床治療，為測定26C對紅細胞的溶血活性，本研究將不同濃度的26C 分別與人紅細胞孵育1 h后測定上清OD415nm值，計算抗菌肽對人紅細胞的溶血活性（%）。結(jié)果顯示，與陽性對照相比，在最高濃度下，26C 對人紅細胞溶血活性極低（P<0.001），僅為0.85%（圖6）。結(jié)果表明，26C對人紅細胞無溶血活性，有作為臨床用藥開發(fā)的潛力。為明確26C對哺乳動物細胞的毒性，采用MTT 法檢測26C 對HaCaT 的細胞毒性。結(jié)果顯示，與空白對照組相比，1 μmol/L～16 μmol/L 26C對HaCaT細胞無毒性，32 μmol/L～64 μmol/L 26C有較低的細胞毒性（P<0.05）（圖7）。此時肽濃度已遠遠高于其殺菌濃度。結(jié)果表明，26C 對哺乳動物細胞 無毒性，有作為臨床用藥開發(fā)的潛力。

圖6 26C對人紅細胞的溶血活性的測定Fig.6 Hemolytic activity of 26C on human red blood cells

圖7 26C對人表皮角質(zhì)形成細胞HaCaT的細胞毒性的測定Fig.7 The cytotoxicity of 26C to human epidermal keratinocyte cells HaCaT

3 討 論

過去幾十年抗生素濫用造成細菌多重耐藥菌大量出現(xiàn)[11]，而養(yǎng)殖業(yè)這種現(xiàn)象尤為嚴重。據(jù)保守估計，2010 年～2030 年我國養(yǎng)殖業(yè)抗生素的消耗量至少還將增加一倍，達到全球總量的近1/3，給公共衛(wèi)生安全帶來極大的威脅[12]。隨著我國減抗無抗政策的制定和實施，新型抗菌制劑的研制迫在眉睫。

趨化因子不僅在調(diào)節(jié)白細胞遷移方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，而且在天然免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)方面也發(fā)揮重要作用，與趨化因子相關(guān)的新功能之一是其作為抗菌藥物應(yīng)用的能力[7]。許多趨化因子的C 端結(jié)構(gòu)域與陽離子的α-螺旋抗菌肽的相似性較高，可見C末端螺旋區(qū)域是趨化因子抗菌活性的主要區(qū)域。而在某些情況下，分子內(nèi)的相互作用可能會中和帶正電的C 末端α-螺旋，掩蓋它的的抗菌活性，這表明或許需要對某些成熟的趨化因子進行截短，才能完整的保留其抗菌活性。研究發(fā)現(xiàn)，CCL26 在低鹽濃度（10 mmol/L）下對MASA 具有一定的抗菌活性，而對其他細菌的抗菌活性還未報道[7]，因此本研究合成了抗菌趨化因子CCL26 具有α-螺旋結(jié)構(gòu)的C 端截短肽26C，并測定其對耐PxB 的大腸桿菌K1 菌株的抗菌活性，發(fā)現(xiàn)其在低濃度下即可有效殺滅大腸桿菌，表明26C 對耐PxB 的腸道外致病菌具有較強的殺菌活性。

抗菌肽大多具有陽離子表面和疏水表面的兩親性，這可能促進抗菌肽與帶負電的微生物表面相互作用[13]。這種相互作用可能是通過插入脂膜和破壞細菌膜而殺死細菌，本研究NPN 和ATP 的測定結(jié)果均顯示26C 在2 μmol/L 的濃度下具有顯著干擾細菌通透性及代謝穩(wěn)定性的能力，這表明26C 可能插入到細菌細胞膜中，增加了膜的通透性導致細菌內(nèi)容物泄露而死亡。為了獲得更多關(guān)于26C 潛在作用機制的信息，本研究對肽作用后的細菌表面進行透射電鏡觀察，結(jié)果顯示26C 影響大腸桿菌的表面，可能是通過靜電作用與細胞膜上帶負電荷的成分結(jié)合，引起外膜通透性改變，導致細菌細胞內(nèi)容物的泄漏而造成損傷，最終導致細菌死亡，這也印證了上述NPN 和ATP 的測定結(jié)果。

BF 內(nèi)細菌對抗生素和其他藥物耐受性強，并能逃避宿主的免疫殺傷，抗菌肽因其獨特的膜作用殺菌機制能抑制BF 的形成或降解BF[8]。為了研究26C對細菌BF 的作用，本研究通過結(jié)晶紫染色法檢測26C 對銅綠假單胞菌BF 的影響，結(jié)果顯示26C 對銅綠假單胞菌BF 形成具有顯著抑制作用，并且隨著26C 濃度升高抑制作用也明顯增強，這為預防醫(yī)療器械等醫(yī)源性慢性感染提供了參考。本研究進一步通過激光共聚焦顯微鏡觀察，結(jié)果顯示與陽性對照相比，26C 在低濃度下能夠顯著抑制BF 的形成。該結(jié)果進一步支持本研究上述結(jié)論。此外，26C 對哺乳動物無溶血活性，且在1 μmol/L～16 μmol/L 對哺乳動物細胞無毒性，說明其具有作為新型抗菌肽開發(fā)的潛力。

綜上所述，本研究中趨化因子CCL26 的C 端截短肽26C 具有顯著的抗菌活性，可以有效地降低耐藥大腸桿菌菌株的存活率；并能干擾細菌外膜通透性，造成細菌嚴重損傷而死亡；同時可以抑制銅綠假單胞菌BF 的形成；無溶血活性，對哺乳動物細胞毒性較低，具備作為臨床藥物開發(fā)的潛力。本研究為新型抗菌肽的研發(fā)提供了思路，也為趨化因子抗菌肽的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。