河北中醫(yī)學(xué)院

李顥玥 王 茜 韓 雪 石 鋮 郝 蕾(石家莊 050091)

提要 目的：研究桂枝茯苓丸對(duì)多囊卵巢綜合征(PCOS)大鼠血清及卵巢組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)及其抑制物基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)水平的影響。方法：60只SD雌性大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、克羅米芬組、桂枝茯苓丸高、低劑量組；采用股骨內(nèi)側(cè)皮下注射胰島素注射液和人絨毛膜促性腺激素(HCG)復(fù)制大鼠PCOS模型。連續(xù)治療35 d后，測量體質(zhì)量，收集血清、卵巢組織標(biāo)本，采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)測定血清睪酮(T)、黃體生成素(LH)、卵泡成熟素(FSH)、MMP-9、TIMP-1的含量；光鏡下觀察卵巢組織的病理形態(tài)學(xué)變化；免疫組化法觀察大鼠卵巢組織MMP-9、TIMP-1的表達(dá)情況。結(jié)果：與正常組相比，模型組體質(zhì)量增加，血清T、LH、FSH、MMP-9水平升高，TIMP-1水平降低，卵巢可見竇腔明顯擴(kuò)大的囊性竇卵泡。與模型組相比，克羅米芬組、桂枝茯苓丸高、低劑量組體質(zhì)量改善，血清T、LH、FSH、MMP-9水平均明顯降低，TIMP-1水平升高，卵巢囊性竇卵泡減少，竇腔變小，各時(shí)期卵泡增多，黃體數(shù)目增多。結(jié)論：桂枝茯苓丸高、低劑量組均可明顯改善PCOS大鼠癥狀，調(diào)控大鼠血清及卵巢組織中MMP-9、TIMP-1水平，且桂枝茯苓丸高劑量組療效優(yōu)于低劑量組。

多囊卵巢綜合征(PCOS)是一種生殖功能障礙與糖代謝異常并存的內(nèi)分泌紊亂綜合征，以持續(xù)無排卵、雄激素過多和胰島素抵抗(IR)為主要特征[1]，是育齡期婦女最常見的婦科內(nèi)分泌疾病。研究發(fā)現(xiàn)PCOS在育齡期婦女中的發(fā)病率高達(dá)18%，且呈逐年升高的趨勢[2]，嚴(yán)重影響女性的生殖健康。

PCOS在中醫(yī)中屬于“月經(jīng)不調(diào)”“癥瘕”“不孕”等范疇[3]，病因錯(cuò)綜復(fù)雜，中醫(yī)認(rèn)為本病與脾腎功能失調(diào)及痰濕、血瘀阻滯等密切相關(guān)[4]，其病機(jī)本質(zhì)可能為腎虛引起的脾虛、肝郁及氣血失調(diào)等[5]。桂枝茯苓丸首見于《金匱要略》，由桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、芍藥組成，主婦人宿有瘕病，經(jīng)斷未及三月，而得漏下不止，胎動(dòng)在臍上者，為瘕痼害[6]。方中桃仁、牡丹皮、白芍活血化瘀、養(yǎng)血和血，使瘀血去，新血生；桂枝溫通血脈，助桃仁、牡丹皮活血之力；茯苓利水滲濕，寓有濕祛血止之用，五藥合用共奏化瘀生新、調(diào)和氣血之功[7-9]，與PCOS主要病機(jī)相符。

現(xiàn)代研究顯示，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)以及特異性組織抑制物(TIMPs)對(duì)排卵有重要的生理作用，可以通過調(diào)節(jié)卵巢內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分的降解和重建，參與PCOS排卵障礙的病理過程[10-12]。為了進(jìn)一步闡明桂枝茯苓丸的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過測定PCOS模型大鼠體質(zhì)量、血清及卵巢組織中血清睪酮(T)、黃體生成素(LH)、卵泡成熟素(FSH)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)在治療前后的變化，探索其對(duì)PCOS的影響，為繼承發(fā)展桂枝茯苓丸的臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60只成年SD大鼠，清潔級(jí)，雌性，體質(zhì)量180～200 g，由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。許可證號(hào)：SCXK(冀)2018-004。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)通風(fēng)良好，溫度保持在20 ℃～25 ℃。本研究獲得河北中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 胰島素注射液(購于江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H10890001)、0.9%氯化鈉注射液(購于石家莊四藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H13023200)、人絨毛膜促性腺激素(HCG，購于麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠，2 000 U/瓶，國藥準(zhǔn)字H44020674)、葡萄糖(Vetec reagent grade，規(guī)格：500 g/瓶， Lot：WXBC2393V)、桂枝茯苓丸(購于江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：0.31 g/粒，國藥準(zhǔn)字Z10950005)、克羅米芬片(購于高特制藥有限公司P.O. Box51785Limassol，塞浦路斯，規(guī)格：50 mg/片，《進(jìn)口藥品注冊證》證號(hào)：H20140688)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 大鼠T、LH、FSH的ELISA試劑盒均購于德國IBL公司(批號(hào)20161130)；MMP-9、TIMP-1兔單克隆抗體均購于英國Abcam公司(批號(hào)分別為GR426511-4和GR238752-1)；MMP-9、TIMP-1單克隆抗體，SP-KITT9000試劑盒均購于美國ZYMED公司；防脫片劑APES、顯色劑DAB均購于北京中山生物技術(shù)有限公司。BX43F型顯微鏡[奧林巴斯(中國)有限公司]，H17502型冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)，Versa MaxTM多功能酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices)。

1.4 造模、分組及給藥

1.4.1 模型制備：采用股骨內(nèi)側(cè)皮下注射胰島素注射液(初始濃度為0.5 U/d，后每天遞增0.5 U，直至6.0 U/d不變)和HCG(1.5 U/d)復(fù)制PCOS模型，共注射21 d。造模期間，為防止低血糖發(fā)生，以5%葡萄糖溶液代替日常飲水。

1.4.2 分組給藥：將60只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、克羅米芬組、桂枝茯苓丸高劑量組、桂枝茯苓丸低劑量組，每組12只。除正常組外，其他大鼠造模成功后，克羅米芬組給予相當(dāng)于生藥0.21 g/kg·d-1灌胃，桂枝茯苓丸高劑量組給予相當(dāng)于生藥2.33 g/kg·d-1灌胃，桂枝茯苓丸低劑量組給予相當(dāng)于生藥1.16 g/kg·d-1灌胃，各組連續(xù)用藥35 d。正常組與模型組給予同體積生理鹽水灌胃。所有大鼠每周稱量體質(zhì)量1次。

1.5 標(biāo)本采集 末次給藥后，對(duì)所有大鼠禁食禁水24 h，腹腔注射10 %水合氯醛麻醉，自腹主動(dòng)脈取血，將血樣在4 ℃下以3 000 r/min離心5 min，分離血清；取血后，將大鼠以頸椎脫臼處死，剖腹取出并迅速分離大鼠兩側(cè)卵巢，取相同側(cè)卵巢對(duì)切，置于濃度為4 %的福爾馬林液中固定、石蠟包埋，切片。

1.6 指標(biāo)檢測 將卵巢組織的石蠟切片進(jìn)行HE染色，在光鏡下觀察卵巢的病理變化情況。采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測大鼠血清T、LH、FSH、MMP-9、TIMP-1含量，并計(jì)算MMP-9/TIMP-1比值。用免疫組化法檢測大鼠卵巢組織中MMP-9、TIMP-1的表達(dá)，用顯微鏡的Optimas數(shù)字彩色圖像顯微系統(tǒng)(optimas 6.51,美國)進(jìn)行病理圖像分析，計(jì)算各區(qū)域平均灰度值。平均灰度值越高，表明陽性表達(dá)越弱，平均灰度值越低，表明陽性表達(dá)越強(qiáng)[13]。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量變化情況 與正常組相比，模型組大鼠體質(zhì)量增長值升高(P<0.01)，說明PCOS大鼠模型復(fù)制成功。與模型組相比，克羅米芬組、桂枝茯苓丸高、低劑量組大鼠體質(zhì)量增長值均明顯降低(P<0.05或P<0.01)。說明用藥后PCOS大鼠肥胖癥狀有了改善。詳見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量變化情況

2.2 各組大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)情況變化 正常組大鼠卵巢在光鏡下可見黃體和發(fā)育于各時(shí)期的卵泡，卵泡的組織結(jié)構(gòu)清晰，卵泡壁由8～9層形狀完整、排列整齊的顆粒細(xì)胞組成，卵泡膜細(xì)胞呈現(xiàn)梭狀排列，可見卵細(xì)胞、透明帶以及放射冠結(jié)構(gòu)，膜-間質(zhì)細(xì)胞無增生現(xiàn)象，無囊性竇卵泡的出現(xiàn)。與正常組相比，模型組大鼠卵巢可見竇腔明顯擴(kuò)大的囊性竇卵泡，顆粒細(xì)胞層數(shù)明顯減少，卵母細(xì)胞及放射冠消失，黃體組織數(shù)目明顯減少甚至消失，并有不完全的黃素化，膜細(xì)胞明顯增生。與模型組相比，克羅米芬組、桂枝茯苓丸高、低劑量組大鼠卵巢囊性竇卵泡數(shù)量減少，竇腔變小，顆粒細(xì)胞層數(shù)增加，黃體數(shù)目增加。其中，桂枝茯苓丸高劑量組大鼠顆粒細(xì)胞及黃體數(shù)目的改善情況明顯好于低劑量組。各組大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)變化見圖1。

注：1.正常組；2.模型組；3.克羅米芬組；4.桂枝茯苓丸低劑量組；5.桂枝茯苓丸高劑量組。(圖2、圖3同)圖1 各組大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)變化(HE，×100)

2.3 各組大鼠血清中T、LH、FSH水平情況比較 與正常組相比，模型組大鼠血清T值和LH值均明顯升高(P<0.01)，說明PCOS大鼠模型復(fù)制成功。與模型組相比，克羅米芬組、桂枝茯苓丸高、低劑量組大鼠血清T值、LH值及FSH值均明顯降低(P<0.05或P<0.01)。說明用藥后PCOS大鼠血清T值、LH值及FSH值升高的癥狀有了改善。詳見表2。

表2 各組大鼠血清中T、LH及FSH水平的變化情況

2.4 桂枝茯苓丸對(duì)PCOS大鼠血清MMP-9、TIMP-1水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清MMP-9水平升高，TIMP-1水平降低，MMP-9/TIMP-1比值升高(P<0.01)；與模型組比較，克羅米芬組、桂枝茯苓丸高、低劑量組大鼠血清MMP-9水平降低，TIMP-1水平升高，MMP-9/TIMP-1比值降低。詳見表3。

表3 各組大鼠血清MMP-9、TIMP-1水平及MMP-9/TIMP-1比值變化

2.5 桂枝茯苓丸對(duì)PCOS大鼠卵巢組織MMP-9、TIMP-1表達(dá)的影響 各組卵巢中卵泡的顆粒細(xì)胞和發(fā)育良好的卵泡膜間質(zhì)細(xì)胞中均可檢測到MMP-9和TIMP-1的雜交信號(hào)。與正常組相比，模型組卵泡顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞中MMP-9的灰度值均下降，TIMP-1的灰度值均升高，差異具有顯著性(P<0.01或P<0.05)；與模型組相比，克羅米芬組、桂枝茯苓丸高、低劑量組卵泡顆粒細(xì)胞及卵泡膜細(xì)胞中MMP-9的灰度值均升高，TIMP-1的灰度值均降低，差異具有顯著性(P<0.01或P<0.05)。詳見表4、圖2、圖3。

表4 各組大鼠卵巢局部MMP-9、TIMP-1陽性細(xì)胞平均灰度的比較

圖2 免疫組化法觀察各組大鼠卵巢組織中MMP-9的表達(dá)(免疫組化，×100)

圖3 免疫組化法觀察各組大鼠卵巢組織中TIMP-1的表達(dá)(免疫組化，×100)

3 討論

PCOS臨床表現(xiàn)為持續(xù)性的無排卵、胰島素抵抗和高雄激素，是現(xiàn)代常見的婦科生殖障礙性疾病之一，也是導(dǎo)致女性不孕的主要因素之一，嚴(yán)重影響了女性的身心健康[14-15]。研究發(fā)現(xiàn)，PCOS的發(fā)病機(jī)制可能與腎上腺功能紊亂、下丘腦-垂體-卵巢軸功能失常和反饋異常等有關(guān)[16]，垂體分泌和釋放FSH、LH的功能紊亂，會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致FSH的促卵泡成熟和排出的功能障礙以及LH誘導(dǎo)的排卵障礙[17-18]。而FSH介導(dǎo)的芳香化酶受到抑制，則使T水平持續(xù)升高，性激素水平紊亂加劇。因此，T、LH、FSH可能為影響PCOS大鼠發(fā)情周期的重要指標(biāo)[19]，其主要變化趨勢為PCOS的發(fā)病會(huì)導(dǎo)致性激素T、LH、FSH水平的升高[20]。PCOS在中醫(yī)學(xué)屬“月經(jīng)不調(diào)”“不孕”等范疇，臨床研究表明，桂枝茯苓丸在治療PCOS方面有明顯優(yōu)勢[21]。

本實(shí)驗(yàn)采用給大鼠股骨內(nèi)側(cè)皮下注射胰島素和HCG的方法進(jìn)行PCOS造模，主要依據(jù)是胰島素能刺激卵巢卵細(xì)胞膜和間質(zhì)細(xì)胞合成雄激素，降低血中性激素結(jié)合蛋白，使卵巢雄激素濃度增加，導(dǎo)致卵泡閉鎖，形成多囊[22]。克羅米芬為人工合成的非甾體制劑，具有較強(qiáng)的抗雌激素效應(yīng)和較弱的雌激素作用，臨床常用于治療PCOS等無排卵的女性不孕癥，因此本實(shí)驗(yàn)選取其為陽性對(duì)照藥物。結(jié)果顯示，造模后大鼠體質(zhì)量明顯增加，血清中T、LH水平均明顯升高，卵巢可見竇腔明顯擴(kuò)大的囊性竇卵泡，表明造模成功。與模型組比較，桂枝茯苓丸高、低劑量組大鼠血清T、LH、FSH水平均明顯降低，卵巢囊性竇卵泡數(shù)量減少，竇腔變小，顆粒細(xì)胞層數(shù)增加，黃體數(shù)目增多；其中桂枝茯苓丸高劑量組較低劑量組血清水平變化更為明顯，卵巢中也可見4～6層形狀完整、排列較緊湊的顆粒細(xì)胞，黃體數(shù)目多于低劑量組。

MMPs是LH依賴的調(diào)節(jié)卵泡破裂和早期黃體形成的重要因子之一[23]，而TIMPs的表達(dá)也有助于調(diào)節(jié)卵泡破裂和向黃體轉(zhuǎn)化，且二者均定位于卵泡的顆粒細(xì)胞、膜細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞上[24]，受激素、生長因子和細(xì)胞因子的調(diào)控[25-26]，通過調(diào)節(jié)卵巢動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)成分的周期性變化，對(duì)卵泡和黃體功能發(fā)揮著極為重要的作用，在排卵和黃體形成過程中相互作用共同協(xié)調(diào)。在正常的排卵過程中，卵泡的發(fā)育成熟、排卵以及黃體的形成和退化都依賴于細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)周期性的有序降解和組織重建，MMPs/TIMPs蛋白水解酶家族的精確調(diào)控在ECM重塑過程中起著非常重要的作用[27]。MMP-9通過降解基質(zhì)膜的主要成分參與排卵和卵泡的生長，是分解ECM的關(guān)鍵因子[28]，而TIMP-1則對(duì)MMP-9有抑制作用，因此MMP-9/TIMP-1比例正常對(duì)于維持黃體細(xì)胞所依賴的ECM微環(huán)境極為重要。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PCOS模型大鼠卵巢組織顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞中存在MMP-9的異常高表達(dá)，TIMP-1異常低表達(dá)，提示PCOS有明顯增高的溶解明膠的活性，這可能與多個(gè)卵泡發(fā)育和囊腫形成時(shí)卵巢ECM重塑的增加有關(guān)，增高的MMP-9使卵巢ECM降解異常，從而使多囊卵泡形成，逐漸發(fā)展為慢性無排卵。模型組大鼠血清中MMP-9/TIMP-1比值高于正常組，說明MMP-9/TIMP-1的平衡向蛋白酶活性增強(qiáng)方向移動(dòng)，可能因?yàn)镻COS較厚的卵巢皮質(zhì)需要更多的蛋白酶進(jìn)行水解，TIMP-1的降低是對(duì)卵巢被膜增厚的一種代償機(jī)制。MMP-9/TIMP-1比值升高可能與PCOS的排卵障礙有關(guān)。桂枝茯苓丸能降低MMP-9的異常高表達(dá)，升高TIMP-1的異常低表達(dá)，降低MMP-9/TIMP-1比值，推測其可能通過抑制LH的分泌，阻斷外周靶器官雄激素的作用，使卵巢ECM降解恢復(fù)正常，通過正反饋激發(fā)排卵。

綜上所述，桂枝茯苓丸能調(diào)節(jié)PCOS大鼠血清激素水平，改善組織結(jié)構(gòu)，達(dá)到治療效果，且高劑量組療效優(yōu)于低劑量組。桂枝茯苓丸治療PCOS的機(jī)制，可能與抑制膠原增生、減少膠原沉積、增加膠原降解、促進(jìn)正常組織細(xì)胞增殖有關(guān)。