河北中醫(yī)學(xué)院 /河北省中藥組方制劑應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心/河北省中藥組方制劑技術(shù)創(chuàng)新中心/河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

厲博文 石子薇 李 菁 馬東來(lái) (石家莊 050091)

提要 目的：比較研究金銀花藥材和粉末的近紅外光譜特征。方法：應(yīng)用近紅外光譜技術(shù)檢測(cè)不同產(chǎn)地(包括河南省、河北省和山東省)金銀花藥材和粉末的近紅外光譜。采用一階導(dǎo)數(shù)結(jié)合矢量歸一化法，9點(diǎn)平滑進(jìn)行光譜的預(yù)處理，采用原始光譜比較、近紅外一致性模型檢驗(yàn)、定性鑒別和聚類(lèi)分析的方法，比較金銀花藥材與粉末近紅外光譜的差異。結(jié)果：在12 000～4 000 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)，同產(chǎn)地金銀花藥材與粉末的近紅外原始光譜存在一定的差異。在8 003.6～7 243.8 cm-1、6 900.5～5 646.9 cm-1、4840.7～ 4 462.7 cm-1波段內(nèi)，同產(chǎn)地金銀花藥材與粉末的近紅外光譜特征存在一致性，兩者在定性鑒別模型中的因子得分分布界限不明顯。因子法結(jié)合聚類(lèi)分析中兩者的光譜可以?xún)?yōu)先被歸為一類(lèi)，不能被準(zhǔn)確地鑒別。結(jié)論：金銀花藥材與粉末在定性分析中表現(xiàn)出一致性。金銀花藥材可以不經(jīng)粉碎直接進(jìn)行近紅外檢測(cè)和定性分析，具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，為金銀花快速鑒別方法的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和新思路。

金銀花(LoniceraJaponicaThunb.)為忍冬科忍冬屬植物忍冬及同屬植物干燥花蕾或帶初開(kāi)的花[1]，古時(shí)稱(chēng)為“忍冬”，曾收載于《名醫(yī)別錄》，《本草綱目》將其命名為金銀花[2]，其性寒，味甘，歸肺、心、胃經(jīng)，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的作用[3]，臨床治療脹滿(mǎn)下疾、溫病發(fā)熱和熱毒癰瘍等癥[4]。金銀花中含有黃酮類(lèi)、環(huán)烯醚萜苷類(lèi)和有機(jī)酸類(lèi)等化學(xué)成分，具有抗炎解熱、抗腫瘤和抗菌抗病毒等藥理作用[5]。

金銀花廣泛分布于全國(guó)各省區(qū)，商品藥材主要來(lái)源于山東省、河南省等地[6]，其藥材質(zhì)量受到生長(zhǎng)條件、加工方式及采收季節(jié)等方面的影響，山銀花曾作為金銀花品種收錄于1977～2000年版《中國(guó)藥典》。為準(zhǔn)確地進(jìn)行金銀花品質(zhì)優(yōu)劣和藥材真?zhèn)舞b別，多種檢測(cè)方法與手段應(yīng)用于金銀花的質(zhì)量控制，如中藥經(jīng)驗(yàn)鑒別[7]、近紅外光譜分析法、高效液相色譜法等。其中，近紅外光譜技術(shù)具有檢測(cè)速度快、樣品處理簡(jiǎn)單、對(duì)樣品無(wú)污染等優(yōu)勢(shì)[8]，如近紅外光譜結(jié)合SIMCA模式的方法可對(duì)金銀花和山銀花進(jìn)行鑒別分類(lèi)，有效地判別金銀花真?zhèn)蝃9]。逐步判別模式識(shí)別可以較好地鑒別不同品種和產(chǎn)地的金銀花[10]。陳璐等[11]應(yīng)用近紅外光譜技術(shù)，建立偏最小二乘判別模型快速鑒別不同品種和產(chǎn)地金銀花，模型正確判別率可達(dá)100%。近紅外光譜漫反射法和化學(xué)計(jì)量學(xué)方法快速檢測(cè)不同批次金銀花藥材中綠原酸和木犀草苷的含量[12]。

然而，金銀花藥材與粉末近紅外光譜特征比較的相關(guān)研究較少，其分類(lèi)鑒別的研究文獻(xiàn)多以粉末為研究對(duì)象?！吨袊?guó)藥典》2020年版一部中金銀花的檢測(cè)包括特征圖譜、檢查和含量測(cè)定項(xiàng)均采用金銀花粉末[1]，因此，為確保粉末檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，需要對(duì)粉末與藥材的近紅外檢測(cè)結(jié)果一致性進(jìn)行深入研究。

本文將應(yīng)用BRUKER-MAP近紅外光譜分析儀(布魯克科技有限公司)檢測(cè)金銀花藥材和粉末的近紅外光譜，并選擇適宜波段范圍，采用合適的方法進(jìn)行光譜預(yù)處理，建立金銀花近紅外光譜一致性模型、定性鑒別分析模型和聚類(lèi)分析模型，全面準(zhǔn)確地比較藥材與粉末在定性分析中的差異，為金銀花藥材的無(wú)損化檢測(cè)實(shí)際應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與樣品

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 BRUKER-MAP近紅外光譜分析儀(布魯克科技有限公司)、高速多功能粉碎機(jī)(浙江永集市榮浩工貿(mào)有限公司)、小號(hào)鐵研船(浙江省永康市清溪衡器廠(chǎng))、標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩(65目，浙江上虞市華豐五金儀器有限公司)、AN0868型電子天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 樣品的收集與分組 收集金銀花樣品92份，所有樣品經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院鄭玉光教授鑒定為忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花。

分別將河北產(chǎn)地、河南產(chǎn)地和山東產(chǎn)地的金銀花按照約為 3∶1的比例，隨機(jī)劃分為校正集和驗(yàn)證集，樣品信息見(jiàn)表1。

表1 金銀花樣品信息

2 方法

2.1 藥材處理方法 取金銀花藥材于粉碎機(jī)粉碎，過(guò)65目檢驗(yàn)篩，備用。每份樣品中分別稱(chēng)取6 g藥材和粉末。

2.2 近紅外光譜采集 分別將金銀花藥材和粉末裝入近紅外掃描杯中，混合均勻，使裝量為杯容量的2/3，輕輕按平。調(diào)節(jié)儀器分辨率為 8 cm-1，在12 000～4 000 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行近紅外波長(zhǎng)掃描，每個(gè)樣品重復(fù)掃描3次，同時(shí)采集近紅外的背景光譜，將每個(gè)檢測(cè)光譜扣除背景光譜，計(jì)算平均值作為樣品的原始光譜。

2.3 光譜預(yù)處理 應(yīng)用OPUS軟件對(duì)每個(gè)樣品的原始光譜進(jìn)行如下預(yù)處理，包括一、二階導(dǎo)數(shù)法與一、二階導(dǎo)數(shù)結(jié)合矢量歸一化法，比較不同方法的預(yù)處理效果。最終選擇一階導(dǎo)數(shù)結(jié)合矢量歸一化，9點(diǎn)平滑的預(yù)處理方法。

2.4 結(jié)果與分析

2.4.1 原始光譜對(duì)比：分別比較金銀花不同產(chǎn)地藥材和不同產(chǎn)地粉末的原始光譜(圖1)，以黑色標(biāo)記河南樣品，深灰色標(biāo)記河北樣品，淺灰色標(biāo)記山東樣品，結(jié)果表明，在12 000～4 000 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)，金銀花不同產(chǎn)地藥材和粉末的近紅外光譜波形基本一致，沒(méi)有明顯差異。

注：A. 藥材近紅外光譜 ；B. 粉末近紅外光譜。圖1 金銀花藥材和粉末的近紅外光譜比較圖

分析比較同產(chǎn)地金銀花藥材和粉末的紅外光譜(圖2)，以灰色標(biāo)記藥材樣品，黑色標(biāo)記粉末樣品，結(jié)果表明，在12 000～4 000 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)，金銀花不同產(chǎn)地藥材和粉末的近紅外光譜波形基本一致，但粉末的近紅外吸收強(qiáng)度略高于藥材。

注：A. 河南產(chǎn)地；B. 河北產(chǎn)地；C. 山東產(chǎn)地。圖2 同產(chǎn)地金銀花藥材和粉末NIR光譜圖的比較

2.4.2 建立近紅外一致性模型：分析比較金銀花不同產(chǎn)地藥材和粉末的原始光譜，發(fā)現(xiàn)在8 003.6～7 243.8 cm-1、6 900.5～5 646.9 cm-1、4 840.7～4 462.7 cm-1波段內(nèi)存在較大的差異，因此選擇上述波段，將藥材的原始光譜預(yù)處理后作為比對(duì)光譜，建立近紅外一致性檢驗(yàn)?zāi)Ｐ?，結(jié)果見(jiàn)表2。

經(jīng)過(guò)一致性模型的檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)金銀花的藥材與粉末的近紅外光譜均在CI限度以?xún)?nèi)，不能將兩者鑒別，兩者均被鑒別為金銀花的正品藥材，表明兩者近紅外光譜存在較高的一致性。結(jié)果見(jiàn)圖3。

注：1.參考光譜(灰色)； 2.測(cè)試光譜(黑色)。圖3 一致性檢驗(yàn)報(bào)告圖

2.4.3 近紅外定性鑒別分析：將金銀花不同產(chǎn)地藥材和粉末的原始光譜，經(jīng)一階導(dǎo)數(shù)結(jié)合矢量歸一化，9點(diǎn)平滑的方法預(yù)處理，在8 003.6～7 243.8 cm-1、6 900.5～5 646.9 cm-1、4 840.7～4 462.7 cm-1波段內(nèi)建立定性鑒別分析模型，得到金銀花樣品鑒別得分分布圖。從分布圖中看出，樣品可以明顯地分為3大類(lèi)，即河南樣品、河北樣品及山東樣品。金銀花的藥材與粉末分布分界不顯著，范圍接近或少量樣品存在重疊情況，不能很好地實(shí)現(xiàn)兩者的鑒別。因此，在二級(jí)子庫(kù)中，將藥材與粉末定義為一類(lèi)，建立金銀花定性鑒別模型，模型檢驗(yàn)結(jié)果顯示，驗(yàn)證集的驗(yàn)證率為100%，可以實(shí)現(xiàn)不同產(chǎn)地樣品的鑒別。結(jié)果見(jiàn)圖4。

注：A.河南藥材、a.河南粉末；B.河北藥材、b.河北粉末；C.山東藥材、c.山東粉末。圖4 金銀花樣品鑒別得分分布圖

2.4.4 聚類(lèi)分析：將92張金銀花的原始光譜進(jìn)行一階導(dǎo)數(shù)結(jié)合矢量歸一化，9點(diǎn)平滑的預(yù)處理，運(yùn)用因子算法和加權(quán)平均距離法在8 003.6～7 243.8 cm-1、6 900.5～5 646.9 cm-1、4 840.7～4 462.7 cm-1波段內(nèi)建立聚類(lèi)分析模型，得到金銀花樣品間的相似度關(guān)系圖，結(jié)果見(jiàn)圖5。應(yīng)用此模型，金銀花樣品可以明顯地歸為3個(gè)不同產(chǎn)地，即河南省、河北省及山東省樣品。藥材與粉末光譜的相似度較高，兩者的歸屬關(guān)系較近，雖然能分別歸屬，但其相似度明顯高于產(chǎn)地歸屬，可被合并為一類(lèi)。

圖5 金銀花樣品聚類(lèi)分析圖

3 結(jié)論

本研究采用定性分析法進(jìn)行金銀花藥材與粉末的近紅外光譜比較研究。通過(guò)對(duì)92種金銀花進(jìn)行譜圖掃描，一階導(dǎo)數(shù)結(jié)合矢量歸一化法，9點(diǎn)平滑進(jìn)行光譜的預(yù)處理，采用原始光譜比較、近紅外一致性模型檢驗(yàn)、定性鑒別和聚類(lèi)分析的方法，比較金銀花藥材與粉末近紅外光譜的差異。研究發(fā)現(xiàn)，在12 000～4 000 cm-1波段內(nèi)，金銀花藥材與粉末的近紅外原始光譜存在一定的差異。在8 003.6～7 243.8 cm-1、6 900.5～5 646.9 cm-1、4 840.7～4 462.7 cm-1波段內(nèi)，藥材與粉末近紅外光譜均在CI限度以?xún)?nèi)，兩者近紅外光譜不易被鑒別。在運(yùn)用因子算法和加權(quán)平均距離法建立聚類(lèi)分析模型中，不同產(chǎn)地的金銀花可進(jìn)行聚類(lèi)。同產(chǎn)地金銀花藥材與粉末光譜的相似度較高，兩者的歸屬關(guān)系較近，可被合并為一類(lèi)，不能被準(zhǔn)確地鑒別。因此，金銀花藥材與粉末不能通過(guò)近紅外光譜的定性分析方法被鑒別。

4 討論

藥材粉碎一般不改變其在化學(xué)、物理和生物學(xué)特性。然而，粉末在樣品性狀鑒別方面存在一定的困難。通過(guò)對(duì)比藥材與粉末的原始光譜，發(fā)現(xiàn)粉末的近紅外吸收程度較高，推測(cè)其原因?yàn)榉勰┡c紫外掃描的接觸面積大于藥材的。

近紅外光譜的定性分析方法的考察，分別進(jìn)行一二階導(dǎo)數(shù)、矢量歸一化法及結(jié)合一二階導(dǎo)數(shù)矢量歸一化法的考察，5～25點(diǎn)平滑的光譜預(yù)處理方法考察，最終選擇一階導(dǎo)數(shù)結(jié)合矢量歸一化法，9點(diǎn)平滑進(jìn)行光譜的預(yù)處理。數(shù)據(jù)計(jì)算方法的考察，包括標(biāo)準(zhǔn)法(歐式距離)、因子化法和因子化(原始光譜)等，最終確定因子化法為本實(shí)驗(yàn)的計(jì)算方法。

近紅外一致性模型檢驗(yàn)結(jié)果顯示，同產(chǎn)地的藥材與粉末在定性鑒別中沒(méi)有明顯差異。聚類(lèi)模型分析進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)論，金銀花藥材與粉末的近紅外光譜在分類(lèi)關(guān)系可歸于一類(lèi)，其相似度明顯高于不同產(chǎn)地樣品的光譜。因此，藥材與粉末的近紅外光譜在定性分析中存在一致性，提示金銀花原產(chǎn)地的藥材可以不用粉碎，直接進(jìn)行近紅外檢測(cè)，簡(jiǎn)化了樣品處理過(guò)程，在金銀花的定性鑒別中具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，為金銀花近紅外檢測(cè)的準(zhǔn)確性和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和新思路。此外，為進(jìn)一步驗(yàn)證藥材與粉末近紅外光譜的差異，需要擴(kuò)大產(chǎn)地的檢測(cè)范圍，并進(jìn)行兩者的近紅外定量分析方面的研究。