秦小靜，馬 微，薛 剛，王冬梅，吳靖芳，范會(huì)利

0 引 言

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，近40年來(lái)甲狀腺乳頭狀微小癌在全球呈現(xiàn)出“爆發(fā)式”增長(zhǎng)趨勢(shì)[1]。甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)在新增的甲狀腺癌中約接近90%[2]。MiRNA與PTC的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移及其侵襲力相關(guān)，并且作為一種生物標(biāo)記物輔助診斷、監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)[3]。MicroRNA(miRNA)是長(zhǎng)度為19～25個(gè)核苷酸的高度保守的單鏈非編碼RNA分子，通過(guò)與相應(yīng)靶信使RNA(mRNA)的3'-非翻譯區(qū)(3'-UTR)相互作用并發(fā)揮重要作用[4]。MiR-143-3p在多種惡性腫瘤低表達(dá)，起抑癌基因作用，過(guò)表達(dá)miR-143-3p通過(guò)下調(diào)不同靶基因抑制卵巢癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、乳腺癌的增殖、遷移和侵襲，有望成為癌癥的潛在治療靶點(diǎn)[5-8]。但截止投稿日期，miR-143-3p在PTC中的作用研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究前期發(fā)現(xiàn)三葉因子3(trefoil factor family 3, TFF3)可以通過(guò)MAPK信號(hào)通路來(lái)影響PTC的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程[9]。本研究旨在探討PTC中miR-143-3p表達(dá)水平、臨床意義及過(guò)表達(dá)對(duì)PTC上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響及其可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 組織標(biāo)本收集2019年1月至2020年8月52例在河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科手術(shù)切除患者的PTC組織及距腫瘤邊緣2cm以上的癌旁組織。液氮速凍后保存于-80℃低溫冰箱備用。所有患者術(shù)前均無(wú)放療化療及免疫治療等抗腫瘤治療史，全部術(shù)后病理切片均經(jīng)2名副高職稱以上的病理科醫(yī)師復(fù)核證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：W2019156)，患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2主要試劑及細(xì)胞系胎牛血清、RPMI 1640、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；miR-143-3p mimics、陰性對(duì)照組mimics-NC、miR-143-3p、U6引物購(gòu)自中國(guó)廣州銳博生物科技公司；qRT-PCR試劑盒購(gòu)自中國(guó)天根生化科技(北京)有限公司；雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司; 包含TFF3-3'UTR野生型(WT-TFF3-3'UTR)和突變序列(MUT-TFF3-3'UTR)的雙熒光素報(bào)告基因質(zhì)粒由北京合生基因公司設(shè)計(jì)合成，Matrigel基質(zhì)膠、Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司；相關(guān)抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞株TPC-1、BCPAP、 K1及人正常甲狀腺細(xì)胞Nthy-ori 3-1細(xì)胞株購(gòu)自北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

1.3Real-time PCR檢測(cè)miR-143-3p表達(dá)Trizol法提取組織樣品和細(xì)胞總RNA，超微量分光光度儀測(cè)定RNA的吸光度(A)。miR-143-3p的正向引物序列為5'- UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC-3'，反向引物序列為5'- GAGCUACAGUGCUUCAUCUCA-3'；內(nèi)參U6的正向引物序列為5'- UUUGUACUACACAAAAGUACUG-3'，反向引物序列為5'-CAGUACUUUUGUGUAGUACAAA-3'。按照逆轉(zhuǎn)錄說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，將cDNA稀釋后根據(jù)Real-time PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行Real-time PCR實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s，40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)(95℃5 s，65℃30 s)。最后，以U6作為內(nèi)參，miR-143-3p的相對(duì)表達(dá)用2-△△Ct法計(jì)算。計(jì)算得到的miRNA-143-3p的相對(duì)表達(dá)量數(shù)值以中位數(shù)為截?cái)嘀担瑢TC組織miRNA-143-3p的表達(dá)水平分為低表達(dá)組和高表達(dá)組，并分析其表達(dá)高低與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染TPC-1、BCPAP、K1和Nthy-ori 3-1細(xì)胞分別培養(yǎng)于10%FBS、1%青鏈霉素的1640或DMEM培養(yǎng)基，放置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2天換液一次，待細(xì)胞匯合度至80%～90% 時(shí)，PBS洗3遍，加入1 mL胰蛋白酶消化并按1∶2傳代，最后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

根據(jù)LipofectamineTM3000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，在轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞鋪板，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%匯合度時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，按每孔5 μL miR-143-3p mimics進(jìn)行轉(zhuǎn)染，取轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)操作。實(shí)驗(yàn)分為3組：空白對(duì)照組(TPC-1)、陰性對(duì)照組(mimics-NC)和mimics-143-3p組。

1.5細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3組細(xì)胞，鋪6孔板，轉(zhuǎn)染48 h后加入1mL 0.25 %胰蛋白酶消化細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并將1×104個(gè)細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)分組分別接種于96孔板，以RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)并置于ESSEN BIOSCIENCE 公司的IncuCyteZOOM長(zhǎng)時(shí)間動(dòng)態(tài)細(xì)胞成像設(shè)備培養(yǎng)，并拍照，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，分析數(shù)據(jù)并繪制生長(zhǎng)曲線。

1.6細(xì)胞劃痕取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3組細(xì)胞，鋪6孔板，轉(zhuǎn)染細(xì)胞48h后加入1mL 0.25 %胰蛋白酶消化細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，制備成5×105/mL的單細(xì)胞懸液，接種于新的6孔板，1640完全培養(yǎng)基補(bǔ)足2 mL。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度為90%時(shí)，用白色槍頭在6孔板內(nèi)垂直劃線，PBS洗3遍，加入無(wú)血清培養(yǎng)基置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，分別于0 h、12 h、24 h在顯微鏡下拍照，Image J測(cè)量細(xì)胞遷移率并分析。

1.7Transwell實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3組細(xì)胞，鋪6孔板，轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后更換為無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓12 h，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，使細(xì)胞密度達(dá)到5×105/mL，置于transwell小室的上室，下室加入500 μL含有10% FBS的1640培養(yǎng)基，24 h后，4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色，PBS洗滌，置于顯微鏡下觀察、拍照、計(jì)數(shù)。

1.8雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)用TargetScan網(wǎng)站預(yù)測(cè)顯示miR-143-3p與TFF3-3'UTR存在結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建TFF3-3'UTR片段的WT-TFF3與MUT-TFF3熒光素酶報(bào)告載體。將含有miR-143-3p結(jié)合位點(diǎn)及及其突變位點(diǎn)的TFF3-3'UTR片段共轉(zhuǎn)染至TPC-1細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后裂解各組細(xì)胞，按照雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)熒光酶活性。相對(duì)熒光酶活性計(jì)算公式如下：

相對(duì)熒光酶活性=螢火蟲(chóng)熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值

1.9Western blot實(shí)驗(yàn)取轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞并提取細(xì)胞總蛋白，BCA法蛋白定量。總蛋白定量為30 μg上樣，進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h后，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，次日洗膜后再分別加入二抗( HRP標(biāo)記羊抗兔和羊抗鼠IgG，工作濃度1∶1000)，室溫孵育2 h，洗膜后加入ECL顯影液顯影。

2 結(jié) 果

2.1 miR-143-3p在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)qRT-PCR結(jié)果顯示，MiR-143-3p在PTC的表達(dá)水平(0.47±0.07)較配對(duì)癌旁組織(1.01±0.11)明顯降低(P<0.05)；在PTC細(xì)胞系TPC-1、BCPAP、K1的表達(dá)水平(0.33±0.06、0.51±0.09、0.55±0.06)低于濾泡上皮Nthy-ori 3-1細(xì)胞系(1.00±0.08)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

2.2miR-143-3p的表達(dá)與癌組織臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系MiR-143-3p的低表達(dá)與TFF3呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.636，P=0.01)。MiR-143-3p低表達(dá)與患者的年齡、腫瘤大小和臨床分期有關(guān)(P<0.01)。臨床分期為Ⅲ+Ⅳ期患者中miR-143-3p的低表達(dá)率更高，腫瘤直徑較小者miR-143-3p具有更高的低表達(dá)率，見(jiàn)表1。

表 1 miR-143-3p的表達(dá)水平與PTC臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3TPC-1細(xì)胞中miR-143-3p轉(zhuǎn)染效果評(píng)價(jià)qRT-PCR顯示：mimics-143-3p組miR-143-3p的表達(dá)水平為(6.64±0.87)是空白對(duì)照組(1.01±0.16)、陰性對(duì)照組(1.16±0.29)的6倍(P<0.001)。

2.4過(guò)表達(dá)miR-143-3p對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，mimics-143-3p組細(xì)胞融合率明顯降低(P<0.01)。轉(zhuǎn)染48h時(shí)，mimics-143-3p組的細(xì)胞融合率較空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組明顯降低(P<0.01)。說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-143-3p能抑制細(xì)胞增殖活性。見(jiàn)圖1，表2。

圖 1 miRNA-143-3p干擾TPC-1 細(xì)胞后在24、48、72、96 h匯合度

表 2 各組TPC-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的增殖情況

2.5過(guò)表達(dá)miR-143-3p對(duì)細(xì)胞的遷移、侵襲能力的影響劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示： mimics-143-3p組細(xì)胞的遷移率、侵襲數(shù)目較陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組明顯降低(P<0.05) ，見(jiàn)圖2、圖3和表3。

圖 2 miRNA-143-3p干擾TPC-1 細(xì)胞后0，12，24h細(xì)胞遷移能力

圖 3 miRNA-143-3p干擾TPC-1 細(xì)胞后細(xì)胞侵襲能力

表 3 各組TPC-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的遷移情況

2.6miR-143-3p與TFF3的靶向關(guān)系驗(yàn)證TargetScan預(yù)測(cè)顯示TFF3的3'UTR含有miR-143-3p的互補(bǔ)序列，采用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-143-3p能明顯抑制野生型WT-TFF3 3’UTR 載體的熒光強(qiáng)度，而無(wú)法影響突變型MT-TFF3 3’UTR載體的熒光強(qiáng)度(P<0.001)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-143-3p后，mimics-143-3p組TFF3蛋白表達(dá)(0.60±0.06)較空白對(duì)照組(0.94±0.08)、陰性對(duì)照組(0.93±0.10)明顯降低(P<0.01)。 見(jiàn)圖4。

圖 4 細(xì)胞中TFF3蛋白含量

2.7Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)mimics-143-3p組細(xì)胞上皮相關(guān)標(biāo)記物蛋白E-cadherin表達(dá)較空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組增強(qiáng)；同時(shí)，間充質(zhì)表型相關(guān)標(biāo)記物蛋白N-cadherin和波形蛋白(vimentin)表達(dá)降低(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

1:空白對(duì)照組; 2:陰性對(duì)照組; 3:mimics-143-3p組

3 討 論

近年來(lái)，隨著診療技術(shù)敏感性和特異性的提高，PTC的發(fā)病率逐年升高。通過(guò)早發(fā)現(xiàn)、早手術(shù)，90%的PTC患者可長(zhǎng)期生存。然而，對(duì)于PTC的手術(shù)切除范圍、淋巴結(jié)清掃等方案尚無(wú)明確標(biāo)準(zhǔn)，臨床上存在過(guò)度治療現(xiàn)象[10]。MiRNAs是一類(lèi)內(nèi)源性非編碼小RNA分子，通常靶向一個(gè)或者多個(gè)mRNA的3'-UTRs，在翻譯水平抑制或降解目的mRNA，負(fù)向調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，廣泛調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲、分化及凋亡等重要生物學(xué)過(guò)程[11-13]。目前，許多研究已經(jīng)確定了miRNA作為潛在的抗癌治療分子和預(yù)后評(píng)價(jià)指標(biāo)。如卵巢癌miR-143-3p可作為潛在治療靶點(diǎn)、胰腺癌miR-143-3p可通過(guò)靶向KRAS抑制腫瘤發(fā)生、結(jié)直腸癌miR-143-3p低表達(dá)與腫瘤直徑和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，患者血清miR-143-3p可以作為潛在非侵入性生物標(biāo)志物[5-7]。在食管鱗狀細(xì)胞癌中，miR-143-3p通過(guò)靶向QKI-5作為腫瘤抑制因子，抑制食管鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)程[12]。Sun等的研究發(fā)現(xiàn)miR-143-3p在骨肉瘤中存在表達(dá)異常，抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[13]。

為明確miR-143-3p在PTC中臨床意義及作用機(jī)制，本研究通過(guò)qRT-PCR對(duì)52對(duì)PTC患者癌與癌旁組織中miR-143-3p的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-143-3p在PTC組織中呈低表達(dá)，提示miR-143-3p與PTC的發(fā)生有關(guān)，可能在PTC中起抑癌基因的作用。進(jìn)一步分析miR-143-3p與PTC患者臨床病例特征的關(guān)系發(fā)現(xiàn)miR-143-3p低表達(dá)與PTC患者的年齡、臨床分期和腫瘤大小密切相關(guān)，Ⅲ+Ⅳ期亞組中miR-143-3p的低表達(dá)率明顯高于Ⅰ+Ⅱ期，提示miR-143-3p的低表達(dá)與PTC的發(fā)展有關(guān)。馮等的研究表明miR-143-3p通過(guò)靶向EZH2并下調(diào)其表達(dá)水平進(jìn)而抑制結(jié)腸癌RKO細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲[14]；另一項(xiàng)研究也表明miR-143-3p通過(guò)靶向TAK1并抑制肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲[15]。鼻鱗癌組織和細(xì)胞系同樣顯示miR-143-3p低表達(dá)，其上調(diào)可顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和G1期阻滯，減弱細(xì)胞增殖和遷移[16]。為了進(jìn)一步研究miR-143-3p對(duì)甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞增殖、侵襲和遷移等惡性生物學(xué)行為的影響及機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)在甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-143-3p mimics，使miR-143-3p的表達(dá)上調(diào)，通過(guò)生長(zhǎng)曲線、Transwell和劃痕實(shí)驗(yàn)對(duì)轉(zhuǎn)染miR-143-3p前后的TPC-1細(xì)胞檢測(cè)。結(jié)果表明過(guò)表達(dá)miR-143-3p后，細(xì)胞增殖活性明顯降低，侵襲及遷移能力明顯下降，進(jìn)一步證實(shí)了miR-143-3p在PTC中能夠抑制TPC-1細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，起著抑癌基因的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)miR-143-3p與TFF3的3'UTR存在種子序列互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)，因此預(yù)測(cè)TFF3可能是miR-143-3p的靶基因。為了驗(yàn)證其靶向關(guān)系，我們通過(guò)western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染了miR-143-3p mimics的TPC-1細(xì)胞中，TFF3的表達(dá)水平明顯降低，進(jìn)一步我們通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)表明，miR-143-3p明顯抑制TPC-1細(xì)胞中TFF3-WT-3'UTR的熒光素酶活性，而對(duì)TFF3-MuT-3'UTR的熒光素酶活性無(wú)明顯抑制作用，證明了miR-143-3p能夠特異性的靶向結(jié)合TFF3的3'UTR 區(qū)。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是癌細(xì)胞從原發(fā)部位到遠(yuǎn)處組織或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要過(guò)程，上皮細(xì)胞逐漸獲得間質(zhì)特征并增強(qiáng)遷移和侵襲性[17]。研究表明SRF通過(guò)上調(diào)miR-143-3p的表達(dá)參與了高糖刺激下引起的人腹膜間皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化過(guò)程[18]。TPC-1細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-143-3p后，上皮間質(zhì)物N-cadherin、Vimentin表達(dá)明顯降低，而E-cadherin蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)。這與Transwell、劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。表明miR-143-3p可以抑制TPC-1細(xì)胞的侵襲、遷移能力，抑制PTC的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程。TFF3作為癌基因參與多種惡性腫瘤的進(jìn)展，促進(jìn)甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移[9,19]?？梢?jiàn)，miR-143-3p通過(guò)靶向TFF3基因發(fā)揮抑制TPC-1細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。進(jìn)一步為PTC診療提供新的靶點(diǎn)。

綜上所述，miR-143-3p在甲狀腺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)降低，可以通過(guò)靶向TFF3抑制TPC-1細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，為甲狀腺癌診斷和靶向治療提供了新的靶點(diǎn)。本研究具有一定的局限性，僅對(duì)本地區(qū)的PTC患者做了臨床病理分析，具有地域的局限性；同時(shí)本研究?jī)H做了體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，探索miR-143-3p影響甲狀腺乳頭狀癌的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程的具體作用機(jī)制及其通路，尚需要通過(guò)進(jìn)一步的深入研究。