許 晶綜述，金順花審校

0 引 言

在中國最常見的十種惡性腫瘤中，消化系統(tǒng)占一半，且部分腫瘤的發(fā)病率逐年上升[1]。在以“精準(zhǔn)醫(yī)療”為主題的診療背景下，如何實(shí)現(xiàn)個體化、精準(zhǔn)、有效治療是現(xiàn)在和未來消化系統(tǒng)腫瘤患者治療的發(fā)展研究方向。循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)可作為一種潛在的腫瘤標(biāo)記物[2]，其檢測方式具有無創(chuàng)性、可重復(fù)性，可以為腫瘤的早期篩查、療效的實(shí)時監(jiān)測、預(yù)測復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及判斷預(yù)后提供重要信息。本文主要就ctDNA及其在消化系統(tǒng)腫瘤中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行闡述。

1 ctDNA概述

1948年，MandEL和METAIS第1次在血液中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外的循環(huán)游離 DNA(circulating cell-free DNA，cfDNA)[3]。ctDNA是一種循環(huán)中的cfDNA，是通過腫瘤細(xì)胞壞死、凋亡等方式釋放到體液中的。ctDNA在外周血等體液中有多種存在形式(包括單鏈、雙鏈、蛋白質(zhì)復(fù)合體等)[4-5]。ctDNA具有與腫瘤組織相同的基因變異信息，如突變、拷貝數(shù)異常和過度甲基化等[6]。ctDNA片段的大小波動很大，約70～21 000 bp[7]，半衰期從數(shù)分鐘到數(shù)小時不等。同時，ctDNA含量和腫瘤組織類型、部位、負(fù)荷等具有相關(guān)性。根據(jù)上述ctDNA的特點(diǎn)，將其應(yīng)用于腫瘤發(fā)展過程的檢測中，為消化系統(tǒng)腫瘤的診治提供新的手段。

2 ctDNA的檢測方法

目前ctDNA 的檢測手段很多，各有其優(yōu)缺點(diǎn)和適用的檢測范圍。檢測技術(shù)通過對ctDNA進(jìn)行定量或定性，來獲得原發(fā)腫瘤的基因缺陷信息。目前常用的檢測方法有數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、下一代測序技術(shù)兩種。

2.1數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(digital polymerase chain reaction, dPCR)dPCR作為一種定量檢測技術(shù)，可以直接算出核酸分子的數(shù)目。dPCR定量的原理是通過稀釋樣本，使其進(jìn)行獨(dú)立的PCR反應(yīng)，然后再獨(dú)立擴(kuò)增來計(jì)算出目標(biāo)分子序列的濃度[8]。腫瘤學(xué)中最常用dPCR技術(shù)有3種，包括微滴式數(shù)字PCR(droplet digital dolymerase chain reaction ，ddPCR)、基于芯片的dPCR、BEAMing 技術(shù)。目前ddPCR是檢測KRAS突變的一種準(zhǔn)確、簡便的ctDNA定量技術(shù)。Earl等[9]應(yīng)用ddPCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)KRAS突變與胰腺癌患者生存期顯著相關(guān)。Cheng等[10]利用ddPCR在胰腺癌患者中檢測的KRAS的突變率為72.3%。與其他dPCR方法相比[11]，ddPCR不需要使用稀釋的樣品，也不需要與復(fù)雜的微流體系統(tǒng)進(jìn)行分配是其優(yōu)點(diǎn)之一?；谛酒膁PCR主要優(yōu)點(diǎn)是由于沒有乳化PCR，既降低了成本，也降低了污染和樣品丟失的風(fēng)險，與其他dPCR相比，價格最低。BEAMing的優(yōu)勢是靈敏度高，但其流程操作復(fù)雜，價格也因檢測成本增加而升高。

2.2下一代測序技術(shù)(next-generation sequencing,NGS)NGS作為一種高自動化的測序技術(shù)，可以同時對幾百萬條DNA分子進(jìn)行分析，極大地降低了測序時間和成本。下一代測序提供了一種在更廣闊的目標(biāo)空間中篩選突變的方法。NGS首先利用PCR擴(kuò)增位點(diǎn)，然后對擴(kuò)增子內(nèi)的整個區(qū)域進(jìn)行測序，從而可以檢測出目標(biāo)空間內(nèi)的任何變異。NGS技術(shù)在消化系統(tǒng)腫瘤中的應(yīng)用具有廣闊的前景。JIN等[12]利用基因NGS測試來評估46名接受免疫治療的進(jìn)展期胃癌患者的治療效果。Tarazona等[13]應(yīng)用NGS追蹤結(jié)腸癌的微小殘留病變，進(jìn)而確定結(jié)腸癌復(fù)發(fā)的高?；颊?。Rachiglio等[14]用NGS技術(shù)分析轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的ctDNA的RAS突變，敏感性為100%。NGS適用于血漿樣本的檢測，但同時NGS的敏感性也會受到原發(fā)腫瘤的存在和異質(zhì)性的影響。NGS可應(yīng)用于腫瘤的篩查、早期診斷、療效評估、預(yù)測復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及預(yù)后等。目前關(guān)于ctDNA的檢測與分析尚未有公認(rèn)的參考標(biāo)準(zhǔn)。希望通過未來更大樣本數(shù)據(jù)的積累，為ctDNA檢測標(biāo)準(zhǔn)指南的出臺做出貢獻(xiàn)。

3 ctDNA在消化系統(tǒng)腫瘤中的臨床應(yīng)用進(jìn)展

3.1 ctDNA與腫瘤篩查及早期診斷采用精準(zhǔn)有效的檢測技術(shù)實(shí)現(xiàn)早診早治，可改善早期消化系統(tǒng)腫瘤患者預(yù)后。多項(xiàng)研究表明，腫瘤患者和健康者血漿中ctDNA水平存在差異。在胃癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、肝癌患者血漿中的ctDNA含量高于健康者[15-17]。消化系統(tǒng)腫瘤的早期即可出現(xiàn)許多基因改變(如基因突變、雜合性缺失和基因過度甲基化等)。原癌基因 KRAS 突變是消化系統(tǒng)腫瘤的早期事件之一。在結(jié)直腸癌患者的血漿ctDNA中可檢測到KRAS突變，其突變狀態(tài)與腫瘤組織具有較高的一致性[18]。Almoguera等[19]發(fā)現(xiàn)，ctDNA可以檢測到胰腺癌KRAS基因的密碼子12點(diǎn)突變。在胰腺癌中，ctDNA和腫瘤組織中KRAS突變的符合率約為54%～91%[20]。ctDNA與糖類抗原19-9、癌胚抗原carcinoembryonic antigen,CEA)等聯(lián)合檢測早期胰腺癌，其靈敏度為64.0%，特異度為99.5%[21]。胰腺癌的發(fā)生有一個較長的亞臨床期，通過臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查很難早期診斷，但可以通過對胰腺癌患者外周血ctDNA的突變基因進(jìn)行檢測，實(shí)現(xiàn)對胰腺癌的早期篩查。DNA甲基化等表觀遺傳變化是癌癥發(fā)生的早期特點(diǎn)。ctDNA異常甲基化檢測可應(yīng)用于消化系統(tǒng)腫瘤的早期篩查和早期診斷。有數(shù)據(jù)表明，對于早期結(jié)直腸癌的診斷，ctDNA的SEPT9 異常甲基化顯示出比傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物更好的敏感性[22]。Lu等[23]研究結(jié)果表明，血漿ctDNA中RASSF1A、COX2和APC基因的高甲基化可用于鑒別甲胎蛋白 <20 ng/mL的肝細(xì)胞癌患者。

ctDNA在消化系統(tǒng)腫瘤的早期篩查與診斷中表現(xiàn)出巨大的潛力，未來我們可能在腫瘤產(chǎn)生臨床癥狀與影像學(xué)表現(xiàn)出現(xiàn)之前，就可以提前對消化系統(tǒng)腫瘤高危人群進(jìn)行普及篩查，對ctDNA 陽性患者早期防治，提高患者的生存率。

3.2ctDNA與治療療效評估針對不適合手術(shù)的晚期腫瘤患者，當(dāng)前的治療方案是以綜合治療為主，包含新輔助化療、靶向藥物治療和免疫治療等。ctDNA保留了腫瘤基因組信息，半衰期較短，可以動態(tài)監(jiān)測，實(shí)時判斷藥物療效及耐藥情況，指導(dǎo)臨床醫(yī)師及時調(diào)整、制定精準(zhǔn)有效的治療方案。

3.2.1ctDNA與新輔助化療新輔助化療能在術(shù)前有效縮小腫瘤或轉(zhuǎn)移灶，已被研究證明能成功提高胃癌、結(jié)腸癌的總體生存率[24]，是晚期消化系統(tǒng)腫瘤的主要治療策略。新輔助化療需要及時監(jiān)測治療反應(yīng)，為患者選擇最佳的手術(shù)時機(jī)及調(diào)整化療周期。近年ctDNA檢測技術(shù)的發(fā)展日新月異，可檢測出微小殘留病灶[25]，且早于CEA水平上升和影像學(xué)診斷，根本上改變了對新輔助化療療效的評估方式[26]。研究發(fā)現(xiàn)，ctDNA水平與新輔助治療前后的腫瘤負(fù)荷密切相關(guān)[27]。接受新輔助治療后，ctDNA水平持續(xù)升高的2名直腸癌患者，均發(fā)生了腫瘤復(fù)發(fā)；Tie等[28]發(fā)現(xiàn)新輔助治療后的ctDNA水平可作為預(yù)測直腸癌復(fù)發(fā)的生物學(xué)標(biāo)志物。FOLFIRINOX(奧沙利鉑、伊立替康、氟尿嘧啶、亞葉酸鈣)為胰腺癌一線新輔助化療方案。Wei等[29]發(fā)現(xiàn)38名接受FOLFIRINOX化療的晚期胰腺癌患者的ctDNA與腫瘤負(fù)荷相關(guān)，監(jiān)測ctDNA可評估新輔助化療效果，指導(dǎo)新輔助化療的個體化治療，減少過度的化療和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

3.2.2ctDNA與靶向藥物治療靶向治療需要首先對腫瘤進(jìn)行基因檢測，確定靶向藥物的靶點(diǎn)。靶向治療依賴于敏感基因和耐藥基因的檢測。目前，胃癌靶向治療中主要藥物靶點(diǎn)是人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)，曲妥珠單抗是抗HER2的單克隆抗體，目前尚無預(yù)測療效及耐藥標(biāo)志物。Wang等[30]研究發(fā)現(xiàn)，56例應(yīng)用曲妥珠單抗治療的進(jìn)展期胃癌患者的ctDNA和腫瘤組織中HER2擴(kuò)增具有高度一致性，表明ctDNA可作為評估曲妥珠單抗靶向治療療效的標(biāo)志物。HER2擴(kuò)增是結(jié)腸癌的一種新興生物標(biāo)志物。Siravegna等[31]研究表明，ctDNA的HER2拷貝數(shù)高的結(jié)腸癌患者對HER2靶向治療反應(yīng)更好，可用于篩選HER2靶向治療適合人群。

靶向治療的大部分患者產(chǎn)生耐藥性[32]，通過實(shí)時監(jiān)測外周血 ctDNA 的基因變化，有助于及早地發(fā)現(xiàn)耐藥性。研究顯示，通過腫瘤組織的基因改變評估耐藥具有局限性，ctDNA與腫瘤組織有相似的基因譜，可替代活檢分析腫瘤耐藥機(jī)制[33]。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)擴(kuò)增在結(jié)直腸癌中最為常見[34]，西妥昔單抗和帕尼圖單抗(EGFR的單克隆抗體)是結(jié)直腸癌患者常用的靶向藥物。大部分患者對EGFR靶向治療反應(yīng)短暫，持續(xù)時間不超過12～18個月，提示腫瘤細(xì)胞對藥物產(chǎn)生了耐藥性[35]。研究表明EGFR抗體的耐藥性與RAS突變有關(guān)。Cao等[36]利用ctDNA對152例晚期結(jié)腸癌患者進(jìn)行了治療靶點(diǎn)的研究，結(jié)果共確定56例患者(36.84%)的90個藥物敏感基因，揭示了抗EGFR抗體的各種耐藥機(jī)制。英菲格拉替尼是成纖維細(xì)胞生長因子受體(fibroblast growth factor recepter，F(xiàn)GFR)抑制劑。文獻(xiàn)報道，對接受英菲格拉替尼治療的3名晚期肝內(nèi)膽管癌患者進(jìn)行ctDNA分析，發(fā)現(xiàn)FGFR2基因新的點(diǎn)突變與英菲格拉替尼的耐藥性有關(guān)[37]。腫瘤靶向藥物的耐藥是臨床上亟待解決的問題，利用ctDNA揭示腫瘤靶向藥物的耐藥分子機(jī)制，尋找新的藥物靶點(diǎn)，及時發(fā)現(xiàn)耐藥產(chǎn)生，指導(dǎo)患者用藥，使患者臨床獲益更大，并將促進(jìn)精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展。

3.2.3ctDNA與免疫治療免疫治療作為一種新興的腫瘤治療策略，目前尚未廣泛應(yīng)用于消化系統(tǒng)腫瘤治療。免疫檢查點(diǎn)抑制劑(immune checkpoint inhibitors,ICIs)可以阻斷免疫檢查點(diǎn)[如程序性死亡因子-1(programmed death 1,PD-1) ]，恢復(fù)T細(xì)胞活化，使其發(fā)揮抗腫瘤作用[38]。利用ctDNA可以評估消化系統(tǒng)腫瘤患者ICIs治療后的預(yù)后[39]。目前，抗PD-1已被批準(zhǔn)應(yīng)用于轉(zhuǎn)移性黑色素瘤等腫瘤中[40]，對接受ICIs的轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者，進(jìn)行BRAF或NRAS突變定量可以監(jiān)測腫瘤的耐藥性。這對探索ctDNA在剛嶄露頭角的消化系統(tǒng)腫瘤免疫治療有非常大的參考和借鑒價值。Khagi等[41]檢測69例接受ICIs治療后的惡性腫瘤患者(其中6例為消化系統(tǒng)腫瘤患者)血漿ctDNA,結(jié)果表明，ctDNA突變>3個意義不明確的突變患者接受ICIs治療后，生存期延長。研究顯示，ICIs治療前ctDNA基線水平低的患者較ctDNA基線水平高的患者，療效好，無進(jìn)展生存期長[42]。假進(jìn)展給臨床醫(yī)師評估免疫檢查點(diǎn)阻斷療效帶來新的挑戰(zhàn)。假進(jìn)展是指原發(fā)腫瘤的大小先增加或出現(xiàn)新的病變[43-44]，隨后腫瘤縮小。Guibert等[45]對2例KRAS突變的胰腺癌患者進(jìn)行ctDNA分析，結(jié)果表明，ctDNA低水平與免疫治療的假進(jìn)展相關(guān)，ctDNA高水平與真進(jìn)展有關(guān)。我們可以通過ctDNA水平或基因突變檢測，判斷消化系統(tǒng)腫瘤免疫治療效果，避免因采樣困難、腫瘤假性進(jìn)展對免疫治療方案療效產(chǎn)生誤判。

3.3ctDNA與復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及預(yù)后評估消化系統(tǒng)腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是患者死亡的主要原因，與臨床發(fā)現(xiàn)不及時有關(guān)。因此評估復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移與預(yù)后，對于提高患者生存期意義重大。實(shí)時監(jiān)測ctDNA水平及基因變化，可評估腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及術(shù)后患者的殘余病灶，其具有潛在的臨床應(yīng)用價值。ctDNA是一種評估腫瘤負(fù)荷更直接、簡便的生物標(biāo)志物。與CT成像相比，提前2～15個月發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)[46]。越來越多的證據(jù)表明，ctDNA與消化系統(tǒng)腫瘤的預(yù)后有關(guān)。Pietrasz等[47]對135例胰腺癌患者的ctDNA進(jìn)行分析，結(jié)果表明ctDNA是判斷晚期胰腺癌預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)。Lee等[48-49]發(fā)現(xiàn)ctDNA預(yù)測術(shù)后胰腺癌患者復(fù)發(fā)的敏感性為90%，特異性為88%。Fang等[50]納入2326名胰腺癌患者薈萃表明分析，ctDNA是胰腺癌患者的總生存率和無進(jìn)展生存率的重要預(yù)測因子。研究表明，利用ctDNA檢測可預(yù)測胃癌、結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險[51-52]。Watanabe 等[53]研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)后1年內(nèi)未檢測出 ctDNA的KRAS突變患者，預(yù)后明顯改善，提示ctDNA的KRAS突變與胰腺癌的預(yù)后密切相關(guān)。

4 ctDNA檢測的優(yōu)勢及局限性

ctDNA檢測以其無創(chuàng)、簡便、重復(fù)性高等優(yōu)勢，可突破組織檢測的局限性，更好地反應(yīng)腫瘤基因突變的全貌，在消化系統(tǒng)腫瘤個體化、精準(zhǔn)治療中發(fā)揮重要作用，有廣闊的應(yīng)用前景，但其在臨床應(yīng)用中面臨許多挑戰(zhàn)，尚需要解決[54]：①臨床對于ctDNA目前還沒有統(tǒng)一的提取和檢測標(biāo)準(zhǔn)。②早期腫瘤中ctDNA水平低以及存在其他DNA的污染，要求檢測ctDNA的技術(shù)具有高敏感性和高特異性。③液體活檢存在技術(shù)困難[55]，如難以檢測到某些重要的染色體畸變(如基因融合)。④檢測費(fèi)用高，患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重，如何改進(jìn)技術(shù)、降低成本也是未來的難題。

5 結(jié)語與展望

在精準(zhǔn)醫(yī)療的環(huán)境下，ctDNA為消化系統(tǒng)腫瘤學(xué)提供了一種新的診斷技術(shù)工具，是未來基礎(chǔ)與臨床研究的一個大趨勢。隨著對ctDNA的不斷探索和檢測技術(shù)的快速發(fā)展，ctDNA 在消化系統(tǒng)腫瘤的早期診斷、治療靶點(diǎn)篩選、耐藥監(jiān)測、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移預(yù)測及預(yù)后判斷等方面具有良好的應(yīng)用前景，將在消化系統(tǒng)腫瘤的個體化、精準(zhǔn)化醫(yī)療中發(fā)揮重要作用。但是目前ctDNA 檢測尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，敏感性及特異性有待進(jìn)一步提高，并需要大規(guī)模、前瞻性臨床研究驗(yàn)證其可行性，在臨床應(yīng)用之前仍面臨著相當(dāng)大的挑戰(zhàn)。