王建國(guó) 孫麗麗 李欣悅 苑 冉 曹傳旺,2

（1. 東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2. 東北林業(yè)大學(xué)森林生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)經(jīng)營(yíng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040）

全球氣候變暖已經(jīng)引起世界范圍內(nèi)的關(guān)注，據(jù)IPCC報(bào)道CO2濃度在2005年已達(dá)到397 μL/L，并預(yù)測(cè)在21世紀(jì)中葉將達(dá)到550 μL/L左右，21世紀(jì)末將達(dá)到800 μL/L左右[1]。隨著全球氣候變暖，大氣CO2濃度不斷升高會(huì)直接或間接影響森林生態(tài)系統(tǒng)，昆蟲作為森林生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成，同樣也會(huì)受到CO2濃度變化帶來(lái)的影響[2]。高濃度CO2下的棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）幼蟲發(fā)育遲緩，幼蟲質(zhì)量下降，取食量和排糞量增加[3]。與正常大氣環(huán)境相比，高濃度CO2下草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）各蟲態(tài)發(fā)育歷期顯著延長(zhǎng)，且蛹質(zhì)量顯著大于低濃度CO2[4]。高濃度CO2下飼養(yǎng)的棉蚜（Aphis gossypii）對(duì)植物揮發(fā)物的響應(yīng)更強(qiáng)，對(duì)棉苗的趨向性增強(qiáng)，同時(shí)氣味結(jié)合蛋白（OBP）基因（OBP2和OBP7）和化學(xué)感受蛋白基因（CSP4和CSP6）的相對(duì)表達(dá)量增加[5]。氣味結(jié)合蛋白是一類小分子球狀蛋白，通常由135～220個(gè)氨基酸組成，含有2～3個(gè)二硫鍵[6]。昆蟲通過(guò)氣味結(jié)合蛋白對(duì)外界氣味分子進(jìn)行特異性識(shí)別[7]。氣味結(jié)合蛋白與揮發(fā)性物質(zhì)結(jié)合，并將其運(yùn)輸至昆蟲觸角感覺神經(jīng)元末梢上的受體，將化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)氣味從觸角表皮到氣味受體之間的傳遞[8]。基于OBP基因在嗅覺系統(tǒng)中的重要作用，越來(lái)越多的昆蟲OBP基因被鑒定，如蘋果蠹蛾（Cydia pomonella）[9]、桔小實(shí)蠅（Bactrocera dorsalis）[10]、黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）[11]和棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）[12]。其中黑腹果蠅基因組中鑒定了60條OBPs[11]，棉鈴蟲轉(zhuǎn)錄組中鑒定了26條OBPs[12]。

舞毒蛾是一種世界性林業(yè)食葉害蟲，國(guó)內(nèi)外報(bào)道舞毒蛾能夠危害500多種寄主植物[13]，給我國(guó)農(nóng)林業(yè)造成了巨大損失。隨著全球氣候變暖，高濃度CO2對(duì)昆蟲的嗅覺行為具有顯著影響，OBPs是昆蟲重要的嗅覺基因，而舞毒蛾OBPs的鑒定及其對(duì)CO2濃度脅迫響應(yīng)報(bào)道甚少。因此，本研究在分析舞毒蛾轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)的基礎(chǔ)上克隆獲得了LdOBP1和LdOBP2基因，進(jìn)行基因序列分析，并利用實(shí)時(shí)熒光定量RT?PCR技術(shù)分析LdOBP1和LdOBP2對(duì)CO2濃度變化的響應(yīng)，為探討高濃度CO2下舞毒蛾適應(yīng)性機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx與處理

舞毒蛾卵和人工飼料均購(gòu)于中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所，卵在10 %甲醛溶液中浸泡1 h，用清水反復(fù)沖洗干凈后放入光周期14L∶10D、溫度(25 ± 1)℃、濕度(70 ± 5)%的CO2人工氣候培養(yǎng)箱中孵化，實(shí)驗(yàn)組CO2濃度分別設(shè)置為550 μL/L和750 μL/L，對(duì)照組為正常大氣CO2濃度（397 μL/L），舞毒蛾卵至成蟲放置于不同CO2濃度下飼養(yǎng)，舞毒蛾1～3齡，每養(yǎng)蟲盒每齡放置30頭幼蟲，4齡以后每養(yǎng)蟲盒放置10頭幼蟲，人工飼料切成小塊飼喂，每天更換養(yǎng)蟲盒及新鮮飼料。

1.2 LdOBP基因克隆與分析

采用RNeasy Mini動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒，提取各齡期舞毒蛾總RNA，提取的樣品由深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序。對(duì)獲得的Unigenes進(jìn)行Blastx和Blastn分析，根據(jù)功能注釋結(jié)果選擇具有完整ORF的OBP基因，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行RT?PCR驗(yàn)證，測(cè)序驗(yàn)證獲得2個(gè)OBP基因序列。利用表1中軟件及程序?qū)dOBP1和LdOBP2進(jìn)行生物信息學(xué)分析。利用Blast (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/BLAST/)程序進(jìn)行序列同源性搜索，選擇與其相似度高的不同昆蟲的OBP蛋白氨基酸序列，利用ClustalW進(jìn)行多序列比對(duì)。利用Clustalx (1.83)和MEGA5.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1 舞毒蛾LdOBP1和LdOBP2基因特性分析生物信息學(xué)軟件Table 1 Bioinformatics software for gene characterization analysis of LdOBP1 and LdOBP2 in L. dispar

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR

解剖舞毒蛾3齡幼蟲第1天頭、表皮和中腸，觸角、頭、胸、腹、足取自羽化第1天舞毒蛾成蟲，上述樣品均取自3頭以上舞毒蛾，液氮凍存后提取RNA。用DNaseI（Promega）消化總RNA中的DNA，測(cè)定其質(zhì)量濃度，按照PimeScriptTMRT reagent Kit（Takara）合成cDNA。反應(yīng)條件：42 ℃60 min，8 ℃ 5 s，16 ℃ 10 min。將cDNA稀釋10倍備用。引物采用Primer 5.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，內(nèi)參基因（Actin、TUB和EF1α），LdOBP1和LdOBP2基因的引物序列見表2，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。按照SYBR Green Real-time PCR Master mix熒光定量PCR試劑盒（Toyobo）在CFX96 Real?Time PCR Detection System（Bio?Rad）檢測(cè)LdOBP1和LdOBP2基因的表達(dá)量。反應(yīng)體系為：2 × SYBR premix ExTaq酶10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，稀釋后的cDNA 2 μL，去離子水補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 30 s，94 ℃ 12 s，58 ℃ 45 s，72 ℃40 s，81 ℃ 1 s，循環(huán)數(shù)為45，用2?ΔΔCT方法進(jìn)行基因相對(duì)表達(dá)水平分析[14]。每個(gè)樣品重復(fù)3次。對(duì)3個(gè)內(nèi)參進(jìn)行幾何平均以標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)，用內(nèi)參基因的CT值歸一化目的基因的CT值：ΔCT=CT（目的基因）? CT（內(nèi)參基因），再用對(duì)照樣品的ΔCT值歸一化待測(cè)樣品的ΔCT值：ΔΔCT= ΔCT（待測(cè)樣品）?ΔCT（對(duì)照樣品），用2?ΔΔCT計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

表2 本文所用引物序列Table 2 Primer sequences used in this study

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

采用Excel 2007計(jì)算表達(dá)量數(shù)據(jù)，運(yùn)用SPSS 17.0（SPSS Inc, USA）統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行ANOVA分析，使用Origin Pro 8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 LdOBP基因克隆與序列分析

通過(guò)舞毒蛾轉(zhuǎn)錄組分析和RT?PCR驗(yàn)證獲得2個(gè)舞毒蛾OBP家族全長(zhǎng)基因，LdOBP1和LdOBP2基因開放閱讀框（ORF）大小分別為450 bp和417 bp，編碼149個(gè)和138個(gè)氨基酸。ProtParam預(yù)測(cè)編碼LdOBP1和LdOBP2蛋白的分子量分別為19.41和15.35 kDa，理論等電點(diǎn)分別為11.17和6.73，LdOBP1為堿性蛋白，LdOBP2為酸性蛋白。BlASTP對(duì)2個(gè)蛋白保守區(qū)預(yù)測(cè)表明，LdOBP1和LdOBP2蛋白屬于氣味結(jié)合蛋白家族。運(yùn)用TMH MM2.0 Server分析舞毒蛾LdOBP1和LdOBP2基因的跨膜區(qū)域，并未發(fā)現(xiàn)跨膜區(qū)域。舞毒蛾LdOBP1基因未發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽序列，而LdOBP2基因含有信號(hào)肽序列，位置在1?22。

2.2 LdOBP進(jìn)化樹分析

通過(guò)BLASTP進(jìn)行序列同源性搜索，選擇與舞毒蛾OBP序列相似程度高的11種昆蟲的26個(gè)OBP蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)和進(jìn)化樹分析（圖1和圖2）。多序列比對(duì)結(jié)果顯示，LdOBP1具有6個(gè)保守的Cys殘基（C），符合Classic家族特征，LdOBP2具有4個(gè)保守的Cys殘基（C），缺失第2、5位的Cys殘基，符合Minus?C家族特征。進(jìn)化樹分析結(jié)果表明：11種昆蟲的OBP蛋白分為2類，其中舞毒蛾LdOBP1與桃小食心蟲（Carposina sasakii）AYD42195.1親緣關(guān)系近而聚為一支，舞毒蛾LdOBP2與桃小食心蟲AYD42180.1親緣關(guān)系近而聚為另一支。

圖1 舞毒蛾氣味結(jié)合蛋白的分子進(jìn)化樹Fig. 1 The phylogenetic tree of OBPs in L. dispar

圖2 舞毒蛾LdOBP和其他昆蟲OBPs氨基酸序列比對(duì)Fig. 2 Alignment of amino acid sequences of LdOBP in L. dispar and OBPs in other insects

2.3 CO2濃度對(duì)LdOBPs組織特異性表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步明確CO2濃度變化對(duì)LdOBPs基因表達(dá)水平的影響，采用qRT?PCR技術(shù)測(cè)定CO2濃 度 分 別 為397 μL/L（大 氣 濃 度）、550 μL/L和750 μL/L時(shí)，舞毒蛾3齡幼蟲和雌、雄成蟲各組織OBPs基因表達(dá)量（圖3～5）。LdOBP1和LdOBP2基因均在幼蟲頭部表達(dá)水平最高。高濃度CO2脅迫下，LdOBP1基因表達(dá)量顯著下降，而幼蟲頭部和中腸LdOBP2基因在高濃度CO2脅迫下表達(dá)水平呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。在550 μL/L和750 μL/L CO2濃度脅迫下，幼蟲頭部LdOBP1基因表達(dá)量分別比對(duì)照組下降了32.70%和42.33%，在表皮中表達(dá)量分別比對(duì)照組下降了50.95%和62.17%，在幼蟲中腸LdOBP1表達(dá)量比對(duì)照組分別降低了16.22%和16.35%。LdOBP2基因在550 μL/LCO2濃度脅迫下幼蟲頭部和表皮表達(dá)量均有所下降，分別為對(duì)照組的82.13%和74.09%；CO2濃度為750 μL/L時(shí)表皮中LdOBP2基因相對(duì)表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，比對(duì)照組降低了66.15%，而頭部表達(dá)水平顯著上升，其表達(dá)量為對(duì)照組的1.36倍。LdOBP2基因在中腸的表達(dá)水平隨CO2濃度的升高呈上升趨勢(shì)，550 μL/L和750 μL/L CO2濃度處理組表達(dá)水平分別增加了30.31 %和23.59 %（圖3）。LdOBP1和LdOBP2基因在雌、雄成蟲觸角表達(dá)水平顯著高于其他組織。隨著CO2濃度升高，LdOBP1和LdOBP2基因表達(dá)水平顯著下調(diào)。550 μL/L和750 μL/L CO2濃度下，LdOBP1基因在雌成蟲觸角的表達(dá)量分別比對(duì)照組下降54.18%和61.14%，LdOBP2基因在雌成蟲觸角的表達(dá)量分別比對(duì)照組下降43.65%和52.79%；LdOBP1基因在雄成蟲觸角的表達(dá)量分別比對(duì)照組下降21.25%和59.32%，LdOBP2基因在雄成蟲觸角的表達(dá)量分別比對(duì)照組下降55.99%和57.33%。不同CO2濃度下雌、雄成蟲其他組織LdOBPs基因表達(dá)量無(wú)顯著性差異（圖4和圖5）。

圖3 不同CO2濃度下舞毒蛾幼蟲組織LdOBP1和LdOBP2基因表達(dá)量Fig. 3 Gene expressions of LdOBP1 and LdOBP2 in different tissues of L. dispar larvae under different CO2 concentrations

圖4 不同CO2濃度下舞毒蛾雌成蟲各組織LdOBP1和LdOBP2基因表達(dá)量Fig. 4 Expression levels of LdOBP1 and LdOBP2 in different tissues of female L. dispar adults under different CO2 concentrations

圖5 不同CO2濃度下舞毒蛾雄成蟲各組織LdOBP1和LdOBP2基因表達(dá)量Fig. 5 Expression levels of LdOBP1 and LdOBP2 in different tissues of male L. dispar adults under different CO2 concentrations

3 結(jié)論與討論

近年來(lái)，舞毒蛾蟲害的大面積暴發(fā)，給我國(guó)農(nóng)林業(yè)造成巨大損失。目前，舞毒蛾研究主要集中在生物學(xué)特性及外源次生物質(zhì)對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育和生化酶的影響[15?16]，而有關(guān)舞毒蛾氣味結(jié)合蛋白及其嗅覺分子機(jī)制研究鮮有報(bào)道。氣味結(jié)合蛋白的特異性表達(dá)影響昆蟲一系列的生命活動(dòng)[17]。目前已在多種昆蟲中鑒定出了OBP基因，如意大利蜜蜂（Apis mellifera）[18]、中華按蚊（Anopheles sinensis）[19]、斜紋夜蛾（Spodoptera litura）[20]、中紅側(cè)溝繭蜂（Microplitis mediator）[21]等。隨著研究的深入，OBP基因的功能逐漸得到驗(yàn)證，一般來(lái)說(shuō)其功能主要為以下幾類：1）當(dāng)氣味分子進(jìn)入淋巴液后，OBP能特異性的識(shí)別氣味分子[22]。2）由于氣味分子多為脂溶性，OBP可以作為氣味分子的溶劑，與氣味分子結(jié)合形成水溶性復(fù)合體，并將其運(yùn)送至神經(jīng)元膜[23]。3）能夠?qū)馕斗肿悠鸬奖Ｗo(hù)作用，使其免于被氣味降解酶降解[24]。本研究克隆獲得2個(gè)舞毒蛾OBP家族全長(zhǎng)基因，多序列比對(duì)結(jié)果顯示LdOBP1和LdOBP2分別屬于Classic和Minus?C家族。進(jìn)化樹分析結(jié)果表明舞毒蛾LdOBP1與桃小食心蟲AYD42195.1聚為一支，LdOBP2與桃小食心蟲AYD42180.1聚為另一支，表明其親緣關(guān)系較近，可能具有相似的功能。

全球氣候變暖對(duì)昆蟲的影響引起國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注[1]。CO2濃度變化引起昆蟲的生長(zhǎng)發(fā)育等生理變化機(jī)制成為研究熱點(diǎn)。如高濃度CO2（800 μL/L）下粘蟲（Mythimna separata）雌成蟲壽命顯著縮短，且產(chǎn)卵量顯著下降[25]。舞毒蛾2齡幼蟲取食高濃度CO2培育下的小青楊（Populus pseudosimonii）體重顯著低于取食大氣CO2濃度培育下的小青楊幼蟲體重[26]。閆麗瓊等報(bào)道高濃度CO2顯著抑制舞毒蛾幼蟲LdJHBP基因的表達(dá)[27]。但關(guān)于CO2濃度變化對(duì)昆蟲嗅覺系統(tǒng)影響的研究較少，相關(guān)研究主要集中在嗅覺相關(guān)基因的表達(dá)與寄主選擇行為機(jī)制。研究報(bào)道CO2濃度升高的條件下，棉蚜OBP基因表達(dá)量增加，對(duì)植物揮發(fā)物的選擇能力增強(qiáng)[5]。在高濃度CO2下，埃及伊蚊（Aedes aegypti）嗅覺受體神經(jīng)元受到抑制，導(dǎo)致其尋找宿主的行為能力受阻[28]。本實(shí)驗(yàn)研究高濃度CO2脅迫下舞毒蛾LdOBP1和LdOBP2基因的表達(dá)情況，研究結(jié)果顯示舞毒蛾LdOBP1和LdOBP2基因均在幼蟲頭部表達(dá)水平最高。LdOBP2基因表達(dá)水平在高濃度CO2下頭部和中腸表現(xiàn)出不同程度的促進(jìn)。這一結(jié)果與CO2濃度變化下棉蚜OBP2和OBP7基因表達(dá)模式類似[5]。而高濃度CO2下顯著抑制了舞毒蛾各組織LdOBP1基因表達(dá)，但2個(gè)基因表達(dá)模式不同，這可能由于兩者功能存在差異。不同CO2濃度下舞毒蛾LdOBP1和LdOBP2基因均在成蟲觸角表達(dá)水平最高，頭部次之，其余組織表達(dá)量較少，這表明舞毒蛾LdOBP1和LdOBP2基因主要在舞毒蛾觸角中發(fā)揮作用。該結(jié)果也與多數(shù)昆蟲的表達(dá)模式類似，如楊小舟蛾（Micromelalopha troglodyta）的組織特異性表明MtroOBP1在成蟲各組織均有表達(dá)，其在觸角中的表達(dá)量最高[29]。中華蜜蜂（Apis cerana）的組織表達(dá)譜顯示AccOBP3基因在足部和觸角中表達(dá)水平較高，頭部和腹部表達(dá)量較低[30]。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)高濃度CO2脅迫下顯著抑制了舞毒蛾觸角中LdOBP1和LdOBP2基因表達(dá)。這些結(jié)果表明高濃度CO2影響舞毒蛾不同組織中LdOBPs基因的表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)成功克隆了舞毒蛾LdOBP1和LdOBP2基因，qRT?PCR結(jié)果表明LdOBP1和LdOBP2基因在舞毒蛾各個(gè)組織中均有表達(dá)，其中在頭部和觸角中顯著高表達(dá)，高CO2濃度脅迫下，顯著抑制了LdOBP1和LdOBP2基因表達(dá)。綜上所述，舞毒蛾LdOBP1和LdOBP2基因表達(dá)變化可能會(huì)影響舞毒蛾的嗅覺信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而影響舞毒蛾的取食、種間交流、寄主選擇等行為，并以此來(lái)響應(yīng)CO2濃度變化，但具體的功能與行為學(xué)反應(yīng)有待進(jìn)一步研究，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果將為后續(xù)研究OBP1和OBP2蛋白的生理功能提供基礎(chǔ)，并有助于闡明舞毒蛾對(duì)氣候變化時(shí)的適應(yīng)機(jī)制。