韓效 屈玉明 郝重耀 張?zhí)焐?趙季宇 王紅陽(yáng)

甲狀腺功能減退(以下簡(jiǎn)稱“甲減”)是因多種原因致甲狀腺激素產(chǎn)生釋放障礙或生理效應(yīng)降低,引發(fā)機(jī)體全身性代謝降低的一種綜合證候[1]。各年齡段皆可見(jiàn),好發(fā)于女性群體,患病率為17.8%[2]。甲減對(duì)機(jī)體的負(fù)面影響涉及生長(zhǎng)發(fā)育、生活質(zhì)量、學(xué)習(xí)記憶等諸多方面,免疫內(nèi)環(huán)境紊亂是其不良鏈條的重要一環(huán)[3]。多項(xiàng)研究表明,甲狀腺自身抗體和炎癥因子介入了甲減的病程中并影響著甲狀腺功能活動(dòng)[4-7]。

艾灸作為傳統(tǒng)的中醫(yī)療法,能溫經(jīng)散寒、祛風(fēng)除濕、溫陽(yáng)益氣,適用于虛寒性疾病及久病體虛者。研究證明,艾灸可緩解甲減的癥狀,提升甲狀腺素血清濃度[8-9]。麥粒灸作為艾灸的一種,操作簡(jiǎn)單,病患痛苦小,易于推行。本實(shí)驗(yàn)采取丙硫氧嘧啶(propyl-thiouracil,PTU)灌胃的方法構(gòu)建甲狀腺功能減退大鼠模型[10],通過(guò)觀察麥粒灸對(duì)自身免疫應(yīng)答的影響,探討麥粒灸對(duì)甲減大鼠的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康4～6周齡SPF級(jí)SD大鼠30只(雌雄各半),體質(zhì)量160～180 g,購(gòu)自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司,許可證編號(hào):SCXK(京)2019-0010。實(shí)驗(yàn)已獲得山西省針灸研究所生物醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)的準(zhǔn)許(倫理科2020第003號(hào))。

1.2 藥品與試劑

PTU為50 mg/100片,上海朝暉藥業(yè)有限公司,批號(hào):2008N18;石蠟、甲醛,上海國(guó)藥集團(tuán),批號(hào):690189691,10010018;廣譜二抗、DAB濃縮型試劑盒,上海長(zhǎng)島生物技術(shù)有限公司,批號(hào):D-3004、FL-6001;蘇木素,BASO公司,批號(hào):714094;大鼠游離三碘甲狀腺原氨酸(free triiodothyronine,FT3)、游離甲狀腺素(free thyroxine,FT4)、促甲狀腺素(thyrotropin,TSH)試劑盒(貨號(hào):SU-B31011、SUB31010、SU-B30271);甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體(thyroid peroxidase antibody,TPOAb)、甲狀腺球蛋白抗體(anti-thyroglobulin antibodies,TGAb)試劑盒(貨號(hào):SU-B30541、SU-B30542);干擾素(interferonγ,IFN-γ)、白介素10(interleukin 10,IL-10)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β,TGF-β1)試劑盒,批號(hào):SU-B30194、SU-B31073、SU-B30173,均購(gòu)于WKSUBIO公司。

1.3 儀器與設(shè)備

正置顯微鏡,OLYMPUS公司,型號(hào):CX41;石蠟切片機(jī),徠克公司,型號(hào):SQ2125;攤片機(jī),徠克公司,型號(hào):PPTHK-21B;水浴鍋,Leica公司,型號(hào):HI1210;數(shù)碼相機(jī),NIKON公司,型號(hào):D5100;移液器(吉爾森P型移液器),PiPetman;酶標(biāo)儀,Rayto公司,型號(hào):RT-6100;恒溫烤箱,上海恒一公司。

1.4 分組、模型制備及干預(yù)

適應(yīng)性飼養(yǎng)7天后,依照隨機(jī)數(shù)字表法將30只SD大鼠平均分為空白組、模型組和麥粒灸組。將PTU研碎后配置成0.1%的PTU混懸液,灌胃劑量為1 mL/100 g[10]?？瞻捉M以生理鹽水灌胃,其余兩組予PTU灌胃,各組等量同時(shí)操作,每日一次,先連續(xù)灌胃4周。四周后,模型組和麥粒灸組繼續(xù)給予0.1%的PTU(因停藥后,大鼠甲狀腺功能狀態(tài)漸漸恢復(fù),所以治療期間仍以PTU維持甲減狀態(tài)),劑量為10 mg/1 kg;空白組按1mL/100 g予等劑量生理鹽水,隔日一次,各組再連續(xù)灌胃4周。每周稱重?fù)Q算以調(diào)整給藥劑量。

1.5 干預(yù)方法

把純艾絨用定制麥粒灸模具制成基底部2.5～3.0 mm,高度為4～5 mm的麥粒柱,于大鼠的大椎、命門、腎俞(雙)、脾俞(雙)處施灸,每個(gè)麥粒燃燒時(shí)間10～12秒,隔日一次,連續(xù)干預(yù)4周。取穴參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[11],并結(jié)合動(dòng)物比較學(xué)方法進(jìn)行。

1.6 標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測(cè)

1.6.1 實(shí)驗(yàn)前后測(cè)量大鼠體質(zhì)量 于適應(yīng)性期飼養(yǎng)后、造模期后、干預(yù)期后用電子天平稱重,記錄三組大鼠體質(zhì)量。

1.6.2 測(cè)量脾臟、胸腺質(zhì)量及臟器指數(shù) 依體質(zhì)量計(jì)算水合氯醛(0.3 mL/100 g)劑量麻醉大鼠,經(jīng)腹主動(dòng)脈取血于采血管,靜置30分鐘離心取上清液。將甲狀腺組織放入4%多聚甲醛固定液中;取脾臟、胸腺,用0.9%氯化鈉溶液清洗干凈,濾紙吸干后電子天平稱重,計(jì)算臟器指數(shù)(器官重量/體重)。

1.6.3 甲狀腺病理組織觀察 將甲狀腺于固定液中取出,各濃度乙醇逐級(jí)脫水,50%酒精+二甲苯透明,浸蠟包埋切片備HE染色,拍照采集切片標(biāo)本。

1.6.4 血清細(xì)胞因子表達(dá)測(cè)定 將血清樣品解凍后混勻,按照ELISA試劑盒操作步驟嚴(yán)格進(jìn)行,最后用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(optical density,OD),計(jì)算甲狀腺功能(FT3、FT4、TSH)、自身抗體(TPOAb、TGAb)以及炎癥因子(IFN-γ、TGFβ1、IL-10)濃度。

1.6.5 免疫組化染色組織 將甲狀腺切片組織脫蠟水化,于檸檬酸鈉中高壓修復(fù)后洗滌,加H2O2濕盒孵育后繼續(xù)洗滌;加非免疫、正常羊血清封閉非特異性抗原,濕盒孵育后PBS洗凈,滴加一抗孵育過(guò)夜。取出后室溫放置40分鐘,PBS洗滌后加HRP標(biāo)記二抗(兔抗)孵育,DAB染色,自來(lái)水沖洗,蘇木精復(fù)染,酒精分化脫水,二甲苯透明后中性樹(shù)膠封片,拍照采集分析,計(jì)算炎癥因子的平均光密度值(average optical density,AOD)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)結(jié)果運(yùn)用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果為計(jì)量資料,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。所有計(jì)量數(shù)據(jù)檢驗(yàn)后均符合正態(tài)性分布,經(jīng)方差齊性檢驗(yàn),如方差齊,各組間比較選擇單因素方差(One-way ANOVA)分析;若方差不齊,則各組間比較選用韋爾奇(Welch)或布朗(Brown)檢驗(yàn);組間兩兩比較采取t檢驗(yàn),以P＜0.05認(rèn)為存在統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果

2.1 麥粒灸對(duì)甲減大鼠體質(zhì)量的影響

三組大鼠在實(shí)驗(yàn)前的體質(zhì)量沒(méi)有明顯差異(P＞0.05);造模后,模型組和麥粒灸組大鼠較空白組體質(zhì)量有大幅下降(P＜0.05)。觀察大鼠行為發(fā)現(xiàn),模型組和麥粒灸組大鼠出現(xiàn)活動(dòng)遲緩、畏寒蜷臥、喜聚堆、皮肉松懈、體毛枯疏無(wú)光等狀況;麥粒灸干預(yù)后,該組體質(zhì)量較模型組上升(P＜0.05),大鼠體毛逐漸光亮、活動(dòng)頻繁,雖仍低于空白組大鼠,但與其差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組甲狀腺功能減退大鼠實(shí)驗(yàn)前后體質(zhì)量變化比較(±s,g)

表1 各組甲狀腺功能減退大鼠實(shí)驗(yàn)前后體質(zhì)量變化比較(±s,g)

注:與空白組同一時(shí)間相比,a P＜0.05;與模型組干預(yù)后相比,b P＜0.05。

組別 鼠只 體質(zhì)量空白組10 實(shí)驗(yàn)前 204.53±8.59 造模后 285.28±11.12 干預(yù)后 322.93±37.13模型組 10 實(shí)驗(yàn)前 200.07±8.39 造模后 228.72±26.61a 干預(yù)后 227.30±30.26a麥粒灸組 10 實(shí)驗(yàn)前 200.40±6.84 造模后 221.23±20.26a 干預(yù)后 284.60±32.25 b

2.2 麥粒灸對(duì)甲減大鼠脾和胸腺的影響

脾臟和胸腺在較大意義上代表了機(jī)體免疫功能狀態(tài)。與空白組相比,模型組和麥粒灸組的脾質(zhì)量、脾指數(shù)、胸腺質(zhì)量降低(P＜0.05),兩組的胸腺指數(shù)較空白組有下降趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);與模型組相比,麥粒灸組臟器質(zhì)量及指數(shù)無(wú)顯著差異(P＞0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組甲狀腺功能減退大鼠脾、胸腺質(zhì)量及臟器指數(shù)比較(±s)

表2 各組甲狀腺功能減退大鼠脾、胸腺質(zhì)量及臟器指數(shù)比較(±s)

注:與空白組相比,a P＜0.05。

脾組別 鼠只質(zhì)量(g) 指數(shù)(0.01g/g)胸腺質(zhì)量(g) 指數(shù)(0.01 g/g)10 0.56±0.11 0.19±0.04 0.46±0.16 0.14±0.04模型組 10 0.33±0.03a 0.14±0.02a 0.26±0.05a 0.10±0.02麥粒灸組 10 0.38±0.08a 0.13±0.03a 0.28±0.12a空白組0.11±0.04

2.3 麥粒灸對(duì)甲減大鼠病理組織的影響

HE染色鏡下見(jiàn)空白組濾泡較大,呈卵圓形較且均勻分布,腔內(nèi)充滿淡粉色膠樣物質(zhì);濾泡為圓核的單層柱狀上皮細(xì)胞。與空白組比,模型組則濾泡腔內(nèi)膠樣物減少,濾泡形態(tài)各異,散亂排列,增生較多,細(xì)胞較肥大。與模型組比較,麥粒灸組濾泡腔內(nèi)膠狀物增多且分布較均勻,濾泡大小較為一致,結(jié)構(gòu)較清晰。見(jiàn)圖1。

圖1 各組甲狀腺功能減退大鼠甲狀腺組織病理學(xué)觀察(HE,×200)

2.4 麥粒灸對(duì)甲減大鼠血清甲狀腺功能的影響

模型組的FT3、FT4濃度較空白組有較大程度下降,TSH濃度有大幅度的升高,均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);與模型組比較,麥粒灸組TSH濃度較大程度下降(P＜0.05),血清FT3、FT4濃度上升(P＜0.05);與空白組比較,TSH濃度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),FT3、FT4濃度顯著下降(P＜0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組甲狀腺功能減退大鼠血清中甲狀腺功能水平比較(10只,±s)

表3 各組甲狀腺功能減退大鼠血清中甲狀腺功能水平比較(10只,±s)

注:與空白組相比,a P＜0.05;與模型組相比,b P＜0.05。

組別 FT3(pmol/L)FT4(pmol/L)TSH(mU/L)6.42±0.35 16.40±1.20 7.81±0.91模型組 3.37±0.56 a 6.20±0.81 a 19.10±0.85 a麥粒灸組 4.19±0.34 ab 12.94±0.81 ab 10.31±3.09空白組b

2.5 麥粒灸對(duì)甲減大鼠甲狀腺自身抗體的影響

作為反映甲減免疫狀態(tài)紊亂的顯著指征,模型組大鼠TPOAb與TGAb含量遠(yuǎn)大于空白組(P＜0.05);雖然麥粒灸組血清TPOAb含量稍有降低趨勢(shì),但其差異與模型組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);TGAb水平較模型組顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組甲狀腺功能減退大鼠血清中TPOAb和TGAb含量變化(±s)

表4 各組甲狀腺功能減退大鼠血清中TPOAb和TGAb含量變化(±s)

注:與空白組相比,a P＜0.05;與模型組相比,b P＜0.05。

組別 鼠只 TPOAb(U/mL) TGAb(IU/mL)10 7.44±1.70 35.45±6.55模型組 10 13.65±1.40 a 90.40±10.25 a麥粒灸組 10 12.99±1.37 a 72.23±13.22空白組b

2.6 麥粒灸對(duì)甲減大鼠血清細(xì)胞因子表達(dá)的影響

與空白組相比,模型組IFN-γ及轉(zhuǎn)換因子濃度明顯升高(P＜0.05),血清IL-10濃度顯著下降(P＜0.05);麥粒灸組血清IFN-γ、TGF-β1含量較模型組有所下降(P＜0.05),血清IL-10含量有所上升(P＜0.05)。對(duì)比空白組,麥粒灸組血清IFN-γ、TGF-β1濃度水平較高(P＜0.05),IL-10血清濃度水平較低(P＜0.05)。見(jiàn)表5。

表5 各組甲狀腺功能減退大鼠血清中免疫因子表達(dá)程度比較(10只,±s)

表5 各組甲狀腺功能減退大鼠血清中免疫因子表達(dá)程度比較(10只,±s)

注:與空白組相比,a P＜0.05;與模型組相比,b P＜0.05。

組別 IFN-γ(pg/mL)TGF-β1(ng/mL)IL-10(pg/mL)517.99±160.62 41.44±8.60 50.02±5.15模型組 1623.92±201.47 a 86.15±8.24a 27.20±8.76a麥粒灸組 1218.95±220.10 ab 75.53±3.32ab 38.87±5.62空白組ab

2.7 麥粒灸對(duì)甲減大鼠組織因子AOD值的影響

模型組IFN-γ的AOD高于空白組(P＞0.05),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其TGF-β1的AOD值與空白組差異比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),IL-10的AOD值顯著低于空白組(P＜0.05)。與模型組相比,麥粒灸組IFN-γ、IL-10的AOD值顯著低于模型組(P＜0.05),TGF-β1的AOD值與模型組的差異比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。如表6。

表6 各組甲狀腺功能減退大鼠甲狀腺中免疫因子的AOD值變化(10只,±s)

表6 各組甲狀腺功能減退大鼠甲狀腺中免疫因子的AOD值變化(10只,±s)

注:與空白組相比,a P＜0.05;與模型組相比,b P＜0.05。

組別 IFN-γ IL-10 TGF-β 1 0.234±0.032 0.308±0.007 0.346±0.003模型組 0.269±0.008 0.278±0.014a 0.311±0.009麥粒灸組 0.208±0.020b 0.241±0.001ab 0.291±0.021空白組a

免疫組化結(jié)果顯示:大鼠甲狀腺組織中IL-10、IFN-γ和TGF-β1陽(yáng)性顆粒體主要表現(xiàn)為棕黃色,存在于甲狀腺濾泡細(xì)胞的胞漿中。三種免疫因子在甲狀腺組織中表達(dá)差異性較大。空白組IL-10和TGF-β1陽(yáng)性顆粒體染色深,表達(dá)多,范圍廣;而IFNγ陽(yáng)性顆粒體則染色較淺,表達(dá)較少,范圍較小。模型組甲狀腺上皮細(xì)胞IFN-γ陽(yáng)性顆粒體染色更深,表達(dá)更多,范圍更大;但是其IL-10、TGF-β1陽(yáng)性顆粒體染色較淺,表達(dá)更少,范圍更小。麥粒灸組甲狀腺上皮細(xì)胞IFN-γ、TGF-β1及IL-10陽(yáng)性顆粒體均染色更淺,表達(dá)更少,范圍更局限。如圖2～4所示。

圖2 各組甲狀腺功能減退大鼠甲狀腺組織中IFN-γ的IHC表達(dá)狀況(DAB×200)

圖3 各組甲狀腺功能減退大鼠甲狀腺組織中TGF-β1的IHC表達(dá)狀況(DAB×200)

圖4 各組甲狀腺功能減退大鼠甲狀腺組織中IL-10的IHC表達(dá)狀況(DAB×200)

3 討論

現(xiàn)代研究表明,麥粒灸作為直接灸穴的理療方法,對(duì)多種慢性炎癥疾病的免疫功能有著良性調(diào)節(jié)作用[12-13]。它的治療原理主要是利用艾柱燃盡時(shí)那種短暫、快速、強(qiáng)烈的燒灼皮膚的持續(xù)性局部炎癥反應(yīng),“以火促通”,促進(jìn)機(jī)體發(fā)生良性的免疫反應(yīng)[14]。甲狀腺功能減退作為一種免疫微環(huán)境紊亂的慢性病[15],麥粒灸干預(yù)甲減疾病的免疫應(yīng)答的實(shí)驗(yàn)研究較少。

細(xì)胞免疫因子的表達(dá)與甲狀腺功能的表達(dá)息息相關(guān),同時(shí)參與了甲狀腺疾病的病理變化[16]。免疫因子的異常表達(dá)不僅造成了甲狀腺素的分泌和作用失常,而且也引起了生物體的免疫內(nèi)環(huán)境失調(diào)[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),麥粒灸能夠提高血清FT3、FT4的水平(P＜0.05),降低TGAb的含量(P＜0.05),證明麥粒灸對(duì)甲狀腺有一定的保護(hù)作用,展示了艾灸調(diào)節(jié)免疫失衡的優(yōu)勢(shì)。為深入研究艾灸對(duì)甲減生物體的保護(hù)作用,因而觀察麥粒灸對(duì)T細(xì)胞和B細(xì)胞因子的作用。

研究發(fā)現(xiàn),甲狀腺功能減退患者TPOAb、TGAb及 細(xì) 胞 因 子IL-10、IFN-γ、TGF-β1異 常 表 達(dá)。TPOAb、TGAb經(jīng)B細(xì)胞產(chǎn)生,介導(dǎo)體液免疫,主要以IgG1、IgG2及IgG4構(gòu)成,通過(guò)抗體依賴性的細(xì)胞毒作用,破壞甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞[18],損傷甲狀腺組織。IFN-γ主要由Th1細(xì)胞分泌,能夠讓CD8+T細(xì)胞對(duì)甲狀腺細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng);也可以活化并增殖甲狀腺組織內(nèi)的T細(xì)胞,擴(kuò)大免疫反應(yīng);IFN-γ表達(dá)增多可以抑制鈉碘轉(zhuǎn)運(yùn)體,降低攝碘率[19]。Treg細(xì)胞釋放的TGF-β1,能干預(yù)淋巴細(xì)胞的增殖,保證免疫內(nèi)環(huán)境有序循環(huán)。IL-10是一種免疫抗炎因子,能夠抵抗T細(xì)胞激活[20],拮抗Th1促炎因子的表達(dá)。有研究就證明,亞臨床甲減病與IL-10、TGF-β1異常表達(dá)密切相關(guān)[20]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與空白組相比,模型組TPOAb、TGAb滴度升高,血清IFN-γ和TGF-β1表達(dá)增強(qiáng),IL-10表達(dá)減弱,其可能借由促進(jìn)T細(xì)胞和B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答在甲減病程中發(fā)揮作用。麥粒灸干預(yù)后,TGAb滴度下降,IFN-γ和TGF-β1表達(dá)減弱,IL-10表達(dá)增強(qiáng)。

免疫組化結(jié)果表明,甲狀腺組織中存在輕微的免疫紊亂現(xiàn)象,其具體原因有待進(jìn)一步研究研究。

由此表明麥粒灸可能主要通過(guò)良性調(diào)節(jié)血清中細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答發(fā)揮作用。