叢筠格，梁 杉，張 敏,

（1.北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類(lèi)健康高精尖創(chuàng)新中心，北京工商大學(xué)，北京 100048；2.北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院，北京 100048）

德州扒雞作為我國(guó)傳統(tǒng)醬鹵肉制品，因風(fēng)味獨(dú)特受到消費(fèi)者的喜愛(ài)。但醬鹵肉制品在生產(chǎn)、加工和儲(chǔ)運(yùn)過(guò)程中，極可能被操作人員、加工設(shè)備和原料本身等所攜帶的細(xì)菌污染，在合適的環(huán)境條件下易腐敗變質(zhì)。目前德州扒雞主要通過(guò)包裝前高溫滅菌處理或直接氣調(diào)包裝來(lái)延長(zhǎng)貨架期，但高溫滅菌會(huì)影響產(chǎn)品口感和品質(zhì)。氣調(diào)包裝是采用良好阻隔性包裝材料并將食品周?chē)鷼怏w進(jìn)行更換或剔除的一種保藏方式，氣調(diào)包裝未經(jīng)高溫滅菌的德州扒雞銷(xiāo)售半徑小，銷(xiāo)售量易受到季節(jié)限制，已成為限制德州扒雞產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。

研究德州扒雞腐敗菌相組成，有助于解決德州扒雞乃至整個(gè)醬鹵肉制品的貨架期問(wèn)題。隨著科技的發(fā)展，食品中腐敗微生物的研究方法逐漸增多，高通量測(cè)序作為新一代測(cè)序技術(shù)，具有信息量大、效率高的優(yōu)點(diǎn)，能夠更加準(zhǔn)確、全面反映樣本的微生物群落結(jié)構(gòu)，但也存在難以確定具體菌種且無(wú)法區(qū)分細(xì)菌死活的缺點(diǎn)。傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)可培養(yǎng)的條件有限，分析結(jié)果不能完全反映樣品中微生物群落情況，但分離出的菌體純度較高，可以驗(yàn)證高通量測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此在微生物研究中仍占有重要地位。將兩種技術(shù)同時(shí)應(yīng)用于菌相的研究，提高了檢驗(yàn)通量和準(zhǔn)確性。曹榮等將傳統(tǒng)培養(yǎng)和高通量測(cè)序技術(shù)相結(jié)合研究牡蠣菌群結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)兩種方法得到的結(jié)果一致。但目前將這兩種方法同時(shí)應(yīng)用在醬鹵肉制品上的研究較少，且國(guó)內(nèi)對(duì)于氣調(diào)包裝醬鹵肉制品的研究處于初級(jí)階段，對(duì)其致腐微生物菌群結(jié)構(gòu)分析較少。

添加抑菌劑是抑制食品中腐敗菌生長(zhǎng)的常用方法。近年來(lái)，天然抑菌劑對(duì)醬鹵肉制品中腐敗菌的抑制作用研究逐漸增多，乳酸鏈球菌素（Nisin）用作為抑菌劑不會(huì)對(duì)食品的感觀產(chǎn)生不良影響，因此在肉制品加工中有著廣泛的應(yīng)用。-聚賴(lài)氨酸（-poly-Llysine，-PL）復(fù)配抑菌劑用于肉制品的防腐保鮮，有提升保質(zhì)期和口感的雙重優(yōu)勢(shì)。茶多酚（tea polyphenols，TP）和溶菌酶（lysozyme，LZ）作為安全性較高的抑菌劑，在抑制肉制品細(xì)菌生長(zhǎng)、維持肉制品品質(zhì)等方面具有顯著效果。李德紅對(duì)氣調(diào)包裝醬鴨食管分離出的優(yōu)勢(shì)腐敗菌進(jìn)行抑菌研究，結(jié)果表明抑菌劑的最佳配方為-PL 0.05 g/kg、Nisin 0.2 g/kg、TP 0.12 g/kg；徐靜等研究表明0.05% LZ、0.1%雙乙酸鈉、0.05% Nisin、3%乳酸鈉的復(fù)合保鮮劑對(duì)紅燒牛肉中微生物可以起到有效抑制作用。但由于貯藏條件及產(chǎn)品本身特性等原因，導(dǎo)致不同產(chǎn)品腐敗的腐敗菌也具有差異，目前針對(duì)低溫貯藏條件下充氮包裝德州扒雞特定腐敗菌的抑菌研究鮮有報(bào)道。

本研究將充氮包裝的雞肉在低溫（4 ℃）條件下貯藏，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)研究低溫貯藏條件下菌群結(jié)構(gòu)變化，并通過(guò)傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)對(duì)腐敗末期優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行鑒定。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道有針對(duì)性地選擇-PL、Nisin、TP、LZ 等天然抑菌劑，以單一抑菌效果為指標(biāo)篩選出兩種抑菌效果較好的抑菌劑，評(píng)價(jià)它們對(duì)各腐敗菌的MIC，旨在為延長(zhǎng)德州扒雞的貨架期和控制產(chǎn)品質(zhì)量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

德州扒雞 山東德州扒雞股份有限公司；PCA培養(yǎng)基、LB 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；PBS 緩沖液 北京索萊寶科技有限公司；-PL、Nisin 純度99%，浙江新銀象生物工程有限公司；TP 純度98%，安徽紅星藥業(yè)股份有限公司；LZ 活性2000 U/mg，南寧龐博生物工程有限公司。

BC/BD-232HD 電冰柜 青島海爾特種電冰柜有限公司；GR85DF 高壓蒸汽滅菌鍋 美國(guó)致微公司；BCL-1360 超凈工作臺(tái) 北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司；THZ-82A 水浴恒溫?fù)u床 上海江星儀器有限公司；DHP-9162 恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；OLYMPUS BX53 生物顯微鏡 北京東方奧舟科技發(fā)展有限公司；F200 PRO 酶標(biāo)儀 瑞士TECAN 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 德州扒雞貯藏條件及腐敗時(shí)間點(diǎn)的確定 通過(guò)文獻(xiàn)查閱可知，氣調(diào)包裝醬鹵肉制品通常貨架期在11 d 左右，本實(shí)驗(yàn)所取德州扒雞均為當(dāng)天產(chǎn)品（從生產(chǎn)線取出到取樣不超過(guò)3 h）。取樣后立即進(jìn)行菌落總數(shù)測(cè)定，剩下樣品于4 ℃電冰柜中貯藏。每隔2 d 進(jìn)行一次取樣，菌落總數(shù)測(cè)定方法參照GB 4789.2-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》，以超過(guò)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的菌落總數(shù)時(shí)間點(diǎn)作為腐敗末期時(shí)間點(diǎn)。

1.2.2 德州扒雞貯藏期間樣本高通量測(cè)序分析 在低溫4 ℃下貯藏，于貯藏0、2、4、6、8、10、12、14、16 d 取樣進(jìn)行高通量測(cè)序。將雞肉樣本送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，委托其基于Illumina MiSeq 技術(shù)測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.2.3 德州扒雞腐敗末期微生物傳統(tǒng)培養(yǎng)

1.2.3.1 腐敗微生物的分離及純化 選取腐敗末期（16 d）的德州扒雞進(jìn)行菌株鑒定。選擇30～300 CFU的PCA 平板，然后選擇平板上形態(tài)不同的典型菌落，反復(fù)平板劃線分離，最終得到純化的單菌落，再將菌株保存于斜面上。

1.2.3.2 腐敗微生物的鑒定 對(duì)優(yōu)勢(shì)腐敗菌進(jìn)行初步的菌落形態(tài)觀察，包括菌落的顏色、形狀、質(zhì)地、光澤、隆起狀況、粘稠度、透明度等。通過(guò)革蘭氏染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌體個(gè)體形態(tài)和排列狀況等。

將保存的菌株送往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/上BLAST 上進(jìn)行查詢(xún)，相似度超99%即為同一菌屬，用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.4 天然抑菌劑對(duì)優(yōu)勢(shì)腐敗菌抑菌效價(jià)的評(píng)定

1.2.4.1 菌懸液的制備 在盧小菊等的方法上加以修改，把1.2.3 得到的優(yōu)勢(shì)腐敗菌接種于LB 肉湯培養(yǎng)基，對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，使用時(shí)用無(wú)菌生理鹽水制成10～10CFU/mL 菌懸液。

1.2.4.2 單一防腐劑抑菌效果測(cè)定 在宋萌等方法上加以改進(jìn)，制備不同濃度的單一防腐劑：參照GB 2760-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》食品添加劑最大允許使用范圍，分別制備含不同濃度的ε-PL（250、150、 100、60、30、15、0 μg/mL）、Nisin（500、 250、150、 100、 60、 30、 15、 0 μg/mL）、TP（500、250、150、 100、60、30、15、0 μg/mL）、LZ（500、250、150、100、60、30、15、0 μg/mL）的LB 培養(yǎng)基，向每組培養(yǎng)基中接入腐敗微生物后，在37 °C，180 r/min 條件下培養(yǎng)12 h，分別測(cè)定OD，同時(shí)設(shè)置未添加防腐劑的空白對(duì)照組。

1.2.4.3 最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）的測(cè)定 在姚永杰等方法上稍加修改，采用微量二倍稀釋法測(cè)定MIC 和MBC 值。稱(chēng)取一定量抑菌劑制成含有-PL、Nisin、TP、LZ 濃度分別為16000 μg/mL 的LB 培養(yǎng)基。在96 孔板中加入100 μL LB 培養(yǎng)基。在第一個(gè)孔中加入100 μL 抑菌劑溶液混勻，吸取100 μL 轉(zhuǎn)移到頂行的下一個(gè)孔，依此類(lèi)推進(jìn)行倍比稀釋至最后一列，混勻后棄掉100 μL。設(shè)置無(wú)菌組作陰性對(duì)照組，加細(xì)菌菌懸液組作陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)孔中約有5×10CFU/mL 的供試菌。然后將裝有細(xì)菌的微孔板放入37 °C 培養(yǎng)箱中靜置培24 h。菌液清澈透明，無(wú)沉淀、絮狀懸浮物或菌膜產(chǎn)生時(shí)抑菌劑的最低含量記為MIC。

在無(wú)菌條件下，從MIC 和大于MIC 濃度的孔中取出100 μL 培養(yǎng)液涂于PCA 平板，37 °C 培養(yǎng)24 h 后觀察菌落生長(zhǎng)情況，沒(méi)有菌落生長(zhǎng)的最低的濃度為該抑菌劑的MBC。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，高通量測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果利用生信云平臺(tái)（https://cloud.majorbio.com/）進(jìn)行分析處理，采用Origin 軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐敗時(shí)間點(diǎn)的確定

德州扒雞4 ℃貯藏過(guò)程中的菌落總數(shù)變化如圖1 所示，從圖中可以看出德州扒雞的初始菌落數(shù)在2.4 lg（CFU/g）。0～12 d 菌落總數(shù)增長(zhǎng)緩慢，主要是由于無(wú)氧的環(huán)境及較低的溫度抑制了產(chǎn)品中殘存的微生物快速繁殖，此時(shí)微生物需要一定的時(shí)間即遲滯期以適應(yīng)新環(huán)境，12～14 d 菌落總數(shù)急劇增長(zhǎng)，這主要是由于微生物在適應(yīng)了較低的溫度后開(kāi)始快速生長(zhǎng)繁殖，第12 d 時(shí)菌落總數(shù)達(dá)到5.1 lg（CFU/g），已經(jīng)超過(guò)了GB 2726-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 熟肉制品》中醬鹵肉制品菌落總數(shù)不得超過(guò)5.0 lg（CFU/g）的標(biāo)準(zhǔn)，所以12 d 為德州扒雞4 ℃貯藏條件下的腐敗時(shí)間點(diǎn)。在第14～16 d 菌落總數(shù)變化較為平穩(wěn)，是由于微生物繁殖到一定密度后，會(huì)出現(xiàn)微生物之間的相互拮抗作用。

圖1 德州扒雞4 ℃貯藏過(guò)程中的菌落總數(shù)變化Fig.1 Changes of total bacterial count of Dezhou-braised chicken during storage at 4 ℃

2.2 高通量測(cè)序結(jié)果分析

2.2.1 德州扒雞貯藏期間微生物群落的多樣性分析多樣性分析可以反映樣品中微生物的多樣性，主要包括Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)、Ace 指數(shù)、Chao 指數(shù)和Coverage 指數(shù)等多種指數(shù)，其中Ace指數(shù)和Chao 指數(shù)反映群落的豐富度，Simpson 指數(shù)和Shannon 指數(shù)反映群落的多樣性，Coverage 指數(shù)反映群落的覆蓋度。本研究對(duì)不同貯藏時(shí)間的德州扒雞樣品進(jìn)行高通量測(cè)序，通過(guò)最小樣本數(shù)進(jìn)行抽平，根據(jù)97%的相似度進(jìn)行聚類(lèi)。結(jié)果如表1 所示，研究結(jié)果表明，Shannon 指數(shù)隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低，Simpson 指數(shù)呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，說(shuō)明樣品貯藏初期菌群多樣性較高，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，菌群多樣性逐漸降低，群落物種均勻度逐漸下降。Ace 指數(shù)和Chao 指數(shù)在貯藏前期呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化，貯藏中后期降低趨勢(shì)較為明顯，說(shuō)明德州扒雞細(xì)菌菌群豐富度前期隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)不斷變化，可能由于初期菌群未適應(yīng)環(huán)境變化，貯藏后期豐富度逐漸降低，此時(shí)出現(xiàn)優(yōu)勢(shì)菌屬。

稀疏曲線可以反映樣品的取樣深度（圖2），隨著測(cè)序深度的增加，各樣本的稀釋度逐漸趨于平緩，表明送測(cè)樣本能夠充分反映其微生物多樣性情況。結(jié)合不同貯藏時(shí)間樣本的測(cè)序深度指數(shù)Coverage 指數(shù)（見(jiàn)表1）均大于99%，表明送測(cè)樣本的測(cè)序結(jié)果可以反映實(shí)際貯藏情況。

圖2 不同貯藏時(shí)間德州扒雞樣品細(xì)菌群落的Sobs 曲線（a）和Shannon 曲線（b）Fig.2 Sobs curve (a) and Shannon curve (b) of bacterial community of Dezhou-braised chicken samples at different storage times

表1 德州扒雞貯藏過(guò)程中細(xì)菌群落的多樣性分析Table 1 Diversity analysis of bacterial community in Dezhou-braised chicken during storage

2.2.2 德州扒雞貯藏期間群落組成分析 如圖3 所示，在貯藏前期（0～4 d），細(xì)菌種類(lèi)復(fù)雜多樣，且各細(xì)菌所占比例均不高。嗜冷桿菌屬（sp）在整個(gè)貯藏過(guò)程中都占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，在0～10 d 貯藏期間數(shù)量逐漸增加，在腐敗末期（12 d）其數(shù)量相對(duì)10 d 減少了0.69%，但其相對(duì)豐度達(dá)仍到76.97%，在貯藏后期（12～16 d），其數(shù)量呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。假交替單胞菌屬（sp）在達(dá)到腐敗末期前比例相對(duì)很低，但到了貯藏后期占比突然升高，在貯藏末期（16 d）相對(duì)豐度達(dá)到51.00%，與sp同時(shí)成為優(yōu)勢(shì)菌屬，似乎表明貯藏后期的條件更有利于其生長(zhǎng)。而sp在貯藏后期可能受到了sp的競(jìng)爭(zhēng)。在腐敗末期時(shí)，假單胞菌（sp）相對(duì)豐度達(dá)到7.34%，肉食桿菌（sp.）相對(duì)豐度為4.35%，大球菌（sp）相對(duì)豐度為2.59%，氣球菌（sp）相對(duì)豐度為1.45%。

圖3 德州扒雞貯藏過(guò)程中細(xì)菌群落在屬水平的分布情況Fig.3 Distribution of bacterial community at genus level of Dezhou-braised chicken during storage

Gram 等報(bào)道，在貯藏過(guò)程中，食品中的微生物在初期種類(lèi)多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，最終一種或幾種微生物會(huì)在與其他細(xì)菌競(jìng)爭(zhēng)過(guò)程中處于優(yōu)勢(shì)地位，或產(chǎn)生抑制其他微生物生長(zhǎng)的代謝產(chǎn)物，抑制其他微生物的生長(zhǎng)而成為優(yōu)勢(shì)菌群,與此研究結(jié)果相符。

2.3 傳統(tǒng)培養(yǎng)分析結(jié)果

高通量測(cè)序分析結(jié)果可知，sp是德州扒雞腐敗過(guò)程的優(yōu)勢(shì)菌屬。通過(guò)傳統(tǒng)培養(yǎng)進(jìn)行腐敗末期優(yōu)勢(shì)菌的分離鑒定，共得到七株代表性顯著的菌株，分別編號(hào)為B1～B7，其菌落形態(tài)如圖4 所示。通過(guò)革蘭氏染色判定菌株B1、B2、B6、B7 為革蘭氏陽(yáng)性菌，菌株B3、B4、B5 為革蘭氏陰性菌。

圖4 德州扒雞優(yōu)勢(shì)腐敗菌的培養(yǎng)特征和細(xì)胞形態(tài)（100×）Fig.4 Culture characteristics and cell morphology of dominant spoilage bacteria in Dezhou-braised chicken (100×)

將純化培養(yǎng)的菌株進(jìn)行測(cè)序，所得序列結(jié)果用Blast 進(jìn)行比對(duì)，選取同源性最高的序列，利用MEGA7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果如圖5 所示，菌株B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7 分別與廣布肉桿菌（）、水域微小桿菌（）、血嗜冷桿菌（）、變形斑沙雷氏菌（）、隆德假單胞菌（）、溶酪大球菌（）、綠色氣球菌（）的相關(guān)序列相似度達(dá)到99%以上。

圖5 基于16S rRNA 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence

綜上所述，通過(guò)分離鑒定，結(jié)合菌落形態(tài)特征可知，氣調(diào)包裝德州扒雞在4 ℃貯藏條件下優(yōu)勢(shì)腐敗細(xì)菌主要為廣布肉桿菌（）、水域微小桿菌（）、血嗜冷桿菌（）、變形斑沙雷氏菌（）、隆德假單胞菌（）、溶酪大球菌（）、綠色氣球菌（）。對(duì)比圖3 可知，五種分離得到的腐敗菌均屬于腐敗末期高通量測(cè)序結(jié)果中的菌屬，對(duì)比高通量測(cè)序結(jié)果可知微小桿菌（sp.）和沙雷氏菌（sp）在腐敗末期相對(duì)豐度僅為0.04%和0.06%，可能因?yàn)樗急壤^(guò)少圖中未顯示。

2.4 天然抑菌劑抑菌價(jià)效的評(píng)定

2.4.1 單一抑菌劑抑菌效力 選用-PL、Nisin、TP、LZ 四種常見(jiàn)的天然抑菌劑對(duì)德州扒雞分離出的七種腐敗菌進(jìn)行抑菌能力測(cè)定，結(jié)果如圖6 所示。

圖6 不同天然抑菌劑對(duì)腐敗細(xì)菌的抑制效果Fig.6 Inhibitory effects of different natural antimicrobial agents on spoilage bacteria

-PL 和TP 是廣譜抑菌劑，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌都具有較好的抑菌效果，從圖6（a）可以看出，隨著-PL 濃度的增加，腐敗細(xì)菌的OD值下降趨勢(shì)明顯，表明在國(guó)標(biāo)范圍（0～250 μg/mL）內(nèi)，-PL 能有效抑制腐敗細(xì)菌的生長(zhǎng)。當(dāng)-PL 濃度為250 μg/mL，腐敗細(xì)菌OD接近0，所有細(xì)菌的生長(zhǎng)被完全抑制，其抑菌效果顯著。從圖6（d）可以看出，當(dāng)TP 濃度達(dá)到250 μg/mL 時(shí)，僅能抑制、、的生長(zhǎng)，當(dāng)濃度達(dá)到國(guó)家規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)500 μg/mL 時(shí)，仍未能抑制的生長(zhǎng)，相較-PL 抑菌效果較差。

從圖6（b）可以看出，當(dāng)Nisin 濃度為60 μg/mL時(shí)，可以抑制除兩種腐敗菌外所有細(xì)菌的生長(zhǎng)，對(duì)其他五種細(xì)菌的抑菌效果優(yōu)于-PL。從圖6（c）可以看出，當(dāng)LZ 濃度達(dá)到500 μg/mL，僅能抑制兩種腐敗菌的生長(zhǎng)，此濃度已達(dá)到國(guó)家規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)上限，說(shuō)明其抑菌效果與Nisin 相比較差。前人的研究中，生物抑菌劑Nisin 和LZ 對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌大多比革蘭氏陰性菌具有更好的抑菌作用，但李偉麗等從腐敗醋酸中分離出13 種細(xì)菌，其中包含革蘭氏陰性菌耐酸乳酸菌，用Nisin 分別對(duì)分離出的菌株進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示Nisin 對(duì)耐酸乳酸菌也表現(xiàn)為強(qiáng)烈殺菌效果。在本實(shí)驗(yàn)中，Nisin 對(duì)革蘭氏陰性菌也具有較好的抑菌效果，與李偉麗等研究結(jié)果相似。這可能與受試菌本身的特性有關(guān)，其抑菌機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

由于為德州扒雞腐敗末期的優(yōu)勢(shì)腐敗菌，四種天然抑菌劑對(duì)該菌株的抑菌效果比較可知：Nisin＞-PL＞LZ＞TP，但由于Nisin 對(duì)兩種腐敗菌抑菌效果較差，故選用-PL 和Nisin 兩種天然抑菌劑進(jìn)行下面的抑菌試驗(yàn)。

2.4.2 最小抑菌、殺菌濃度的測(cè)定 采用微量二倍稀釋法測(cè)定-PL 和Nisin 兩種抑菌劑對(duì)分離出的七株腐敗菌MIC 及MBC 值，結(jié)果如表2 所示，-PL對(duì)供試菌株的MIC 為15.63～250 μg/mL，在國(guó)標(biāo)范圍內(nèi)能夠有效抑制腐敗菌的生長(zhǎng)，Nisin 對(duì)七株供試菌的抑制效果由強(qiáng)到弱依次為：B7＞B2＞B6＞B1=B3＞B4=B5，對(duì)德州扒雞優(yōu)勢(shì)腐敗菌的抑菌效果顯著。

表2 兩種天然抑菌劑的MIC、MBCTable 2 MIC and MBC of two natural bacteriostatic agents

3 討論與結(jié)論

氣調(diào)包裝醬鹵肉制品的二次污染環(huán)節(jié)較多，導(dǎo)致產(chǎn)品中初始污染微生物種類(lèi)和數(shù)量各不相同，對(duì)醬鹵肉制品的質(zhì)量安全產(chǎn)生重要影響。本文采取高通量測(cè)序技術(shù)，研究整個(gè)貯藏過(guò)程中菌落結(jié)構(gòu)變化，發(fā)現(xiàn)sp為德州扒雞4 ℃貯藏過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌屬。sp耐鹽、滲透耐壓性強(qiáng)，且低溫酶使其可適應(yīng)寒冷環(huán)境，因此在本產(chǎn)品中具有一定的致腐作用。葉可萍等運(yùn)用傳統(tǒng)細(xì)菌平板培養(yǎng)對(duì)氣調(diào)包裝醬鹵鴨翅15 ℃貯藏過(guò)程中菌群結(jié)構(gòu)分析表明sp為產(chǎn)品貯藏末期的優(yōu)勢(shì)菌。劉均等研究不同包裝方式對(duì)貨架期冷鮮雞微生物菌相變化的影響，研究表明占比量最高，與本研究結(jié)果一致。本文結(jié)合傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)，分離出德州扒雞貯藏末期七種腐敗菌。其中sp.sp.sp.等都是氣調(diào)包裝鮮肉中的常見(jiàn)菌。賴(lài)宏剛研究表明醬鹵制品36 ℃貯藏條件下腐敗末期優(yōu)勢(shì)菌以假單胞菌和乳酸菌為主。與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果差異較大，可能是由于不同貯藏溫度導(dǎo)致樣品腐敗的優(yōu)勢(shì)腐敗菌不同。嗜冷菌一般是在-15～20 ℃之間最適宜生長(zhǎng)，而普通細(xì)菌適應(yīng)生長(zhǎng)溫度為25～40 ℃，故在低溫條件下貯藏的肉制品更有利于嗜冷菌的生長(zhǎng)。

天然抑菌劑來(lái)源于天然的動(dòng)植物或微生物，因安全環(huán)保成為食品防腐保鮮的研究熱點(diǎn)。通過(guò)四種天然抑菌劑對(duì)七種腐敗菌抑菌能力的比較，-PL 和Nisin 均能有效抑制腐敗菌的生長(zhǎng)，其中-PL 對(duì)的抑菌能力較強(qiáng)，MIC 為15.63 μg/mL。-PL 由鏈霉菌好氧發(fā)酵產(chǎn)生，能在人體內(nèi)分解為賴(lài)氨酸，可完全被人體消化吸收，對(duì)人體無(wú)任何副作用。Nisin 作為一種新型多肽，食用后在消化道中很快被蛋白水解酶分解成氨基酸，不會(huì)改變腸道內(nèi)的正常菌群或與其它抗生素出現(xiàn)交叉抗性，是目前世界上唯一允許被用作食品添加劑的細(xì)菌素。-PL 抑菌性與其對(duì)菌體細(xì)胞壁和細(xì)胞膜系統(tǒng)的破壞有關(guān)，而Nisin 主要作用于菌體細(xì)胞膜，孔道理論認(rèn)為Nisin 可以通過(guò)使微生物細(xì)胞膜中形成孔道，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷、核苷酸以及氨基酸等小分子物質(zhì)快速流出，細(xì)胞的生物合成過(guò)程受阻，從而使微生物細(xì)胞裂解死亡。

將高通量測(cè)序和傳統(tǒng)培養(yǎng)方法結(jié)合起來(lái)可以更好地驗(yàn)證菌群構(gòu)成，本研究通過(guò)高通量測(cè)序得到德州扒雞腐敗過(guò)程中的群落組成結(jié)構(gòu)，通過(guò)傳統(tǒng)培養(yǎng)分離得到腐敗末期七種腐敗菌，與高通量測(cè)序結(jié)果相對(duì)應(yīng)，其中五種腐敗菌占比較高。利用-PL、Nisin、TP、LZ 四種天然抑菌劑對(duì)分離得到的腐敗菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，得到-PL 和Nisin兩種抑菌劑對(duì)腐敗菌具有較好的抑菌效果，為后續(xù)德州扒雞的防腐保鮮提供了理論依據(jù)，但仍需進(jìn)一步采集不同時(shí)間點(diǎn)德州扒雞的腐敗菌樣品，確定不同季節(jié)導(dǎo)致德州扒雞腐敗變質(zhì)的微生物是否存在差異，以期闡明季節(jié)變換對(duì)德州扒雞腐敗時(shí)間的影響及腐敗機(jī)制。