胡玉婷， 凌 俊， 江 河， 汪 煥， 潘庭雙， 周華興

(安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所/水產(chǎn)增養(yǎng)殖安徽省重點實驗室，安徽合肥 230031)

中華絨螯蟹()別稱河蟹，俗稱大閘蟹，是我國久負(fù)盛名的名貴水產(chǎn)品，自然分布于我國長江、黃河、遼河和甌江等河川及附近地區(qū)。20世紀(jì)80年代初，隨著河蟹育苗技術(shù)的突破和養(yǎng)殖技術(shù)的開發(fā)和推廣，我國河蟹養(yǎng)殖進(jìn)入前所未有的嶄新階段，產(chǎn)量逐年增加，已成為世界首個產(chǎn)蟹大國，同時從蟹苗一直到成蟹培育，全部采用人工方法，這在世界上也是絕無僅有的。目前，中華絨螯蟹養(yǎng)殖已遍布我國從遼寧至浙江的各沿海省份及廣大內(nèi)陸地區(qū)，是我國最重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖蟹類，2020年全國養(yǎng)殖總產(chǎn)量為77.6萬t。但隨著中華絨螯蟹養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的規(guī)模化發(fā)展，跨流域引種和增殖放流等生產(chǎn)活動，造成不同水系中華絨螯蟹種質(zhì)資源嚴(yán)重混雜和養(yǎng)殖性能退化，尤其受利益驅(qū)使和技術(shù)所限，中華絨螯蟹育苗場一般選擇100 g左右小規(guī)格親本繁殖，且不考慮親本遺傳差異，導(dǎo)致蟹苗質(zhì)量差，已成為當(dāng)前養(yǎng)殖生產(chǎn)發(fā)展的瓶頸問題。如蘇雨等采用微衛(wèi)星和線粒體標(biāo)記(COⅠ、b和D-loop)分析了來自長江、黃河和遼河野生與養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，結(jié)果一致表明，三個水系群體間的遺傳分化程度較低，野生群體的遺傳分化與地理距離具有不完全相關(guān)性，提示不同水系的中華絨螯蟹可能與其跨流域引種及養(yǎng)殖群體逃逸造成其種質(zhì)混雜有關(guān)。

一般認(rèn)為，遺傳多樣性的大小及其群體遺傳結(jié)構(gòu)跟一個物種的進(jìn)化潛力和抵御不良環(huán)境的能力密切相關(guān)。鑒于此，本研究擬在分析養(yǎng)殖群體遺傳背景的基礎(chǔ)上，從中選取遺傳多樣性高且遺傳距離適度的群體作為育種基礎(chǔ)群，采取大規(guī)格親本進(jìn)行繁育的方法培育中華絨螯蟹良種。江蘇和安徽兩省是目前中華絨螯蟹重要的養(yǎng)殖區(qū)域，成蟹養(yǎng)殖產(chǎn)量分別位列全國第一和第三，占比分別為46.3%、12.9%。本研究利用10對微衛(wèi)星標(biāo)記對偶數(shù)年的江蘇、安徽4個主要養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，旨在為中華絨螯蟹的遺傳選育、種質(zhì)資源保護(hù)與利用工作提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2020年8月，中華絨螯蟹樣品采集于安徽省蕪湖市無為縣泉塘鎮(zhèn)、江蘇省南京市高淳區(qū)椏溪鎮(zhèn)、江蘇省宜興市楊巷鎮(zhèn)和江蘇省張家港市鳳凰鎮(zhèn)魏莊村，4個養(yǎng)殖群體的親本是當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖場于2018年底采集(或購買)的大規(guī)格野生長江蟹(雌蟹約 300 g，雄蟹約400 g)。每個養(yǎng)殖群體隨機(jī)選取30只成蟹樣品。

1.2 總基因組DNA提取

剪取上述中華絨螯蟹的附肢肌肉樣品，保存于無水乙醇中備用。提取河蟹總基因組DNA，提取方法參照基因組提取試劑盒[DP324，天根生化科技(北京)有限公司]說明書進(jìn)行。提取的基因組DNA分裝后于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 微衛(wèi)星位點的擴(kuò)增

由表1可知，經(jīng)預(yù)試驗，從參考文獻(xiàn)[7，9]中選取能夠穩(wěn)定擴(kuò)增、等位基因個數(shù)較多、多態(tài)性較好的10對微衛(wèi)星引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成熒光引物。

表1 中華絨螯蟹微衛(wèi)星引物信息

PCR反應(yīng)總體系20.0 μL：先加入超純水，依次補足模板DNA，10×Buffer緩沖液(TaKaRa) 2.0 μL，dNTP(2.5 mmol)1.5 μL，MgCl(2.5 mol/L)2.0 μL，上下游引物(5 μmol/L)各1.0 μL，DNA聚合酶0.3 U。PCR反應(yīng)條件：96 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性45 s，由表1可知，最佳退火溫度下保持45 s，72 ℃延伸1 min，32個循環(huán)；循環(huán)后72 ℃延伸10 min，4 ℃結(jié)束反應(yīng)，-20 ℃保存?zhèn)溆?。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)ABI-3730XL全自動DNA測序儀進(jìn)行測定，然后使用軟件Genemarker 2.2讀取等位基因大小進(jìn)行基因分型，內(nèi)標(biāo)為LIZ500。

1.4 數(shù)據(jù)分析

運用軟件CONVERT 1.31把基因型數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為各種軟件格式。使用Popgene 1.32計算觀測等位基因的數(shù)目、有效等位基因數(shù)目、觀測雜合度、期望雜合度、近交系數(shù)及群體間Nei’s遺傳距離，采用MEGA 7.0軟件構(gòu)建前述遺傳距離的UPGMA系統(tǒng)樹；用PIC_CALC 0.6小程序計算各位點及群體的多態(tài)信息含量。運用Arlequin 3.5軟件計算成對群體之間的遺傳分化系數(shù)(genetic differentiation coefficient，)，并采用分子方差分析(analysis of molecular variance，AMOVA)統(tǒng)計變異來源。哈迪-溫伯格平衡檢驗通過Genepop在線軟件(http：//genepop.curtin.edu.au/)進(jìn)行。根據(jù)各位點等位基因頻率，應(yīng)用Bottleneck軟件中的符號檢驗(Sign test)和符號秩次檢驗(Wilcoxon sign-rank)，檢驗在3種突變模型(IAM、TPM和SMM)假設(shè)下是否偏離突變-漂移平衡(Mutation-drift equilibrium)。利用軟件Strcture 2.3.4對4個養(yǎng)殖群體進(jìn)行遺傳聚類分析，確定最佳值，結(jié)果使用軟件CLUMPP打開，利用小程序DISTRUCT繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 微衛(wèi)星位點和群體遺傳多樣性

10對微衛(wèi)星位點和4個養(yǎng)殖群體的遺傳信息比較見表2。有效等位基因數(shù)(：4.980～26.620)均>4，觀測雜合度(：0.585～0.990)、期望雜合度(：0.803～0.967)及多態(tài)信息含量(PIC：0.778～0.961)值均>0.5，符合群體遺傳評估的多樣度要求。

表2 微衛(wèi)星位點的遺傳多樣性參數(shù)

表2(續(xù))

各養(yǎng)殖群體均顯示出較高的遺傳多樣性水平(=0.722～0.812，=0.904～0.918，PIC=0.874～0.891)，無為泉塘群體期望雜合度及多態(tài)信息含量相對較高，宜興楊巷群體期望雜合度及多態(tài)信息含量相對較低。綜合各遺傳多樣性參數(shù)結(jié)果，認(rèn)為各群體的遺傳多樣性大小順序為：無為群體>張家港群體>高淳群體>宜興群體。40個群體-位點的組合中，大部分組合(31個)近交系數(shù)()為正值且相應(yīng)的<，所有群體的10個微衛(wèi)星位點平均近交系數(shù)()值均為正。

2.2 群體遺傳距離和分化

對4個養(yǎng)殖群體間的成對遺傳距離和遺傳分化指數(shù)()進(jìn)行分析。由表3、表4可知，遺傳距離較小(0.121 0～0.189 0)，均低于0.3；群體間遺傳分化指數(shù)(0.001 5～0.008 2)較小，遠(yuǎn)低于0.05，其中，遺傳分化程度最大的為無為群體和宜興群體(0.008 2)，其遺傳距離也最遠(yuǎn)(0.189 0)。AMOVA結(jié)果顯示， 群體之間的遺傳變異占總變異的比例僅為0.42%，而來自每個養(yǎng)殖群體內(nèi)的遺傳變異占比高達(dá)99.58%，表明4個中華絨螯蟹養(yǎng)殖群體遺傳分化程度極低，無顯著遺傳分化。

表3 中華絨螯蟹4個群體的遺傳距離(對角線上)和遺傳分化指數(shù)(對角線下)

表4 中華絨螯蟹4個養(yǎng)殖群體的分子方差分析(AMOVA)

基于Nei’s遺傳距離用UPGMA法構(gòu)建的4個群體的系統(tǒng)發(fā)育樹表明，4個養(yǎng)殖群體具有共同的祖先型，高淳和張家港群體最先聚類為一支，互為姊妹群，然后與無為群體聚類，最后與宜興群體聚類，表明高淳和張家港群體親緣關(guān)系最近、宜興群體與其他群體間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖1)。

2.3 瓶頸效應(yīng)分析

中華絨螯蟹4個養(yǎng)殖群體的突變-漂移平衡分析結(jié)果見表5。IAM假設(shè)下，Sign test顯示高淳和無為2個群體偏離了突變-漂移平衡，表現(xiàn)出雜合顯著過剩；Wilcoxon sign-rank顯示所有群體均偏離了突變-漂移平衡。SMM假設(shè)下，所有群體均符合突變-漂移平衡。TPM假設(shè)下，Sign test顯示所有群體均符合突變-漂移平衡；Wilcoxon sign-rank顯示僅無為群體偏離突變-漂移平衡，表現(xiàn)為雜合過剩。

表5 中華絨螯蟹4個群體的突變-漂移平衡分析

2.4 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

設(shè)置預(yù)設(shè)聚類組數(shù)為2～5，=4時為最佳聚類分組。遺傳結(jié)構(gòu)圖見圖2，每個養(yǎng)殖群體均包含4個遺傳聚類組，說明4個養(yǎng)殖群體存在相似的遺傳組成，無明顯的遺傳結(jié)構(gòu)差異。

3 討論與結(jié)論

3.1 中華絨螯蟹的遺傳多樣性

遺傳多樣性是種質(zhì)鑒定的重要部分，一般認(rèn)為遺傳多樣性的高低與物種或群體生存和進(jìn)化潛力呈呈正相關(guān)，遺傳多樣性越高，物種或群體適應(yīng)環(huán)境變化的能力越強(qiáng)。而有效等位基因數(shù)、預(yù)期雜合度和多態(tài)信息含量，均是衡量遺傳多樣性高低的重要參數(shù)。中華絨螯蟹4個養(yǎng)殖群體的為9.810～11.660，為0.904～0.918，為0.874～0.891，分別高于4.0、0.5、0.5的高度多樣性標(biāo)準(zhǔn)，均顯示出較高的遺傳多樣性水平。如，高于奇數(shù)年中華絨螯蟹3個人工選育群體(“長江1號”“光合1號”和七里海群體)和1個海河自然群體的遺傳多樣性(為4.79～5.87，為0.720～0.745，為0.687～0.716)；高于偶數(shù)年長江水系中華絨螯蟹3個育種基礎(chǔ)群(崇明團(tuán)結(jié)沙、揚中江段、靖江與六合、江浦江段)(：3.90～3.95，：0.696～0.705，：0.746～0.792)；但與偶數(shù)年(2012年)遼河、黃河及長江3個水系的野生和養(yǎng)殖6個群體的遺傳多樣性結(jié)果(：13.08～14.10，：0.870～0.881，均值0.864)比較，較小、略小、值相近；大小還與長江水系野生和人工繁殖大眼幼體群體的遺傳多樣性水平(0.898、0.893)相近。另外，基于線粒體等其他分子標(biāo)記的中華絨螯蟹研究也顯示多數(shù)野生和養(yǎng)殖群體均具有較高的遺傳多樣性。綜上所述，中華絨螯蟹具有高遺傳多樣性應(yīng)該是普遍現(xiàn)象；本研究的中華絨螯蟹4個養(yǎng)殖群體遺傳多樣性處于高水平，具有較大的育種潛力。

3.2 中華絨螯蟹的遺傳結(jié)構(gòu)

群體遺傳距離和遺傳分化指數(shù)分別是用于衡量群體間親緣關(guān)系、遺傳分化程度的重要指標(biāo)。本研究中，中華絨螯蟹成對群體間的遺傳距離范圍為0.121 0～0.189 0、遠(yuǎn)低于0.3的物種標(biāo)準(zhǔn)，表明這些群體親緣關(guān)系較近。成對群體間值為0.001 5～0.008 2，均遠(yuǎn)低于0.05的遺傳分化程度中等以上標(biāo)準(zhǔn)。進(jìn)一步的分子變異分析(AMOVA)結(jié)果顯示，群體間遺傳變異占比極小(0.42%)。Structure遺傳聚類分析結(jié)構(gòu)顯示，所有個體可分為4個遺傳組，但每個養(yǎng)殖群體中均包含這4個遺傳組，這些一致表明4個中華絨螯蟹養(yǎng)殖群體間遺傳組成相似，群體間無顯著遺傳分化。

近交系數(shù)大小常用于評估群體內(nèi)個體間的近交程度。本研究中，10個微衛(wèi)星位點在每個群體及所有個體中的雖然均為正值(0.093～0.183、0.143)但數(shù)值較低，且40個群體-位點組合中的9個值為負(fù)值，這些結(jié)果表明，中華絨螯蟹4個養(yǎng)殖群體不僅均存在一定程度的近交，而且還存在少量的遠(yuǎn)緣繁殖?？紤]到這些群體高度的遺傳多樣性水平，分析可能其苗種或親本群體來源較為復(fù)雜。事實上，已有不少研究報道，中華絨螯蟹在我國不同地區(qū)相互引種，導(dǎo)致不同水系的中華絨螯蟹種質(zhì)相互混雜，致使養(yǎng)殖群體遺傳多樣性偏高。

基于Nei’s遺傳距離構(gòu)建的4個河蟹群體UPGMA系統(tǒng)發(fā)育樹表明，4個養(yǎng)殖群體具有共同的祖先型，高淳和張家港群體親緣關(guān)系最近，其次是無為群體，最后是宜興群體，這表明宜興群體與其他群體間遺傳距離較遠(yuǎn)。

瓶頸效應(yīng)分析結(jié)果顯示，3種突變模型(IAM、TPM、SMM)假設(shè)下的4個中華絨螯蟹養(yǎng)殖群體的突變-漂移平衡評估結(jié)果不同。由于現(xiàn)有研究認(rèn)為微衛(wèi)星數(shù)據(jù)更符合TPM模型，Wilcoxon符號秩次檢驗比符號檢驗的統(tǒng)計效率相對較高，并可用于4個位點以上任意樣本數(shù)群體的分析。因此，在TPM假設(shè)下，符號秩次檢驗結(jié)果顯示僅無為群體偏離了突變-漂移平衡，且表現(xiàn)為雜合顯著過剩，這與其遺傳多樣性最高的結(jié)論相吻合。因此，雖然無為群體經(jīng)歷了瓶頸效應(yīng)，但由于有遠(yuǎn)緣繁殖的引種效果，其遺傳多樣性依然很高。

綜上所述，中華絨螯蟹4個養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性水平高，群體間無顯著遺傳分化，群體間可能存在少量的種質(zhì)混雜。從開發(fā)利用的角度來說，在今后的選育中應(yīng)該結(jié)合采用分子遺傳學(xué)、形態(tài)學(xué)等多種方法，將傳統(tǒng)選育技術(shù)與分子輔助育種技術(shù)相結(jié)合，對長江水系中華絨螯蟹進(jìn)行提純復(fù)壯，培育長江水系中華絨螯蟹良種。