郭建華， 蔣海嬌， 郭宏文， 鄒東恢， 王 燕

(齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006)

纖維素酶在飼料工業(yè)、食品工業(yè)、洗滌工業(yè)及紡織工業(yè)中具有廣泛的利用前景。大多數(shù)細(xì)菌所產(chǎn)纖維素酶與真菌來源的酶性質(zhì)不同，某些方面具有真菌酶不可替代的作用，因此細(xì)菌纖維素酶在工業(yè)生產(chǎn)中的地位逐漸提高。其中，產(chǎn)纖維素酶的芽孢桿菌逐漸成為近年研究熱點(diǎn)。自1960年來，對纖維素酶的分離純化開展了廣泛的科學(xué)探索。微生物所產(chǎn)纖維素酶是由多種酶組分組成的復(fù)雜酶系統(tǒng)，將酶從系統(tǒng)中分離純化出來是精確研究它們的前提。酶的分離純化技術(shù)有多種，一是可根據(jù)蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性差異進(jìn)行分離純化；二是利用酶蛋白溶解特性的不同進(jìn)行分離純化，可利用鹽分級(jí)沉淀或利用雙水相體系進(jìn)行分離純化，如Liu等利用響應(yīng)面法優(yōu)化了雙水相體系(ATPS)對貝萊斯芽孢桿菌所產(chǎn)的纖維素酶的分離純化工藝；三是利用電泳和液相色譜技術(shù)分離純化，主要作用是檢測酶蛋白的分子量和純度；四是利用分子篩凝膠色譜、離子交換色譜等色譜層析分離純化，如江小妹等采用Q-瓊脂糖凝膠FF陽離子交換層析和葡聚糖G-100凝膠層析對團(tuán)頭魴腸道菌株MA35所產(chǎn)的內(nèi)切型纖維素酶進(jìn)行分離純化，酶的比活力由22.3 U/mg提高至 30.6 U/mg。實(shí)際研究工作中，一般要采用多種分離技術(shù)對纖維素酶進(jìn)行分離純化。Clare等利用4 mol/L蔗糖溶液透析、Q-Sepharose FF離子交換色譜和苯基Sepharose CL-4B疏水作用色譜對球形芽孢桿菌CE-3產(chǎn)生的纖維素酶進(jìn)行純化，利用SDS-PAGE電泳檢測酶的分子質(zhì)量。王婷婷等利用(NH)SO分級(jí)沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換層析和Phenyl Sepharose 6 Fast Flow疏水層析，從文蛤(L.)中分離純化出1種纖維素酶，分離純化后的纖維素酶比活力達(dá)到40.33 U/mg，純化倍數(shù)達(dá)13.12。目前為止，在纖維素酶分離純化方面，存在著純化倍數(shù)較低、回收率低、純化不完全等問題，同時(shí)很多分離純化技術(shù)僅能局限于實(shí)驗(yàn)室層面，影響對酶的特性的研究及其應(yīng)用。針對來源和種類眾多的纖維素酶體系的各個(gè)組分，研究開發(fā)分離純化手段是提高純化倍數(shù)和提高回收率等問題的關(guān)鍵所在。

本研究以選育得到1株產(chǎn)纖維酶細(xì)菌的突變菌株為試驗(yàn)菌株，利用硫酸銨鹽析、疏水相互作用色譜、離子交換層析及分子篩凝膠色譜從其發(fā)酵液中分離純化內(nèi)切--葡聚糖苷酶(CMC酶)，測定分離純化后的酶的純度、分子量及部分酶學(xué)特性，以期為菌株所產(chǎn)纖維素酶的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

菌株DM-4，筆者所在實(shí)驗(yàn)室從白酒酒醅中選育得到，經(jīng)鑒定該菌為枯草芽孢桿菌()。試驗(yàn)于2020年6—10月在齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，pH值7.5～7.6，121 ℃下滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮(過80目篩)2.54%，蛋白胨0.92%，KHPO0.50%，NaCl 0.50%，硫酸鎂0.02%，pH值為6.0～6.5，121 ℃下滅菌30 min。

1.2.2 酶液的制備 將菌株DM-4接種在種子培養(yǎng)基上，置于恒溫?fù)u床內(nèi)，溫度37 ℃、轉(zhuǎn)速 180 r/min 條件下培養(yǎng)12 h作為種子。將種子液以5%接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，溫度37 ℃、轉(zhuǎn)速231 r/min發(fā)酵36 h。將發(fā)酵液倒入離心管內(nèi)，于溫度4 ℃、轉(zhuǎn)速5 000 r/min條件下離心10 min，得到粗酶液。

1.2.3 內(nèi)切型--葡聚糖酶(CMC酶)活力的測定 內(nèi)切型--葡聚糖酶(CMC酶)活力的測定見參考文獻(xiàn)[12]。

1.2.4 蛋白質(zhì)含量的測定 280 nm()光吸收法：利用試驗(yàn)用緩沖溶液將分光光度計(jì)調(diào)至零；利用分光光度計(jì)檢測樣品在280 nm波長下的吸光度。

或采用Folin-酚法測定，見參考文獻(xiàn)[13]。

1.2.5 內(nèi)切--葡聚糖苷酶的分離純化

1.2.5.1 硫酸銨鹽析 將酶液裝入8個(gè)試管內(nèi)(每管5 mL)，放入冰水浴中，向管內(nèi)緩慢加入粉末硫酸銨，使硫酸銨飽和度分別為20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%和90%。4 ℃放置12 h，離心后測定酶液CMC酶活。

取300 mL離心除去菌體粗酶液，緩緩加入粉末硫酸銨至分級(jí)鹽析沉淀?xiàng)l件下限，4 ℃放置12 h，離心后測定清液體積。向清液中緩緩加入粉末硫酸銨至分級(jí)沉淀?xiàng)l件的上限，4 ℃放置12 h。離心棄上清，將沉淀溶于30 mL 0.1 mol/L檸檬酸0.2 mol/L NaHPO緩沖液(pH值7.0)中。

1.2.5.2 透析脫鹽 將透析袋剪成約20 cm長度，放入碳酸氫鈉(2%)和EDTA(1 mmol/L)混合溶液中，加熱沸騰10 min。清洗干凈放入EDTA(1 mmol/L)溶液中加熱沸騰10 min，降溫后浸在乙醇溶液(20%)中冰箱4 ℃存放。

取1 000 mL燒杯加入蒸餾水，加入攪拌轉(zhuǎn)子，將燒杯放在磁力攪拌器上，把復(fù)溶酶液倒入透析袋內(nèi)，止水夾夾住末端，裝進(jìn)燒杯內(nèi)在4 ℃低溫下進(jìn)行脫鹽。每2 h換水，將BaCl溶液滴入燒杯內(nèi)，若無沉淀出現(xiàn)，則脫鹽過程結(jié)束，后利用聚乙二醇(分子量20 000)將酶液濃縮。

1.2.5.3 Sephadex G-25 凝膠色譜分離 通過Sephadex G-25 凝膠色譜層析對鹽析并脫鹽后的酶液脫色和交換緩沖液。柱型：2.6 cm×30 cm，洗脫液：0.02 mol/L PBS 緩沖液(pH值7.0，硫酸銨飽和度30%)；流速：2 mL/min，每管6 mL。檢測每個(gè)管內(nèi)液體的吸光度及CMC酶活力，混合具有活性的液體。

1.2.5.4 Phenyl-Sepharose HP 疏水相互作用色譜分離 柱型：2.6 cm×15 cm；起始緩沖液：0.02 mol/L PBS 緩沖液(pH值7.0，硫酸銨飽和度30%)；洗脫液：0.02 mol/L PBS緩沖液(pH值為7.0)；流速：2 mL/min。上樣后起始緩沖溶液恒流洗至吸光度()接近于0，再用起始緩沖溶液和等體積洗脫液進(jìn)行線性梯度洗脫；每管收集6 mL。檢測每個(gè)管內(nèi)液體的吸光度及CMC酶活力，混合具有活性的液體。

1.2.5.5 CM-Sepharose FF 弱陽離子交換色譜分離 將Phenyl-Sepharose HP分離收集的液體透析脫鹽，再利用CM-Sepharose FF進(jìn)一步分離純化。

吸附pH值的確定：準(zhǔn)備6個(gè)小燒杯，每個(gè)燒杯放入1 mL處理好的CM-Sepharose FF，采用濃度為0.02 mol/L PBS(pH值分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和7.5)5 mL漂洗樹脂10次，每個(gè)燒杯內(nèi)PBS高出約1 cm，每個(gè)燒杯內(nèi)移入1 mL酶液，混勻，靜置約10 min，取上清液檢測其殘留酶活，計(jì)算酶活殘留率(%)，確定最佳吸附pH值。

柱型：2.6 cm×15 cm；起始緩沖液：0.02 mol/L PBS緩沖液(pH值為5.5、6.0)；流速：2.0 mL/min；上樣后用起始緩沖液沖洗至接近于0，按照NaCl濃度遞增方向采用起始緩沖液和等體積含NaCl 0.8 mol/L(0.5 mol/L)的洗脫液進(jìn)行梯度洗脫；每管收集6 mL。檢測每個(gè)管內(nèi)液體的吸光度及CMC酶活力，混合具有活性的液體。

1.2.5.6 Superdex 75 凝膠色譜分離 將離子交換色譜后處理后的液體，透析脫鹽濃縮后通過Superdex 75進(jìn)一步分離提純。柱型：Superdex 75 16/60 預(yù)裝柱；洗脫液：0.02 mol/L PBS緩沖液(0.5 mol/L NaCl，pH值7.0)；洗脫液體積：120 mL；流速：1.0 mL/min；每管收集1 mL。檢測每個(gè)管內(nèi)液體的吸光度及CMC酶活力，混合具有活性的液體。

1.2.5.7 純度檢測及分子量的測定 利用SDS-PAGE電泳檢測酶的純度。

1.2.6 內(nèi)切--葡聚糖苷酶酶學(xué)特性測定

1.2.6.1 最適作用溫度及熱穩(wěn)定性測定 取分離提純后的酶液稀釋后，在溫度30、35、40、45、50、55、60、65、70 ℃的水浴條件下測定CMC酶活力。

將上述酶液置于40、50、60、70、80 ℃的水浴中，每隔20 min檢測CMC酶活力，計(jì)算殘留率(%)。

1.2.6.2 最適作用pH值及pH穩(wěn)定性測定 采用pH值分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5的醋酸-醋酸鈉溶液制備羧甲基纖維素鈉溶液(1%)作為底物，取純化后的酶液適當(dāng)稀釋后，檢測CMC酶活力。

取純化后酶液適當(dāng)稀釋后分成6份，分別加入雙倍體積的pH值為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0及9.0醋酸-醋酸鈉溶液，放入40 ℃水浴中，每20 min檢測CMC酶活1次，計(jì)算殘留率(%)。

1.2.6.3 酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)和的測定 將純化后酶液利用醋酸-醋酸鈉溶液(pH值7.5)稀釋30倍，取1 mL加入1 mL采用醋酸-醋酸鈉溶液制備不同濃度的CMC-Na溶液(pH值7.5)，使酶液進(jìn)反應(yīng)時(shí)底物濃度分別為10、8、6、4、2 g/L，反應(yīng)溫度和pH值設(shè)在最適條件下。每種底物濃度分別于0、5、10、15、20、25 min采用DNS法測定還原糖含量。繪制還原糖含量與時(shí)間的變化曲線，進(jìn)行二次回歸求得，利用L-B法作圖計(jì)算和。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶的分離純化

2.1.1 硫酸銨沉淀 利用不同飽和度硫酸銨進(jìn)行沉淀試驗(yàn)確定鹽析條件，由表1可知，隨硫酸銨飽和度增加，上清中殘余酶活逐漸降低，當(dāng)硫酸銨飽和度達(dá)70%時(shí)，上清液中的殘留酶活已降至1.02%。因此，確定硫酸銨的飽和度沉淀區(qū)間為20%～70%。沉淀采用緩沖液溶解后，再充分透析脫鹽。

表1 硫酸銨不同飽和度的上清液酶活殘留率

2.1.2 Sephadex G-25凝膠分離 本研究采用分子量范圍為100～5 000 u Sephadex G-25，對經(jīng)20%～70%飽和度硫酸銨處理的酶脫色和初步分離，洗脫曲線。由圖1可知，洗脫時(shí)CMC酶組分首先被洗脫下來，可推測菌株DM-4所產(chǎn)CMC酶的分子量 > 5 000 u。酶的活性峰和蛋白峰相對應(yīng)，提示Sephadex G-25凝膠去除色素和分離較小的雜質(zhì)蛋白效果理想。

2.1.3 Phenyl-Sepharose HP 疏水相互作用色譜分離結(jié)果 經(jīng)過Sephadex G-25凝膠分離后，收集的活性組分過度到硫酸銨飽和度為30%緩沖體系，進(jìn)行下一步Phenyl-Sepharose HP分純。由圖2可知，恒洗過程中疏水性較弱的雜質(zhì)去除了很多。在硫酸銨飽和度線性降低的梯度洗脫過程中分離出2個(gè)CMC酶活性組分，命名為CMC酶Ⅰ和CMC酶Ⅱ。CMC酶Ⅰ在梯度洗脫中期被洗脫下來，其活性較高，CMC酶Ⅱ在梯度洗脫結(jié)束時(shí)被洗脫下來，說明CMC酶Ⅱ 疏水性強(qiáng)于酶Ⅰ。

2.1.4 CM-Sepharose FF 弱陽離子交換色譜分離 利用CM-Sepharose FF將經(jīng)疏水相互作用分純收集到的CMC酶Ⅰ和CMC酶Ⅱ活性組分再次分純。由表2、表3可知，CMC酶Ⅰ和CMC酶Ⅱ分別在pH值5.5和pH值6.0時(shí)吸附效果最好，因此，起始緩沖液pH值分別確定為pH值5.5和pH值6.0。經(jīng)多次試驗(yàn)比較后，對CMC酶Ⅰ選擇 0.8 mol/L NaCl溶液為洗脫液，對CMC酶Ⅱ選擇0.5 mol/L NaCl溶液為洗脫液。

表2 不同pH值緩沖液樹脂對CMC酶Ⅰ吸附效果

表3 不同pH緩沖液樹脂對CMC酶Ⅱ吸附效果

由圖3和圖4可知，在各自優(yōu)化條件下，CMC酶Ⅰ和CMC酶Ⅱ均能很好地與填料結(jié)合，在恒洗階段，活性組分未被洗脫，而雜蛋白在恒洗階段被大量洗脫。梯度洗脫時(shí)酶活性組分被洗脫下來，并且酶活性峰與蛋白峰基本對應(yīng)。

2.1.5 Superdex 75凝膠過濾色譜分離 將CMC酶Ⅰ和CMC酶Ⅱ活性組分脫鹽濃縮后，進(jìn)行Superdex 75分離。由圖5、圖6可知，在洗脫過程CMC酶蛋白峰與其他蛋白峰分開，并且與活性峰完全對應(yīng)， 說明CMC酶Ⅰ和CMC酶Ⅱ均已達(dá)比較理想的純化效果，分別將CMC酶Ⅰ和CMC酶Ⅱ的活性組分收集，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.6 CMC酶Ⅰ和CMC酶Ⅱ分離純化回收后的結(jié)果 由表4、 表5可知， 經(jīng)Phenyl-Sepharose HP疏水相互作用色譜處理后，CMC酶Ⅰ和CMC酶Ⅱ比活力分別達(dá)960.82、717.19 U/mL，純化倍數(shù)為 19.33倍和14.43倍，提示 Phenyl-Sepharose HP疏水相互作用色譜分離是適合用于菌株DM-4所產(chǎn)內(nèi)切纖維素酶的一種分離手段。經(jīng)CM-Sepharose FF處理后，純化倍數(shù)進(jìn)一步提高，最后經(jīng)過Superdex 75處理后，純化倍數(shù)分別達(dá)45.94倍和32.27倍。

表4 CMC酶Ⅰ純化結(jié)果

表5 CMC酶Ⅱ純化結(jié)果

2.1.7 CMC酶純度檢驗(yàn)及分子量檢測 利用 SDS-PAGE 電泳檢測CMC酶純度及其相對分子質(zhì)量，由圖7可知，經(jīng)分離純化得到CMC酶Ⅰ及CMC酶Ⅱ均已達(dá)電泳級(jí)別純度。由圖8可知，利用Mark中蛋白分子量的對數(shù)和遷移率繪制蛋白分布曲線。根據(jù)CMC酶Ⅰ和CMC酶Ⅱ的相對遷移率大小及分布曲線，計(jì)算得到CMC酶Ⅰ分子量約38.99 ku，CMC酶Ⅱ分子量約45.53 ku。

這與其他學(xué)者分離純化出的細(xì)菌內(nèi)切纖維素酶具有一些差別，如Aa等從枯草芽胞桿菌中純化的CMC酶分子量為70 ku。Allardyce等從某細(xì)菌中獲得的2種CMC酶分子量分別為53 ku和 52 ku。Yan等從蠟樣芽孢桿菌中獲得的CMC酶分子量為51.3 ku。Lo等純化出得活性CMC酶分子量約35.8 ku。Zakaria等從枯草芽胞桿菌菌株KU-1獲得的CMC酶分子量為39～40 ku。

2.2 菌株所產(chǎn)內(nèi)切-β-葡聚糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 酶最適作用溫度及熱穩(wěn)定性檢測 將純化后的CMC酶Ⅰ和CMC酶Ⅱ適當(dāng)稀釋后，于不同溫度條件分別檢測其活力大小。由圖9可知，CMC酶Ⅰ在60 ℃反應(yīng)條件下表現(xiàn)出最高活力，CMC酶Ⅱ 在55 ℃反應(yīng)條件下表現(xiàn)出最高活力。

經(jīng)差異顯著性檢測，55 ℃與60 ℃時(shí)，CMC酶Ⅰ的酶活不具有顯著差異(<0.05)，55 ℃與其他溫度下酶活差異顯著(<0.01)；CMC酶Ⅱ在55 ℃時(shí)酶活與其他溫度下均具有顯著差異(<0.01)。因此，確定CMC酶Ⅰ最適作用溫度范圍為55～60 ℃，CMC酶Ⅱ?yàn)?5 ℃。

將純化稀釋后的CMC酶Ⅰ和CMC酶Ⅱ分別放置在不同溫度水浴中，每20 min取樣檢測酶活，計(jì)算殘留率。由圖10、圖11可知，當(dāng)溫度低于70 ℃時(shí)，在60 min前，CMC酶Ⅰ和CMC酶Ⅱ殘留率均大于50%，穩(wěn)定性良好。當(dāng)溫度升高至80 ℃后，隨時(shí)間延長酶活殘留降低很快，直至完全喪失活力，但在80 ℃保溫60 min后，仍具有25%以上的殘留率，提示CMC酶Ⅰ和CMC酶Ⅱ耐溫性較強(qiáng)。本研究所分離的2種纖維素酶的最適溫度和耐熱性與吳石金等和Xu等獲得的CMC酶具有相似性。

2.2.2 酶的最適作用pH值及酶的pH值穩(wěn)定性 將分離純化的CMC酶Ⅰ和CMC酶Ⅱ適當(dāng)稀釋，于不同pH值反應(yīng)體系中檢測酶活力大小。由圖12可知，CMC酶Ⅰ和CMC酶Ⅱ在pH值為7.5時(shí)均具有最大酶活力，可確定pH值7.5是2種酶最適作用pH值。由圖13、圖14可知，2種酶在pH值為6.0～8.0范圍內(nèi)均具有良好穩(wěn)定性，而在其他pH值條件下，酶活下降速度很快，與其他研究者試驗(yàn)結(jié)果相似。根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果可初步確定此次分離的CMC酶為中性纖維素酶。

2.2.3 CMC酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)和的測定 由圖15、圖16可知，求得CMC酶Ⅰ的米氏常數(shù)為2.55 g/L，為37.59 μg/(min·mL)。CMC酶Ⅱ的米氏常數(shù)為4.37 g/L，為 28.82 μg/(min·mL)。來源于不同細(xì)菌的內(nèi)切--葡聚糖苷酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)常會(huì)有些區(qū)別，如Au等從枯草芽胞桿菌中得到的CMC酶為4 g/L，為0.42 mg/(min·mL)；Yan等從蠟樣芽孢桿菌中獲得的CMC酶的為2.12 g/L，為 5.37 μg/(min·mL)。

3 結(jié)論

經(jīng)分離純化，獲得2個(gè)酶活組分CMC酶Ⅰ和CMC酶Ⅱ，其純化倍數(shù)分別為45.94倍和32.27倍，回收率分別為14.66%和8.33%。經(jīng)電泳檢測，CMC酶Ⅰ和CMC酶Ⅱ分子量分別約為38.99 ku和45.53 ku。經(jīng)凝膠電泳檢測，獲得2個(gè)酶活組分CMC酶Ⅰ和CMC酶Ⅱ均能達(dá)電泳級(jí)純度，提示利用鹽析沉淀、凝膠層析、疏水層析和弱陽離子交換色譜能夠?qū)闐M-4所產(chǎn)內(nèi)切--葡聚糖苷酶具有良好的分離純化效果。酶學(xué)性質(zhì)顯示，CMC酶Ⅰ最適作用溫度為55～60 ℃，CMC酶Ⅱ?yàn)?5 ℃。當(dāng)溫度低于70 ℃時(shí)，2種酶均對熱穩(wěn)定。2種酶作用最適pH值為7.5，在pH值為6.0～8.0范圍內(nèi)兩者均具有良好穩(wěn)定性。Ca和Mg對CMC酶Ⅰ和CMC酶Ⅱ有激活作用。CMC酶Ⅰ的米氏常數(shù)為2.55 g/L，為37.59 μg/(min·mL)。CMC酶Ⅱ的米氏常數(shù)為4.37 g/L，為 28.82 μg/(min·mL)。酶學(xué)性質(zhì)表明，菌株DM-4所產(chǎn)的2種CMC酶組分均有中性偏堿性纖維素酶，這與大多數(shù)霉菌來源的纖維素酶有所不同。

本研究在實(shí)驗(yàn)室水平上將細(xì)菌菌株DM-4所產(chǎn)CMC酶組分進(jìn)行了分離純化，研究其酶學(xué)性質(zhì)，獲得良好的分離純化結(jié)果，但將其應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，還需要進(jìn)行分離純化技術(shù)的深入研究和開發(fā)。