王志鵬，趙 劍，黃 盼，崔雪梅，南 黎，宋厚輝，鮑國連，劉 燕，*

(1.浙江農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院·動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，浙江省畜禽綠色生態(tài)健康養(yǎng)殖應(yīng)用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物健康互聯(lián)網(wǎng)檢測技術(shù)浙江省工程實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，浙江 杭州 310021)

家兔大腸埃希菌病是由致病大腸埃希菌()及其毒素引起的一種暴發(fā)性、死亡率很高的腸道傳染病，常與沙門氏桿菌病、梭菌病、球蟲病協(xié)同作用，導(dǎo)致仔幼兔腸道菌系紊亂，抵抗力降低，嚴(yán)重制約養(yǎng)兔產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展?？股睾突瘜W(xué)藥物是治療兔大腸埃希菌病的主要手段，但長期使用抗生素易導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生和傳播，長此以往，將給養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。隨著我國畜牧業(yè)飼料端禁止使用抗生素和治療端抗生素減量政策的全面實(shí)施，研發(fā)新型獸藥和抗生素替代品以提高治療效果、減少抗生素應(yīng)用，對畜禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展和畜產(chǎn)品安全保障來說均具有積極意義。

噬菌體是感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒。噬菌體可侵入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)并產(chǎn)生相應(yīng)的酶，破壞細(xì)胞壁，從而裂解細(xì)菌，具有殺菌功能。與抗生素相比，噬菌體制劑具有特異性強(qiáng)、自我增殖快、研發(fā)時(shí)間短等優(yōu)勢。研究發(fā)現(xiàn)，噬菌體不會(huì)感染人體細(xì)胞，將其用作抗菌劑無明顯的毒副作用，不會(huì)破壞機(jī)體的正常菌群，無引發(fā)內(nèi)毒素血癥的風(fēng)險(xiǎn)。本文擬對兔源大腸埃希菌噬菌體進(jìn)行分離鑒定并開展生物學(xué)特性研究，旨在為利用噬菌體治療兔大腸埃希菌病奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與噬菌體樣品

噬菌體宿主譜測定涉及的25株大腸埃希菌由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所細(xì)菌病研究室分離鑒定并保存；CVCC249、CVCC232和CVCC1495菌株購于國家獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。

用于噬菌體分離的大腸埃希菌菌株分離自浙江省內(nèi)某大型種兔養(yǎng)殖場的臨床腹瀉樣本。兔糞便和污水樣本采集自浙江省內(nèi)多個(gè)大型種兔場。

1.1.2 試劑與耗材

胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)培養(yǎng)基，購自美國Oxoid公司；革蘭氏染色試劑盒，購自杭州濱和微生物試劑有限公司；抗生素藥敏片、細(xì)菌微量生化反應(yīng)管購自杭州天和微生物試劑有限公司。SM緩沖液、PBS溶液、Tris-HCl溶液、磷鎢酸、0.22 μm無菌一次性針頭式濾器均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

35日齡(400±50)g新西蘭兔，由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)兔場提供。

1.2 大腸埃希菌分離鑒定

1.2.1 大腸埃希菌的分離純化

用接種環(huán)取由腹瀉致死兔的回腸樣本內(nèi)容物，在TSA固體培養(yǎng)基上劃線接種，置于恒溫培養(yǎng)箱37 ℃過夜培養(yǎng)。之后，取透明光滑的菌落繼續(xù)在TSA固體培養(yǎng)基上進(jìn)行3次純化培養(yǎng)。使用革蘭氏染色試劑盒對純化的菌株做初步篩選。

1.2.2 分離菌株的PCR鑒定

分離菌株DNA提取：挑取單個(gè)菌落，置于5 mL TSB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)過夜。吸取1 mL新鮮菌液至1.5 mL離心管中，12 000×離心2 min，棄上清，加入1 mL雙蒸水(ddHO)重懸，沸水浴中煮沸10 min，12 000×離心10 min，取上清，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

參照文獻(xiàn)[7]中的方法對細(xì)菌進(jìn)行PCR鑒定。分別以大腸埃希菌16S rRNA的V3～V6區(qū)域基因、腸致病性大腸埃希菌LEE毒力島基因、腸致病性大腸埃希菌Ⅳ型菌毛基因、腸出血性大腸埃希菌志賀毒素基因、腸侵襲性大腸埃希菌Ⅲ型效應(yīng)子基因、產(chǎn)毒素大腸埃希菌耐熱腸毒素/不耐熱腸毒素基因、腸聚集性大腸埃希菌聚集黏附菌毛基因序列為模板，設(shè)計(jì)引物(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR采用20 μL體系：上下游引物各1 μL，MixDNA聚合酶10 μL，模板2 μL，加滅菌蒸餾水至20 μL。PCR程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 40 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。反應(yīng)完成后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行PCR產(chǎn)物檢驗(yàn)。

1.2.3 分離菌株的生化鑒定和藥敏實(shí)驗(yàn)

按CLSI(美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì))M100-23的要求，用Kirby-Bauer紙片擴(kuò)散法，根據(jù)抑菌圈的直徑()判定分離菌株對20種抗生素藥物的敏感性，對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)如下：≥20 mm，敏感(S)；15 mm≤<20 mm，中度敏感(Ⅰ)；<15 mm，耐藥(R)。

用細(xì)菌微量生化反應(yīng)管對分離菌株進(jìn)行生化反應(yīng)測定。將分離純化得到的菌株按說明書要求，分別接種于葡萄糖、乳糖、麥芽糖等生化反應(yīng)管中，測定分離菌株的生化特性。

1.2.4 分離菌株的致病性測定

選35日齡的新西蘭兔用于實(shí)驗(yàn)，對照組和感染組各5只。感染組每只兔灌喂1×10CFU·mL分離菌株10 mL，對照組灌喂10 mL PBS溶液，72 h內(nèi)觀察其發(fā)病情況。灌喂7 d后，剖檢發(fā)病兔，觀察病理特征，分離病原菌，并進(jìn)行PCR鑒定。

1.3 噬菌體的分離鑒定

1.3.1 噬菌體分離純化

樣品前處理：將采集的兔糞便樣本置于15 mL離心管中，加入0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaCl溶液(以下記為生理鹽水)10 mL和采集的污水樣本5 mL，4 ℃冰箱過夜，6 000 r·min離心10 min，取上清液，過0.22 μm濾膜除菌，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

噬菌體擴(kuò)增與初篩：將1.2節(jié)得到的分離菌株按1∶100的比例接種于2 mL TSB液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)，每間隔30 min測量1次菌液值，直至=0.2。向搖菌管中加入已過濾的糞便和污水樣品各1.5 mL，37 ℃搖床培養(yǎng)過夜。取培養(yǎng)液于2 mL離心管中，4 000 r·min離心10 min，取上清，過0.22 μm濾膜，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。取分離菌株100 μL涂布于TSA平板上，在TSA平板背面畫出大小均等的9個(gè)正方形格子并進(jìn)行標(biāo)號，根據(jù)平板標(biāo)號點(diǎn)滴樣品濾液，每個(gè)標(biāo)號方格中滴加10 μL，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。

噬菌體的雙層平板法分離與純化：取3 g TSB培養(yǎng)基和4 g TSA培養(yǎng)基，加入200 mL去離子水，高壓滅菌，制備分離所需的半固體培養(yǎng)基，55 ℃溫箱保存?zhèn)溆?。將平板出現(xiàn)空斑的樣本按照標(biāo)號找出對應(yīng)的噬菌體濾液，等比例進(jìn)行梯度稀釋。取10和10的噬菌體稀釋液各100 μL與處于對數(shù)期的分離菌株混合，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育20 min。取5 mL半固體培養(yǎng)基加入孵育液中，輕輕混勻，倒入TSA平板中，37 ℃培養(yǎng)過夜，觀察噬菌斑。挑取透光度良好、個(gè)體較大的單噬菌斑于1 mL SM緩沖液中，混勻后取100 μL與100 μL分離菌株培養(yǎng)液混合20 min，繼續(xù)用雙層平板法培養(yǎng)噬菌體，如此重復(fù)3次。

表1 用于大腸埃希菌鑒定的PCR引物序列

1.3.2 噬菌體電鏡觀察

取純化的噬菌體液20 μL滴在銅網(wǎng)上，靜置10 min，用濾紙?jiān)阢~網(wǎng)側(cè)面吸取剩余的液體，再在銅網(wǎng)上滴2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))磷鎢酸10 μL，同樣吸取剩余液體，靜置干燥后，用飛利浦CM100型透射電鏡在100 kV條件下觀察噬菌體形態(tài)。

1.3.3 噬菌體宿主譜測定

以實(shí)驗(yàn)室保存的25株已分離鑒定的大腸埃希菌和3株標(biāo)準(zhǔn)菌株為指示菌，采用點(diǎn)滴法測定噬菌體宿主譜。首先，將凍存的大腸埃希菌復(fù)蘇培養(yǎng)，取100 μL均勻涂布在TSA平板上，靜置干燥后，在TSA平板背面畫出大小均等的9個(gè)正方形格子并進(jìn)行標(biāo)號，將噬菌體分離株根據(jù)平板標(biāo)號進(jìn)行點(diǎn)滴，每個(gè)噬菌體液10 μL，待干燥后，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，觀察噬菌斑，對細(xì)菌裂解情況進(jìn)行標(biāo)注和統(tǒng)計(jì)。

1.3.4 噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)測定

感染情況下，噬菌體與宿主菌細(xì)胞的數(shù)量比值，即每個(gè)細(xì)胞感染噬菌體的數(shù)目被稱為感染復(fù)數(shù)(MOI)。將滴度約為1.0×10PFU·mL的噬菌體液進(jìn)行連續(xù)稀釋，分別與培養(yǎng)至對數(shù)期的1.0×10CFU·mL的宿主菌按不同比例添加，37 ℃搖床培養(yǎng)，直至噬菌體液滴度為1.0×10、1.0×10PFU·mL的混合物出現(xiàn)澄清液體，滴度為1.0×10、1.0×10PFU·mL的混合物出現(xiàn)少量渾濁液體，滴度為1.0×10、1.0×10PFU·mL的混合物出現(xiàn)渾濁液體為止。將培養(yǎng)物于6 000 r·min離心5 min，收集上清并稀釋，采用雙層平板法測定噬菌體效價(jià)。

1.3.5 噬菌體pH穩(wěn)定性測定

向存有生理鹽水的試管中加入250 μL噬菌體液進(jìn)行10倍稀釋，用稀鹽酸溶液和NaOH溶液將噬菌體稀釋液的pH值分別調(diào)至3、5、7、9，放入37 ℃水浴鍋中靜置1 h。取每個(gè)pH值條件下的噬菌體液100 μL，用雙層平板法測定噬菌體效價(jià)。

1.3.6 噬菌體熱穩(wěn)定性測定

取1 mL純化后的噬菌體液于試管中，分別放置于37、42、50、55、60 ℃的恒溫水浴鍋中，靜置1 h后取出，冰浴冷卻10 min。每個(gè)噬菌體液取100 μL，用雙層平板法測定噬菌體效價(jià)。

1.3.7 噬菌體一步生長曲線測定

首先，將大腸埃希菌分離菌株培養(yǎng)液按1∶100的比例接種于5 mL TSB液體培養(yǎng)基中，當(dāng)菌液濃度達(dá)到1×10CFU·mL時(shí)(≈0.1)，取900 μL菌液與100 μL 1×10PFU·mL的噬菌體液混合，37 ℃恒溫孵育10 min。噬菌體充分吸附細(xì)菌后，6 000 r·min離心5 min，棄去上清液，將白色沉淀用10 mL TSB液體培養(yǎng)基重懸。對重懸后的噬菌體液進(jìn)行100倍稀釋，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)，每隔5 min用雙層平板法測定1次噬菌體效價(jià)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)重復(fù)3次，取噬菌體效價(jià)平均值。以感染時(shí)間為橫坐標(biāo)、噬菌體效價(jià)為縱坐標(biāo)，繪制一步生長曲線，計(jì)算出噬菌體的潛伏期和裂解量。裂解量=平臺(tái)期噬菌體效價(jià)/潛伏期噬菌體效價(jià)。

1.3.8 體外條件下噬菌體對宿主菌的作用效果測定

將噬菌體分離株按最佳MOI(無法擴(kuò)增的噬菌體液過量添加)與處于對數(shù)期的大腸埃希菌分離菌株(≈0.3)混合培養(yǎng)，分別在0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、22、24 h測定值。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸埃希菌分離鑒定結(jié)果

革蘭氏染色鏡檢結(jié)果顯示，分離菌株為革蘭氏陰性桿狀菌，中等大小，單獨(dú)或成組分布，呈無規(guī)則排列，無芽孢(圖1)。分離菌株的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果顯示，16S rRNA基因V3～V6區(qū)的擴(kuò)增片段長584 bp，基因擴(kuò)增片段長384 bp，基因擴(kuò)增片段長224 bp(圖2)。分離菌株可發(fā)酵和利用多種糖醇，如麥芽糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖和山梨醇等，可產(chǎn)生多種酶，如鳥氨酸脫羧酶等(表2)。對20種常用抗生素的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大腸埃希菌ZJE1株對鏈霉素、環(huán)丙沙星敏感，對頭孢噻肟、氟苯尼考和恩諾沙星中度敏感，對其余15種抗生素(包括青霉素、頭孢噻吩、慶大霉素等)均耐藥，為多重耐藥菌(表3)。綜上，確定分離菌株為大腸埃希菌，并將其命名為ZJE1。

2.2 大腸埃希菌分離菌株的致病性

圖1 革蘭氏染色鏡檢結(jié)果Fig.1 Microscopic examination results of Gram stain

M，DL5000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1，16S rRNA基因的V3～V6區(qū)；2，stx基因；3，ipaH基因；4，bfpA基因；5，eaeA基因；6，st基因；7，lt基因；8，aatA基因；9，陰性對照。M， DL5000 marker； 1， V3-V6 region of 16S rRNA； 2， stx gene； 3， ipaH gene； 4， bfpA gene； 5， eaeA gene； 6， st gene； 7， lt gene； 8， aatA gene； 9， Negative control.圖2 大腸埃希菌分離菌株的PCR鑒定結(jié)果Fig.2 PCR identification results of isolated E. coli strain

表2 大腸埃希菌分離菌株的生化鑒定結(jié)果

表3 大腸埃希菌分離菌株的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在感染后的24～48 h，感染組實(shí)驗(yàn)兔精神沉郁，采食量減少；72 h，感染組實(shí)驗(yàn)兔有1只死亡，其他出現(xiàn)不同程度的腹瀉；至7 d，感染組實(shí)驗(yàn)兔有4只死亡，僅1只存活，而對照組實(shí)驗(yàn)兔均健康存活。全部病死兔剖檢顯示：脫水，消瘦，腹瀉病兔肛門有糞便黏附，個(gè)別病兔盲腸出現(xiàn)脹氣，小腸各段病變明顯，腸腔內(nèi)液體黏稠，沒有發(fā)現(xiàn)實(shí)質(zhì)性臟器病變。上述剖檢結(jié)果為感染大腸埃希菌病后典型的腸段炎癥病理變化。對實(shí)驗(yàn)病死兔回腸中的病原菌進(jìn)行PCR檢測，分離菌株均擴(kuò)增出基因和基因，表明ZJE1株對家兔有較強(qiáng)的致病性。

2.3 噬菌體的分離與電鏡觀察

采用雙層平板法，以大腸埃希菌ZJE1為宿主菌分離到4株噬菌體，分別將其命名為噬菌體ZRP2、ZRP3、ZRP4和ZRP5。

電鏡結(jié)果顯示，噬菌體結(jié)構(gòu)由六角形的頭部、可收縮的尾鞘和尾管組成(圖3)。頭部長度約95 nm，直徑約65 nm，尾鞘和尾管長度約為95 nm。初步判定，4株噬菌體均屬有尾噬菌體目肌尾噬菌體科。

圖3 噬菌體ZRP2～ZRP5透射電鏡圖Fig.3 Transmission electron microscope images of bacteriophage ZRP2-ZRP5

2.4 噬菌體分離株的宿主譜與最佳感染復(fù)數(shù)

ZRP2、ZRP3、ZRP4、ZRP5分別可裂解10、9、3、10種供試大腸埃希菌菌株(表4)。相對地，噬菌體ZRP2、ZRP5擁有較寬的宿主范圍。

將分離得到的4株噬菌體與大腸埃希菌ZJE1株分別按照10∶1、1∶1、1∶10、1∶10、1∶10、1∶10的比例混合，測定最佳感染復(fù)數(shù)。結(jié)果顯示，噬菌體ZRP2和ZRP3與宿主菌(ZJE1)的感染比為1∶10時(shí)，擴(kuò)增效率最高(表5)，最佳感染時(shí)間分別為3.5 h和3.0 h；噬菌體ZRP4在液體中并沒有擴(kuò)增；噬菌體ZRP5與宿主菌的感染比為1∶10時(shí)，擴(kuò)增效率最高。

2.5 噬菌體分離株的pH穩(wěn)定性與熱穩(wěn)定性

噬菌體ZRP2-ZRP5在4個(gè)pH值梯度下的效價(jià)結(jié)果顯示：噬菌體ZRP2和ZRP3在pH為7的條件下存活率超過85%，在pH為3、5、9的條件下，噬菌體全部死亡(圖4)；噬菌體ZPR4和ZRP5在pH為7的條件下存活率超過90%，在pH為5的條件下存活率分別為75%和89%，在pH為3和9的條件下，噬菌體全部死亡。

ZRP2-ZRP5在37、42 ℃條件下的存活率接近100%(圖5)。之后，隨著溫度升高，4株噬菌體分離株的存活率均降低：在50 ℃條件下，ZRP2-ZRP5的存活率在55%～70%；在55 ℃條件下，ZRP2-ZRP5的存活率在40%～55%；在60 ℃條件下，ZRP2-ZRP5的存活率急劇下降，不到1%。

2.6 噬菌體分離株的一步生長曲線

一步生長曲線測定結(jié)果顯示：ZRP2的潛伏期為16～19 min，一個(gè)細(xì)胞的噬菌體平均裂解量為150個(gè)噬菌體(圖6)；ZRP3的潛伏期為11～14 min，一個(gè)細(xì)胞的噬菌體平均裂解量為110個(gè)噬菌體；ZRP4的數(shù)量沒有隨著時(shí)間擴(kuò)增；ZRP5的潛伏期為16～19 min，一個(gè)細(xì)胞的噬菌體平均裂解量為170個(gè)噬菌體。

表4 噬菌體宿主譜測定

表5 感染復(fù)數(shù)測定結(jié)果

A，ZRP2；B，ZRP3；C，ZRP4；D，ZRP5。圖4 噬菌體分離株的pH穩(wěn)定性測定結(jié)果Fig.4 Survival rate of isolated bacteriophages under different pH

A，ZRP2；B，ZRP3；C，ZRP4；D，ZRP5。圖5 噬菌體分離株的熱穩(wěn)定性測定結(jié)果Fig.5 Survival rate of isolated bacteriophages under different temperature

2.7 體外條件下噬菌體分離株對宿主菌的作用效果

噬菌體ZRP2～ZRP5感染細(xì)菌1 h內(nèi)，菌液值升高，此時(shí)噬菌體與細(xì)菌相互吸附；噬菌體感染細(xì)菌2～8 h，菌液值總體下降，6 h時(shí)菌液值出現(xiàn)不同程度的浮動(dòng)，噬菌體開始裂解細(xì)菌；噬菌體感染細(xì)菌8 h后，菌液值上升，細(xì)菌開始增長。觀察細(xì)菌裂解和增殖量發(fā)現(xiàn)，噬菌體ZRP4和ZRP5感染后，菌液的平均值顯著(<0.05)低于ZRP2和ZRP3組(圖7)。

A，ZRP2；B，ZRP3；C，ZRP4；D，ZRP5。圖6 噬菌體分離株的一步生長曲線Fig.6 One step growth curve of isolated bacteriophages

圖7 不同時(shí)間的菌液D600值Fig.7 D600 value of strain solution at different time

3 討論

致病性大腸埃希菌是常見的人畜共患致病菌，具有多種血清型，一些菌株的毒力因子能直接引起動(dòng)物腸道感染而引發(fā)痢疾、腹瀉，甚至導(dǎo)致脫水死亡。家兔大腸埃希菌病常引起沙門氏菌、梭菌和球蟲的繼發(fā)感染，導(dǎo)致腸道菌系紊亂。斷奶期幼兔大腸埃希菌病發(fā)病率極高，臨床上常采用抗生素進(jìn)行防治，但抗生素的濫用會(huì)導(dǎo)致耐藥菌株增多，家兔腸道微生物菌群因受到破壞而反復(fù)感染疾病，反而可能會(huì)給兔大腸埃希菌病的預(yù)防和治療帶來更大的挑戰(zhàn)。噬菌體作為細(xì)菌病毒，利用其自身特異性侵染細(xì)菌，并能在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)大量增殖，最終將細(xì)菌滅殺。噬菌體療法是利用噬菌體控制或去除細(xì)菌感染的一種方法，它的抗菌范圍限定于單菌種的某些菌株，對于正常菌群、人體和動(dòng)物細(xì)胞并不造成影響。噬菌體不攜帶宿主毒力基因，繁殖擴(kuò)增效率高，易于獲取和分離，開發(fā)成本低。因此，應(yīng)用噬菌體治療細(xì)菌病具有明顯優(yōu)勢，在替代抗生素治療上具有潛在的應(yīng)用前景。

本研究在浙江某兔場腹瀉病兔腸道樣本中分離到一株大腸埃希菌ZJE1株，用PCR方法擴(kuò)增出了腸致病性大腸埃希菌的基因和基因。致病性檢測發(fā)現(xiàn)，攻毒后72 h，實(shí)驗(yàn)兔出現(xiàn)不同程度的腹瀉和死亡，腸道病理特征與感染大腸埃希菌病后腸段炎癥病理變化一致。研究發(fā)現(xiàn)，基因和基因能黏附于腸上皮細(xì)胞，發(fā)生黏附抹平損傷。這種特異性組織病變是導(dǎo)致宿主腹瀉的普遍原因。這說明，本試驗(yàn)分離到的大腸埃希菌ZJE1株為腸致病性大腸埃希菌。對20種常用抗生素的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大腸埃希菌ZJE1株對鏈霉素、環(huán)丙沙星敏感，提示這2種抗生素可用于治療大腸埃希菌ZJE1株感染，對頭孢噻肟、氟苯尼考和恩諾沙星中度敏感，對其余15種抗生素(包括青霉素、頭孢噻吩、慶大霉素)等均耐藥，為多重耐藥菌。以ZJE1為宿主菌分離到4株噬菌體，分別命名為ZRP2～ZRP5，在電鏡下可明顯觀察到，噬菌體的結(jié)構(gòu)由六角形的頭部，及具有肌病毒科特征的可收縮的尾鞘和尾管組成，與T4噬菌體結(jié)構(gòu)相似。

噬菌體需要具備足夠高的滴度、適宜的pH值和溫度條件以保持其穩(wěn)定的活性，根據(jù)每株噬菌體的最佳感染復(fù)數(shù)和感染時(shí)間來制備高滴度的噬菌體懸液是保證噬菌體治療效果的前提。對分離到的噬菌體進(jìn)行最佳感染復(fù)數(shù)、pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性檢測，其中，噬菌體ZRP2和ZRP3與宿主菌的最佳感染復(fù)數(shù)最低，為1∶10。噬菌體經(jīng)口服用于預(yù)防與治療時(shí)，可能會(huì)受胃酸等外界條件的影響而導(dǎo)致其活性下降。經(jīng)檢測，噬菌體ZRP4、ZRP5在pH值為5～7的條件下能保持較高的活性，噬菌體ZRP2、ZRP3僅在pH值為7的條件下能保持較高的活性，在pH值為3和9的條件下不能存活。這說明，噬菌體在應(yīng)用時(shí)，需解決酸性環(huán)境下的穩(wěn)定性問題，且噬菌體混合物內(nèi)各株噬菌體應(yīng)有獨(dú)立表征，以廣泛適應(yīng)不同的環(huán)境。已有研究表明，噬菌體治療可通過抗酸劑和微囊化包被等方法來增加到達(dá)腸道的噬菌體數(shù)量。另外，將噬菌體混合物保存于含有0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))碳酸鈣的Tris-SM噬菌體稀釋溶液中，經(jīng)口服后，也可從糞便中回收到高滴度的噬菌體。

噬菌體的宿主特異性主要取決于其尾部蛋白gp37專一性結(jié)合細(xì)菌表面受體，這些受體以蛋白質(zhì)、多糖和脂多糖形式存在于宿主菌細(xì)胞壁、莢膜、菌毛或鞭毛上，對噬菌體的特異性識別起重要作用。本研究對噬菌體的宿主譜進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，ZRP2和ZRP5具有廣泛的宿主范圍，對受試的28種大腸埃希菌菌株(含3株標(biāo)準(zhǔn)菌株)中的10種具有靶向性，其中，ZRP2對1株標(biāo)準(zhǔn)菌株、3株腸侵襲性大腸埃希菌、2株非致病性大腸埃希菌和4株腸致病性大腸埃希菌敏感，ZRP5對1株腸侵襲性大腸埃希菌、8株腸致病大腸埃希菌和1株標(biāo)準(zhǔn)菌株敏感。大腸埃希菌的菌株具有多樣性，可考慮使用多種噬菌體的混合物來彌補(bǔ)某些噬菌體宿主譜窄的問題。

本研究篩選的4種噬菌體均可作為大腸埃希菌病防治的候選劑，其中，ZRP5的效價(jià)高，宿主范圍廣，在噬菌體治療中可優(yōu)先選擇。