黃靈芝，姜廣澤，丁艷菲，朱 誠，*

(1.中國計量大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，浙江省特色農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)及危害物控制技術(shù)重點實驗室，浙江 杭州 310018； 2.杭州迪安醫(yī)學(xué)檢驗中心有限公司，浙江 杭州 310030)

近年來我國乳飲料行業(yè)迅猛發(fā)展，以核桃乳為代表的植物蛋白飲料產(chǎn)量、銷量成快速增長態(tài)勢。核桃乳是采用現(xiàn)代工藝、科學(xué)加工而成，不僅口感細膩、營養(yǎng)豐富，還是多種微量元素的良好來源，具有健胃、補血等功效，在我國一直屬于暢銷產(chǎn)品。然而，核桃乳摻雜使假現(xiàn)象層出不窮，手段和方式五花八門，檢測和鑒定困難重重，因過敏源成分不明對消費者的人身健康構(gòu)成威脅，影響乳飲料產(chǎn)業(yè)穩(wěn)定發(fā)展。因此，急需建立一種快捷、準(zhǔn)確的真?zhèn)舞b定方法。DNA條形碼(DNA barcoding)是一種新型的物種鑒定技術(shù)，它利用標(biāo)準(zhǔn)的短基因區(qū)域作為標(biāo)記對物種進行快速、準(zhǔn)確和高效鑒定。近年來DNA條形碼已廣泛應(yīng)用于中草藥、水產(chǎn)品與加工食品等多領(lǐng)域的物種鑒定。Stoeckle等構(gòu)建了茶飲料通用條形碼和，并對涼茶進行鑒定。李梅閣利用DNA條形碼技術(shù)對漿果及其果汁飲料進行了種源物種真?zhèn)舞b定。但是目前基于DNA條形碼技術(shù)的核桃乳飲料真?zhèn)舞b定尚缺乏研究。

高質(zhì)量的核桃乳DNA對開展核桃乳DNA條形碼真?zhèn)舞b定尤為重要。核桃乳屬于深加工食品，繁瑣的加工過程使種源物種核桃的DNA嚴(yán)重破壞降解，且富含多種次生物質(zhì)，DNA提取更加困難。國外至今尚無對核桃乳DNA提取方法的報道，有關(guān)乳制品DNA提取方法相關(guān)研究集中在牛奶、羊乳上。Psifidi等在基于PCR的綿羊乳基因分型研究中比較分析了6種提取綿羊乳DNA的方法。Usman等通過比較2種改良試劑盒和1種傳統(tǒng)試劑提取方法，得到了適合大量牛奶DNA提取的試劑盒方法。郭梁等通過比較3種DNA提取方法，得到適合乳制品DNA提取的試劑盒方法。總結(jié)國內(nèi)外文獻關(guān)于乳飲料DNA提取方法的研究，將DNA提取方法分為傳統(tǒng)試劑CTAB方法、試劑盒方法與改良試劑盒方法。任君安等對果蔬汁飲料DNA提取方法做了研究，通過比對CTAB與植物DNA提取試劑盒方法，得到了改良試劑盒方法。韓晴等在利用植物DNA條形碼技術(shù)對杏仁露中花生源性成分鑒別的研究中，采用改良深加工食品試劑盒方法，得到具備擴增條件的杏仁露DNA。楊碩等采用植物核酸提取試劑盒得到核桃乳DNA，質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為10～40 ng·μL，/為1.6～2.2。上述方法提取的DNA濃度偏低，純度不高，質(zhì)量不佳。因此，本研究篩選得到核桃乳DNA提取最佳預(yù)處理方式，比較不同核桃乳DNA提取方法，篩選出適合核桃乳DNA高質(zhì)量提取的最佳組合方法。在此基礎(chǔ)上，設(shè)計針對核桃的特異性基因--，對樣本進行核桃乳成分鑒定；并選取常見植物候選DNA條形碼基因-，測序比對以完成核桃乳摻假鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從國內(nèi)市場購得國內(nèi)一二線城市在售的10種核桃乳和10種堅果。該10種核桃乳中的核桃含量基本一致，均有蛋白沉淀，但色澤不同。每種樣品各取3個生物學(xué)重復(fù)，且隨機排序并編號(1～30)。10種堅果分別為核桃、腰果、巴旦木、夏威夷果、碧根果、榛子、杏仁、大豆、花生、松子。樣品置于4 ℃保存。

十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、乙二胺四乙酸(EDTA)、Tris-HCl、氯化鈉(NaCl)、異丙醇、Tris飽和酚、氯仿購于杭州米克化工儀器有限公司；康為新型植物基因組DNA提取試劑盒(簡稱康為試劑盒)購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，愛思進植物基因組DNA提取試劑盒(簡稱愛思進試劑盒)購于愛思進康寧生命科學(xué)有限公司，天根深加工食品DNA提取試劑盒(簡稱天根試劑盒)購于天根生化科技(北京)有限公司；核酸染料goldview購于北京莊盟國際生物基因科技有限公司，低電滲瓊脂糖購于生工生物工程(上海)股份有限公司；普通PCR試劑盒ExPrimix和DNA marker購于寶生物工程(大連)有限公司。引物與測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2 儀器與設(shè)備

快速PCR儀，AnalytikJenaAG德國耶拿；電泳儀與凝膠成像系統(tǒng)，上海天能，EPS300，5200Multi；冷凍離心機，美國BeckmanCoulter，Microfuge20R；真空凍干儀，美國LABCONCO FreeZone2.5Plus；微量核酸蛋白測定儀，杭州奧盛儀器，Nanodrop-100。

1.3 方法

1.3.1 核桃乳與堅果DNA提取

預(yù)處理方法篩選。方法1(靜置抽提)：核桃乳靜置30 min，底部吸取0.5 mL沉淀乳直接提取。方法2(異丙醇沉淀)：吸取1 mL核桃乳，加入等體積異丙醇，混合均勻，沉淀10 min，室溫12 500×離心5 min，棄上清后重復(fù)操作1次，所得沉淀進行DNA提取。方法3(抽真空凍干)：將核桃乳混勻后分裝至一次性培養(yǎng)皿，真空凍干機冷凍48 h，所得干粉進行DNA提取。利用國家食品藥品監(jiān)督管理總局《植物蛋白飲料中植物源性成分鑒定》中的方法，分別對不同預(yù)處理的核桃乳進行DNA提取。

DNA提取方法比較。采用微量提取，每種方法對每個樣品進行3次重復(fù)實驗。對6種DNA提取方法進行比較，分別為2種CTAB裂解沉淀方法、3種試劑盒方法和CTAB與愛思進試劑盒結(jié)合方法。其中，2種CTAB裂解沉淀方法依照參考文獻和國家標(biāo)準(zhǔn)方法操作，CTAB方法1參照《果蔬汁飲料DNA提取方法比較研究》的方法；CTAB方法2根據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理總局《植物蛋白飲料中植物源性成分鑒定》提供的植物蛋白飲料DNA提取方法。3種試劑盒方法分別為康為試劑盒、愛思進試劑盒和天根試劑盒，操作流程以說明書為準(zhǔn)。CTAB與愛思進試劑盒結(jié)合方法詳細步驟如下：

1)稱取真空凍干樣品100 mg至研缽中，加液氮輕輕研磨，將研缽放于56 ℃水浴至樣品粉末剛開始融化，加入500 μL預(yù)熱的改良CTAB裂解液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)3% CTAB、0.1 mol·LTris-HCl，pH調(diào)控為8.0，0.02 mol·LEDTA，1.4 mol·LNaCl，體積分?jǐn)?shù)0.2%-巰基乙醇，質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%聚乙烯吡咯烷酮)、4 μL RNaseA和10 μL Proteinase K(20 mg·mL)，混合成乳液，轉(zhuǎn)移至滅菌的2 mL Eppordorf管中，加入300 μL Buffer C-L，漩渦振蕩30 s。

2)56 ℃水浴孵育2 h，其間每隔5～10 min上下顛倒振蕩1次，裂解至越澄清越好。

3) 加入500 μL Tris飽和酚∶氯仿∶異戊醇(體積比25∶24∶1)，混勻，加入500 μL Buffer P-D，輕輕振蕩1 min，室溫抽提10 min，12 500×離心10 min，離心溫度15 ℃。

4)將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的氯仿∶異戊醇(體積比24∶1)，充分混勻，靜置5 min，12 500×離心8 min。

5)將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加0.8倍體積的異丙醇(4 ℃ 冰箱預(yù)冷)，輕輕混合均勻，-20 ℃冰箱靜置20 min，12 500×離心10 min，棄上清液，保留沉淀。

6)加入500 μL的70%乙醇，上下顛倒，充分洗滌。12 500×g離心3 min，棄上清，加入500 μL的無水乙醇，上下顛倒，充分洗滌，12 500×g離心3 min。

7)用濾紙吸干多余水分，在超凈臺吹干或室溫晾干。加入50 μL預(yù)熱洗脫緩沖液TE，靜置15 min。測DNA濃度與質(zhì)量。

堅果DNA提取。堅果經(jīng)液氮研磨成粉末后取0.1 g，采用CTAB沉淀法提取DNA。

基因組DNA純度和濃度檢測。利用NanoDrop Lite微量核酸蛋白測定儀測定以上不同方法提取的核桃乳DNA，由/和濃度(ng·μL)判定DNA的純度和濃度；通過瓊脂糖凝膠電泳檢測所提DNA片段質(zhì)量。

1.3.2 PCR擴增與產(chǎn)物測序

采用文獻報道植物通用基因-03對不同方法所提核桃乳DNA進行PCR擴增，檢測所提DNA是否具備擴增條件。依據(jù)常見植物候選DNA條形碼基因-，設(shè)計核桃物種特異性基因--對10種核桃乳樣品DNA進行PCR擴增，對樣本進行造假情況鑒定。利用常見植物候選DNA條形碼基因-對10種市售核桃乳樣品DNA進行PCR擴增，對樣本進行摻假情況鑒定。引物序列見表1。

PCR擴增采用25 μL體系：12.5 μL的ExPrimix，正反引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，無菌水10.5 μL。PCR程序為：95 ℃預(yù)變性5 min，共35個循環(huán)(95 ℃變性30 s、退火30 s、72 ℃延伸30 s)；72 ℃終延伸10 min，最后4 ℃保溫。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠進行電泳，并由生工生物工程(上海)股份有限公司進行雙向測序。將測序結(jié)果在NCBI上進行BLAST比對，利用DNA條形碼分析鑒定核桃乳是否摻假。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃乳最佳預(yù)處理方法

核桃乳是深加工食品，DNA破壞嚴(yán)重。所得大部分DNA片段小，部分長片段DNA因濃度低，電泳圖上無清晰完整條帶。3種預(yù)處理方法DNA電泳圖差異明顯(圖1)，方法1靜置沉淀方式處理后所得DNA只有個別存在DNA小片段，方法2異丙醇離心方式處理所提DNA全部呈現(xiàn)降解彌散狀，方法3抽真空凍干方式所提DNA存在明顯小片段。由表2可以看出，方法1與方法2的濃度高低不均，/普遍超出DNA標(biāo)準(zhǔn)范圍；方法3測定的濃度符合擴增要求且純度值接近DNA標(biāo)準(zhǔn)值1.80。因此，方法3抽真空凍干預(yù)處理方式最適合用于核桃乳DNA提取。

表1 基因引物序列

M，10 000 bp DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)；N，空白對照；方法1，靜置沉淀；方法2，異丙醇沉淀；方法3，抽真空凍干；1～30，核桃乳樣品編號1～30。M， 10 000 bp DNA marker； N， Negative； Method 1， Static extraction； Method 2， Isopropanol precipitation； Method 3， Vacuum lyophilization； 1-30： Sample serial number 1-30.圖1 三種不同預(yù)處理方法提取的核桃乳DNA電泳圖Fig.1 DNA electrophoresis of walnut milk extracted by three different pre-treatment methods

表2 三種預(yù)處理方法提取的核桃乳DNA濃度和純度

2.2 六種DNA提取方法的比較結(jié)果

分別采用CTAB方法1、CTAB方法2、康為試劑盒、愛思進試劑盒、天根試劑盒和CTAB與愛思進試劑盒結(jié)合這6種方法，對真空凍干預(yù)處理的核桃乳進行DNA提取，并進行瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果(圖2)顯示，天根試劑盒方法和CTAB與愛思進試劑盒結(jié)合2種方法所提核桃乳DNA質(zhì)量優(yōu)于其他方法，尤其是CTAB與愛思進試劑盒結(jié)合方法，所提DNA條帶明亮且片段長，相對完整性好。表3顯示：CTAB與愛思進試劑盒結(jié)合方法所得DNA純度最高，最接近DNA標(biāo)準(zhǔn)值1.80，且濃度高于其他3種試劑盒方法；CTAB方法1雖濃度高，但純度差。利用植物通用基因-03對6種方法所提核桃乳DNA進行PCR擴增，擴增結(jié)果如圖3所示。與其他提取方法比較，CTAB與愛思進試劑盒結(jié)合方法、天根試劑盒方法提取的核桃乳DNA的擴增效率較高。其中，CTAB與愛思進試劑盒結(jié)合方法所提核桃乳DNA在123 bp處有明顯條帶，條帶單一且無引物二聚體，與-03基因片段大小相符，擴增效率為100%，符合DNA條形碼后期實驗擴增要求。因此，CTAB與愛思進試劑盒結(jié)合方法為核桃乳DNA的最佳提取方法。

M，10 000 bp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；N，空白對照；1，樣品編號1-3；2，樣品編號4-6；3，樣品編號7-9；4，樣品編號10-12；5，樣品編號13-15；6，樣品編號16-18；7，樣品編號19-21；8，樣品編號22-24；9，樣品編號25-27；10，樣品編號28-30。M， 10 000 bp DNA marker； N， Negative； 1， Sample serial number 1-3； 2， Sample serial number 4-6； 3， Sample serial number 7-9； 4， Sample serial number 10-12； 5， Sample serial number 13-15； 6， Sample serial number 16-18； 7， Sample serial number 19-21； 8， Sample serial number 22-24； 9， Sample serial number 25-27； 10， Sample serial number 28-30.圖2 六種方法提取核桃乳DNA電泳圖Fig.2 DNA extraction of walnut milk by six methods

表3 六種方法提取核桃乳DNA濃度與純度(n=3)

M，500 bp DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)；N，空白對照；編號1-10同圖2。圖5同。M， 500 bp DNA marker； N， Negative； Numbers 1-10 were the same as in figure 2. The same as figure 5.圖3 六種方法提取核桃乳CP-03基因擴增結(jié)果Fig.3 Amplication results of CP-03 gene from walnut milk by six methods

2.3 核桃物種特異性基因psbA-trnH-wal鑒定結(jié)果

對樣本進行核桃乳成分鑒定，設(shè)計核桃物種特異性引物Wal-F和Wal-R，對10種不同品牌核桃乳和10種堅果的DNA樣品進行PCR擴增，3次生物學(xué)重復(fù)。結(jié)果顯示，10種堅果(圖4-A)中只在核桃的3組DNA樣本(樣品編號1-3)中有擴增條帶，說明引物特異性良好；10種核桃乳(圖4-B)中有29個DNA樣品中有擴增條帶，第25號樣品沒有擴增出條帶，第26和27號成功擴增出條帶，說明該樣品含有核桃成分；而第25號樣品可能在實驗操作上出現(xiàn)了問題，故沒有擴增出條帶。表明這10種核桃乳均含有核桃成分。

2.4 常見植物候選基因psbA-trnH鑒定和測序比對結(jié)果

為了驗證核桃乳是否存在摻假行為，以CTAB與愛思進試劑盒結(jié)合方法提取的10種品牌30個核桃乳DNA為模板，分別用DNA條形碼基因-進行PCR擴增檢測，并將產(chǎn)物進行測序。核桃乳DNA均能擴增出單一且清晰、長度為350 bp的目的條帶(圖5)。將擴增序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST分析，結(jié)果顯示，絕大部分核桃乳樣品(1-21號、25-30號)測序比對結(jié)果為核桃，與標(biāo)簽中的優(yōu)質(zhì)核桃仁相符。22-24號品牌標(biāo)簽為優(yōu)質(zhì)核桃仁，但是其DNA擴增測序比對結(jié)果為花生，比對結(jié)果相似度為100%，與標(biāo)簽標(biāo)注的原材料不一致，存在標(biāo)簽錯誤標(biāo)注行為。

M，500 bp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；N，陰性對照。圖A中：1～3，核桃；4～6，腰果；7～9，巴旦木；10～12，夏威夷果；13～15，碧根果；16～18，榛子；19～21，杏仁；22～24，大豆；25～27，花生；28～30，松子。圖B中：1-30為核桃乳樣品編號，同表2。M， 500 bp DNA marker； N， Negative； In figure A： 1-3， Walnuts； 4-6， Cashews； 7-9， almonds； 10-12， Queensland nuts； 13-15， Pecans； 16-18， Hazelnuts； 19-21， Apricots； 22-24， Soybeans； 25-27， Peanuts； 28-30， Pine nuts. In figure B， 1-30 were sample serial number of walnut milk， and were the same as in Table 2.圖4 十種堅果和十種核桃乳樣品的特異性引物Wal-F和Wal-R PCR擴增結(jié)果Fig.4 PCR amplification results of 10 kinds of nuts and 10 kinds of walnut milk samples using specific primer Wal-F and Wal-R

圖5 核桃乳DNA條形碼基因psbA-trnH的PCR擴增結(jié)果Fig.5 PCR amplification results of DNA barcode gene psbA-trnH of walnut milk

3 討論

目前食品真?zhèn)蔚蔫b定已從傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)發(fā)展到依賴蛋白質(zhì)和DNA序列分析的分子生物學(xué)方法。在飲料真?zhèn)舞b定中應(yīng)用蛋白質(zhì)檢驗的主要方法包括免疫學(xué)檢測、新型電泳和質(zhì)譜色譜技術(shù)。這些技術(shù)雖然在檢測新鮮產(chǎn)品時非常有效，但應(yīng)用于深度加工食品時效率較低。而以DNA為基礎(chǔ)的方法可以對殘存量非常低的有機原料進行提取和鑒定，目前，該方法已應(yīng)用于對多種食品材料組合的檢測。DNA條形碼技術(shù)是利用一段或幾段標(biāo)準(zhǔn)DNA序列實現(xiàn)動物、植植物和真菌物種快速鑒定的方法，彌補了傳統(tǒng)鑒定方法的不足，具有檢測范圍廣、操作簡單、準(zhǔn)確度高、鑒別效率高、信息化等優(yōu)點。DNA條形碼技術(shù)已廣泛應(yīng)用于食品等各個領(lǐng)域的鑒定。Lee等利用DNA條形碼技術(shù)對茶的品種與來源進行了鑒定。Uncu等利用DNA條形碼基因?qū)﹂蠙煊蛽郊龠M行了研究，結(jié)果表明，利用DNA條形碼技術(shù)可對植物油中植物源成分進行鑒定?？梢妵庵饕羌性诓枧c油產(chǎn)品，而對植物蛋白飲料尚未進行真?zhèn)舞b定研究。

表4 psbA-trnH基因擴增序列比對結(jié)果

高質(zhì)量的DNA是進行DNA條形碼鑒定研究的基礎(chǔ)。目前乳、飲料類食品的DNA提取方法主要分為傳統(tǒng)試劑法與商業(yè)試劑盒兩種方法。商業(yè)化的植物DNA提取試劑盒有適用范圍廣、時間短和操作簡單的優(yōu)點，但不同食品尤其是深加工食品對試劑盒的適用性不同，所提DNA質(zhì)量存在明顯差異。夏義苗等通過對大豆油不同DNA提取方法進行比較分析，總結(jié)有益經(jīng)驗，得到大豆油最佳提取方法。不同的加工工藝對食品DNA提取也存在不同程度的影響。深加工食品核桃乳DNA破壞嚴(yán)重，多糖多酚與色素生物堿等次生物質(zhì)的存在提高了DNA提取難度。多酚能被氧化褐變，與DNA結(jié)合形成不可逆復(fù)合物，使最終提取的DNA呈褐色現(xiàn)象，降低DNA活性。為了防止酚類褐變，本研究在CTAB裂解液中加入β-巰基乙醇。選擇合適濃度的NaCl可以增加多糖在乙醇中的溶解度，避免與DNA產(chǎn)生共沉淀現(xiàn)象，從而除去DNA中的多糖物質(zhì)。增加乙醇洗滌力度，以求最大程度去除雜質(zhì)?？紤]到試劑盒吸附柱無法存留小片段DNA，采用離心沉淀方法代替吸附柱。本研究從靜置抽提、異丙醇沉淀、抽真空凍干3種不同預(yù)處理方式中，篩選得到了抽真空凍干方法為核桃乳DNA提取的最佳預(yù)處理方式。并選擇6種DNA提取方法或試劑盒進行實驗，其中，愛思進試劑盒是一種多源植物基因組DNA提取試劑盒，利用特殊的裂解液C-L和沉淀緩沖液P-D，能有效地把蛋白質(zhì)、色素、碳水化合物和脂質(zhì)與基因組DNA分開，DNA制備膜會選擇性吸附DNA，所提取的DNA雜質(zhì)少，從而達到基因組DNA純化目的。但愛思進試劑盒存在裂解能力弱的缺點，而CTAB裂解沉淀方法正好可以彌補此弱點，故在此基礎(chǔ)上利用CTAB與愛思進試劑盒結(jié)合方法來提取核桃乳的DNA。結(jié)果顯示，CTAB與愛思進試劑盒結(jié)合的新方法能夠得到高質(zhì)量的核桃乳DNA，純度值在1.7～1.9，濃度在60～140 ng·μL，且擴增效率好，符合DNA條形碼對核桃乳目的種源成分真?zhèn)舞b定的后續(xù)實驗要求。

-序列是植物分子系統(tǒng)發(fā)育研究中常用且可靠的葉綠體條形碼基因，有著較快的進化速率和較高的物種鑒別效率。Sun等利用7個候選DNA條形碼對44個金銀花及其近源物種進行鑒定，發(fā)現(xiàn)-鑒定效率高達100%。本研究利用DNA條形碼基因-對10種核桃乳DNA進行PCR擴增測序檢測。擴增測序結(jié)果顯示10種核桃乳樣品中有1款核桃乳成分測序比對結(jié)果為花生，該樣品屬于摻假產(chǎn)品。

4 結(jié)論

抽真空凍干方法為核桃乳DNA提取的最佳預(yù)處理方式，CTAB與愛思進試劑盒結(jié)合的方法更適合從核桃乳中提取DNA。利用自行設(shè)計的特異性基因--鑒定核桃乳樣品中是否含有核桃成分，確定造假情況；選擇常見植物候選基因-鑒定核桃乳樣品中是否含有其他成分，確定摻假情況?；?基因的DNA條形碼建立的核桃乳摻假造假鑒定方法，可以在植物蛋白飲料的鑒定應(yīng)用中貢獻綿薄之力。