程 捷， 龔亞菊， 杜光輝， 蔚亞楠， 黎志彬， 鮑 銳， 桂 敏， 吳麗艷

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所， 昆明 650205； 2.云南大學(xué)資源植物研究院， 昆明 650500)

sequence; 5 SrDNA; 18 SrDNA

蒜芥茄(SolanumsisymbriifoliumLam.)為茄科、茄屬植物，一年生草本，屬于野生茄的一種，主要分布于我國(guó)廣西和云南，目前在云南省已淪為野生[1]。研究表明，蒜芥茄對(duì)青枯病[2]、黃萎病[3]和根結(jié)線蟲[4]等病蟲害具有較強(qiáng)的抗性，與栽培茄存在一定的遠(yuǎn)緣雜交不親和，在生產(chǎn)中可作為嫁接砧木。然而，目前就蒜芥茄染色體核型相關(guān)的研究較少，其染色體倍性及其在茄科中的分類地位尚不清楚。因此，對(duì)蒜芥茄的染色體進(jìn)行核型分析，明確其在茄科作物中的近緣物種及關(guān)系，將對(duì)蒜芥茄價(jià)值和功能的闡明有一定作用。

染色體核型分析是細(xì)胞遺傳學(xué)研究的基本方法，是研究物種演化、分類以及染色體結(jié)構(gòu)、形態(tài)與功能之間關(guān)系所不可缺少的重要手段。熒光原位雜交技術(shù)FISH(Fluorescence in situ hybridization)是利用熒光標(biāo)記的特異寡聚核苷酸片段作為探針，與DNA進(jìn)行雜交，檢測(cè)已知基因或序列在染色體上定位的方法。相比于傳統(tǒng)的核型分析，F(xiàn)ISH可以通過熒光標(biāo)記識(shí)別信號(hào)位點(diǎn)，更快速準(zhǔn)確地檢測(cè)出染色體的特征；在染色體數(shù)目較多、形態(tài)較為相似的物種中應(yīng)用優(yōu)勢(shì)較大，操作簡(jiǎn)便，探針標(biāo)記穩(wěn)定，可同時(shí)檢測(cè)幾種不同探針。FISH技術(shù)已在小麥[5]、玉米[6]、煙草[7]等多個(gè)作物上得到了成功應(yīng)用。

rDNA即核糖體DNA，分為5 SrRNA、5.8 SrRNA、18 SrRNA、28 SrRNA四種類型，其中，5 SrRNA和18 SrRNA常作為探針。5 SrDNA具有串聯(lián)組織且高拷貝的特性，適合作為標(biāo)記來確定染色體核型[8]。18 SrDNA序列是生物中較為保守的序列，常用于生物分類分析。端粒是位于染色體末端的雙鏈DNA重復(fù)序列，能夠維護(hù)染色體的穩(wěn)定，避免染色體之間的末端融合及DNA酶的降解[9]。幾乎所有高等植物的端粒都是由端粒重復(fù)序列(TTTAGGG)n組成[10]。

目前，關(guān)于茄子核型分析的研究較少，只有部分茄子品種的核型被報(bào)道[11-12]?；诖?，本研究以蒜芥茄為試驗(yàn)材料，應(yīng)用端粒保守重復(fù)序列(TTTAGGG)6、5 SrDNA和18 SrDNA作為探針，對(duì)蒜芥茄根尖細(xì)胞有絲分裂中期的染色體進(jìn)行熒光原位雜交檢測(cè)和分析，明確蒜芥茄染色體核型，以期為蒜芥茄的系統(tǒng)研究和雜交育種奠定理論基礎(chǔ)，并為茄子及其近緣野生種的分類學(xué)和細(xì)胞學(xué)研究提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料蒜芥茄由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所收集保存。

1.2 方 法

1.2.1材料準(zhǔn)備

蒜芥茄種子在55 ℃溫水中浸泡15 min，無菌水沖洗后，在500 mg/L的赤霉素(GA3)中浸泡4 h，無菌水沖洗2～3次后，將種子放于鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿(直徑為9 cm)中，置于28 ℃光照培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)至生根。切取生根的蒜芥茄萌發(fā)幼苗，將其根尖放入0.5 mL頂端扎孔的離心管中，并放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2染色體制片

蒜芥茄根尖染色體制片采用武江等[13]的方法并加以改進(jìn)，具體操作過程如下：

1) 將裝有根尖的離心管置于充氣罐內(nèi)，充入0.9～1.0 MPa的笑氣(N2O)，靜置處理2 h。

2) 笑氣處理后立即在冰浴條件下將預(yù)冷的90%冰乙酸加入離心管內(nèi)，靜置處理10 min。固定后，將冰乙酸吸出，并用ddH2O清洗2次。

（3）由于研究設(shè)備缺乏，現(xiàn)階段研究成果還未得到驗(yàn)證。由于現(xiàn)實(shí)情況的限制，諸多研究結(jié)果無法直接作用于實(shí)際工程建設(shè)。

3) 用刀片將根尖白色部分切下，放入裝有25 μL酶液(纖維素酶與果膠酶3∶1混合)的0.5 mL離心管中，37 ℃水浴條件下酶解1～2 h。

4) 酶解結(jié)束后，用70%的酒精將根尖清洗3次，再用解剖針將根尖在剩余酒精中充分破碎，震蕩，4 000 r/min離心后，晾干剩余酒精。

5) 根據(jù)根尖數(shù)量，在離心管內(nèi)加入25～45 μL的冰乙酸，瞬時(shí)離心后，充分震蕩混勻。將潔凈的載玻片放置在濕潤(rùn)的盒子中，吸取8 μL混勻的細(xì)胞懸浮液，在載玻片正上方滴下后立即將盒子蓋上，直到細(xì)胞散開，再將載玻片晾干后取出。

6) 將制成的染色體標(biāo)本在普通光學(xué)顯微鏡下鏡檢，找到目標(biāo)分裂相保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3熒光原位雜交

選擇端粒保守重復(fù)序列、5 SrDNA和18 SrDNA作為探針，與蒜芥茄染色體標(biāo)本進(jìn)行熒光原位雜交，采用缺口平移法標(biāo)記探針，端粒保守重復(fù)序列為合成的(TTTAGGG)6序列，5 SrDNA探針為質(zhì)粒pTa 794[14]，18 SrDNA探針為質(zhì)粒pBR 322[15]。

1) 探針標(biāo)記。用端粒保守重復(fù)序列(橙色)，5′FAM(綠色，羧基熒光素)，TAMRA(紅色，四甲基羅丹明)標(biāo)記的dUTP進(jìn)行標(biāo)記。探針標(biāo)記各成分為：labeled dUTP 4 μL、DNA 1 μg、ddH2O 16 μL，總體系為20 μL。探針標(biāo)記過程避光，將各成分離心混勻，放入16 ℃水浴鍋過夜。

2) 原位雜交。將50～100 mL的70%甲酰胺溶液滴在染色體制片上，蓋上蓋玻片，放入80 ℃雜交箱處理2 min。迅速甩掉蓋玻片，依次放入-20 ℃預(yù)冷的70%、95%、100%的酒精中各處理5 min。取出后，自然風(fēng)干。將配好的雜交液[由7.5 μL去離子甲酰胺，1.5 μL 20×SSC，1.5 μL ssDNA(鮭魚精DNA)，1.5 μL B-DNA(封阻DNA)，3 μL 50%DS(葡聚糖)和1 μL Probe(探針)組成]瞬時(shí)離心，放入80 ℃雜交箱變性8～10 min，迅速取出離心管，放入冰水混合物中處理5 min以上。將雜交液滴在載玻片上，輕輕蓋上蓋玻片，避免產(chǎn)生氣泡，用指甲油封住蓋玻片四周。將載玻片放入濕潤(rùn)盒內(nèi)，在37 ℃雜交箱中雜交過夜。

注：a為端粒的DAPI染色；b為5 SrDNA和18 SrDNA熒光雜交；圖中標(biāo)尺5 μm。圖1 蒜芥茄端粒保守重復(fù)序列、5 SrDNA位點(diǎn)(紅色信號(hào))和18 SrDNA位點(diǎn)(綠色信號(hào))及其染色體分布Fig.1 Conserved telomere repeat sequence,5 SrDNA sites (red signal),18 SrDNA sites (green signal) and chromosome distribution of S. sisymbriifolium Lam

4) 鏡檢。將制片在Olympus BX 70熒光顯微鏡的DP 70 CCD下鏡檢拍照。

1.2.4染色體核型數(shù)據(jù)的處理和分析

選取30個(gè)染色體分散較好的細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)各細(xì)胞染色體數(shù)目。選取5個(gè)清晰的細(xì)胞的染色體中期圖片，利用Photoshop軟件對(duì)每一組染色體的全長(zhǎng)、長(zhǎng)臂和短臂進(jìn)行測(cè)量，取其平均值，計(jì)算染色體長(zhǎng)度、臂比等。核型分析參照李懋學(xué)和陳瑞陽[16]、李懋學(xué)和張贊平[17]的方法，核型模式圖的繪制按照喬永剛和宋蕓[18]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒜芥茄染色體熒光原位雜交結(jié)果

端粒保守重復(fù)序列的DAPI染色結(jié)果(圖1 a)表明，細(xì)胞染色體數(shù)目為24，端粒序列(綠色熒光)位于染色體兩端，未發(fā)現(xiàn)染色體異常的細(xì)胞。蒜芥茄染色體的5 SrDNA和18 SrDNA定位結(jié)果(圖1 b)表明，蒜芥茄染色體上具有1對(duì)5 SrDNA雜交位點(diǎn)(紅色信號(hào))和1對(duì)18 SrDNA雜交位點(diǎn)(綠色信號(hào))。

2.2 蒜芥茄核型分析

通過對(duì)蒜芥茄染色體長(zhǎng)度、長(zhǎng)臂和短臂等數(shù)據(jù)進(jìn)行測(cè)量、統(tǒng)計(jì)和分析可知(見表1)，蒜芥茄染色體相對(duì)長(zhǎng)度變幅為6.95%～9.88%，著絲粒指數(shù)在40.28%～48.67%之間；染色體臂比值在1.05～1.48之間，為中部著絲粒染色體(m)；最長(zhǎng)染色體與最短染色體之比為1.42，核型不對(duì)稱系數(shù)為54.73%，核型不對(duì)稱性屬1 A型；核型公式為：2 n=2 x=24=24 m(2 SAT)。

表1 蒜芥茄染色體的核型參數(shù)Table 1 Karyotype parameters of the chromosome in S. sisymbriifolium Lam

按總長(zhǎng)度由長(zhǎng)至短，對(duì)染色體進(jìn)行排列與編號(hào)，繪制核型模式圖(見圖2)。結(jié)合2.1中熒光原位雜交結(jié)果可知，蒜芥茄染色體上的5 SrDNA雜交位點(diǎn)，位于第10組染色體短臂的近端部上；隨體和18 SrDNA雜交位點(diǎn)，均位于第11組染色體上。

圖2 蒜芥茄染色體核型模式Fig.2 Chromosome karyotype pattern of S. sisymbriifolium Lam

3 討 論

染色體核型分析可確定染色體的整體特征，有助于物種間親緣關(guān)系的分析，揭示其遺傳進(jìn)化的過程和機(jī)制，也是分析生物染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)變異的基本手段之一。茄科植物雖然在起源分類、遺傳育種及栽培生理等方面研究深入，但有關(guān)染色體核型分析也僅限于個(gè)別種，種間的比較分析更少。本研究首次進(jìn)行蒜芥茄染色體的核型分析，可為其遺傳進(jìn)化提供細(xì)胞學(xué)上的理論依據(jù)，還可為其遠(yuǎn)緣雜交奠定理論基礎(chǔ)。

端粒是位于染色體末端能夠保護(hù)染色體維持其穩(wěn)定性的特殊DNA-蛋白復(fù)合物，與細(xì)胞分裂、衰老及壽命都有著緊密的聯(lián)系。由于端粒相關(guān)序列在同一生物的不同染色體之間的相似性較低，因此，端粒相關(guān)序列可作為基因組作圖的染色體連鎖群端點(diǎn)標(biāo)記，用以研究染色體端部結(jié)構(gòu)特性和染色體類型[19]。根據(jù)不同染色體的端粒信號(hào)特點(diǎn)，可從分子層面輔助染色體的配對(duì)，相較傳統(tǒng)方法更方便準(zhǔn)確。本研究對(duì)蒜芥茄進(jìn)行端粒重復(fù)序列的熒光原位雜交，明確其染色體的數(shù)目為24條，端粒序列(TTTAGGG)6位于每條染色體兩端。He等[20]對(duì)茄子、馬鈴薯、番茄等9種茄科植物進(jìn)行端粒重復(fù)序列的熒光原位雜交，發(fā)現(xiàn)每條染色體端部都有熒光信號(hào)，在一些染色體上還有間質(zhì)信號(hào)。本研究并未發(fā)現(xiàn)間質(zhì)信號(hào)，但有端部信號(hào)，表明茄科植物染色體兩端的端粒重復(fù)序列有一定的保守性。有研究表明，端粒長(zhǎng)度在茄科番茄和煙草的發(fā)育過程中沒有明顯變化[19]，但端粒結(jié)構(gòu)可能會(huì)發(fā)生變化，如重復(fù)序列的改變或重排等，尤其是在衰老組織中。因此，確定蒜芥茄中端粒重復(fù)序列(TTTAGGG)6的位點(diǎn)，并進(jìn)一步研究其序列的排列狀況，有助于研究端粒調(diào)控衰老的機(jī)制。除此之外，端粒序列的熒光雜交在研究染色體缺失、重復(fù)等變異中也有一定作用。王海波等[21]利用端粒重復(fù)序列鑒定馬鈴薯和茄子體細(xì)胞雜種染色體的變異情況，發(fā)現(xiàn)部分重排染色體著絲粒區(qū)域有端粒重復(fù)序列，推測(cè)部分染色體是由末端相連的方式重排。端粒DNA序列還可以作為細(xì)胞和分子遺傳圖譜的末端標(biāo)記，整合分子遺傳圖譜與經(jīng)典遺傳圖譜。因此，在本研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步分析蒜芥茄及栽培茄的端粒雜交信號(hào)，有助于明確蒜芥茄在茄科中的遺傳關(guān)系和分類地位。

5 SrDNA是絕大多數(shù)生物核糖體大亞基的一個(gè)組成部分，其功能在真核生物中還不太清楚。5 SrDNA基因家族通常以高拷貝串聯(lián)重復(fù)形式存在于基因組中，有2 000～5 000個(gè)拷貝，且常不與其他重復(fù)序列(如26 S-5.8 S-18 S)串聯(lián)在一起，其基因序列較保守[22]。18 SrDNA屬于45 SrDNA的一部分，45 SrDNA主要位于細(xì)胞核核仁區(qū)，參與核仁形成，一般在染色體的次縊痕部位與隨體相連，因此45 SrDNA的雜交位點(diǎn)數(shù)目一般為隨體染色體的數(shù)目[23]。從本研究結(jié)果可以看出，蒜芥茄染色體上有1對(duì)5 SrDNA位點(diǎn)在第10組染色體上，1對(duì)18 SrDNA雜交位點(diǎn)在第11組隨體染色體上。王海波等[21]對(duì)栽培茄進(jìn)行熒光原位雜交，發(fā)現(xiàn)其5 S rDNA定位在1號(hào)染色體上，而本研究中的5 SrDNA位點(diǎn)卻在10號(hào)染色體上，表明栽培茄與野生蒜芥茄在細(xì)胞學(xué)上有一定的分化。王金英等[7]對(duì)野生煙草染色體進(jìn)行FISH定位分析，發(fā)現(xiàn)了2個(gè)5 SrDNA位點(diǎn)和2個(gè)18 SrDNA位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了5 SrDNA和18 SrDNA在煙草中期染色體上的同時(shí)定位，而以上結(jié)果和本研究發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)個(gè)數(shù)是一致的。同時(shí)，Chiarini[24]對(duì)銀葉茄(S.elaeagnifolium)進(jìn)行熒光原位雜交，發(fā)現(xiàn)二倍體表現(xiàn)出1對(duì)18 S信號(hào)和1對(duì)5 S信號(hào)，而四倍體和六倍體的FISH標(biāo)記信號(hào)與染色體倍性水平成正比。Chiarini等[25]還通過熒光原位雜交技術(shù)研究了茄屬9種植物的染色體特征，發(fā)現(xiàn)所有物種均有1對(duì)5 SrDNA和18 SrDNA位點(diǎn)，很少的物種有2對(duì)5 SrDNA，據(jù)此推測(cè)茄科植物5 S和18 S位點(diǎn)在進(jìn)化中較穩(wěn)定，適合作為熒光標(biāo)記來輔助核型分析。

本研究對(duì)蒜芥茄進(jìn)行核型分析，得出其染色體數(shù)目為24條，核型為較原始的1 A型，該核型與祝海燕等[12]對(duì)野生茄托魯巴姆的核型分析結(jié)果一致，而詹園鳳等[26]對(duì)兩種栽培茄核型分析的結(jié)果為2 A型，表明蒜芥茄的染色體變異較小、進(jìn)化程度較低，與栽培茄親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。此外，祝海燕等[12]通過對(duì)栽培茄快青和野生茄托魯巴姆、紅刺茄等進(jìn)行染色體核型分析發(fā)現(xiàn)，3個(gè)材料的染色體數(shù)目均為2 n=2 x=24，且都只有1對(duì)帶隨體的染色體(SAT-染色體)，此結(jié)論與本研究結(jié)果一致。但是，本研究蒜芥茄的隨體位于11號(hào)染色體，而托魯巴姆、紅刺茄的隨體分別位于5號(hào)、4號(hào)染色體[12]。據(jù)此推測(cè)，蒜芥茄與這兩種野生茄在進(jìn)化上有一定的分化。Rego等[27]研究了茄屬16種植物的核型特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)所有物種染色體均為2 n=24，表明茄科植物的核型在染色體數(shù)目和形狀上較保守，對(duì)稱性變化不大。吳世斌和李正理[28]研究了西雙版納幾種野生茄的染色體數(shù)目和形態(tài)，發(fā)現(xiàn)不同類型的野生茄染色體核型差異較大。因此，野生茄之間的核型差異很可能是導(dǎo)致其形態(tài)特征差異的因素。但有關(guān)茄屬植物的種間核型差異與外部形態(tài)差異的關(guān)系還有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié) 論

通過細(xì)胞遺傳學(xué)手段鑒定了蒜芥茄的染色體倍數(shù)為2倍體，核型公式為2 n=2 x=24=24 m(2 SAT)，屬于較對(duì)稱的1 A型原始核型。借助于熒光原位雜交技術(shù)，確定了端粒序列(TTTAGGG)6位于蒜芥茄染色體的兩端，識(shí)別了1對(duì)5 SrDNA和1對(duì)18 SrDNA信號(hào)位點(diǎn)分別位于10號(hào)和11號(hào)染色體上。