劉 怡， 王玥瑤， 楊柳青， 操賽雨， 燕 鑫， 何碧珠,2， 郭梨錦

(1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院， 福州350000；2.蘭科植物保護(hù)與利用國(guó)家林業(yè)與草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 福建 福州 350000；3.資源與環(huán)境學(xué)院，國(guó)際鎂營(yíng)養(yǎng)研究所， 福建 福州 350000)

proliferation; rooting

天宮石斛(Dendrobiumaphyllum)為蘭科(Orchidaceae)石斛屬(Dendrobium)植物，石斛屬植物為附生蘭[1]，是我國(guó)最早有文獻(xiàn)記錄的蘭科植物之一，已知全屬的種類(lèi)遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于7 000種，主要生長(zhǎng)區(qū)域從亞洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)至澳大利亞和新西蘭，在我國(guó)主要分布于云南、廣西、福建、廣州、貴州和臺(tái)灣等省區(qū)[2]，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的原種有80多個(gè)，其中2個(gè)變種。石斛蘭多生長(zhǎng)于海拔100～3 000 m叢林中的樹(shù)木或巖石上[3]，喜溫暖、潮濕及冷涼的環(huán)境、較耐低溫、不耐干旱和高溫，忌積水和陽(yáng)光曝曬，冬季最低溫度低于-10 ℃時(shí)生理特征會(huì)受到影響。

石斛蘭為世界應(yīng)用最廣的蘭花之一，適應(yīng)性強(qiáng)，花期長(zhǎng)，花形小巧，種類(lèi)繁多，石斛蘭與卡特蘭、蝴蝶蘭、萬(wàn)帶蘭并列稱(chēng)為觀(guān)賞價(jià)值最高的四大觀(guān)賞蘭類(lèi)[4]。石斛蘭在生活中應(yīng)用范圍極其廣泛，不僅可盆栽，也可作為花籃、花束、新娘捧花等重要花材，是國(guó)際鮮切花市場(chǎng)上最重要的鮮切花之一[5]。部分石斛蘭品種還具有珍貴的藥用價(jià)值，鐵皮石斛[6]、金釵石斛、馬鞭石斛及其相近品種已經(jīng)被《中國(guó)藥典》收錄。

天宮石斛別名垂枝石斛蘭、瀑布蘭、倒吊蘭，為蘭科石斛屬落葉性多年生草本[7]，原產(chǎn)地從我國(guó)云南東南部至西部(富寧、建水、金平、勐臘、勐海、瀘水等地)。其花瓣粉紅色，唇瓣奶白色并帶有絨毛(如圖1)，唇瓣邊緣有流蘇狀細(xì)齒，是石斛蘭中極具觀(guān)賞價(jià)值的品種[8]。目前天宮石斛在國(guó)內(nèi)蘭花市場(chǎng)鮮有問(wèn)津，對(duì)其生理特性和快繁技術(shù)的研究鮮有報(bào)道。本研究以天宮石斛蘭莢果為外植體，初步探究天宮石斛蘭種胚快繁技術(shù)，為其應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料天宮石斛莢果(圖2)采自云南省瑞麗市(97.31′～98.02′E，23.38′～24.14′N(xiāo))，氣候?yàn)閬啛釒Ъ撅L(fēng)性濕潤(rùn)氣候類(lèi)型，年均氣溫21 ℃左右[10]，年降水量1 394.8 mm。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1消毒時(shí)間處理試驗(yàn)

取成熟度為80%的天宮石斛莢果為外植體，將莢果兩端果柄切除，用牙刷蘸取洗衣粉清洗莢果表面雜質(zhì)，用自來(lái)水流水沖洗10 min后，純水蕩洗3～4遍，置超凈工作臺(tái)內(nèi)用75%乙醇消毒30 s，用2%次氯酸鈉分別消毒2、4、6、8、10、12、14 min，無(wú)菌蒸餾水沖洗3～4次，用高溫消毒過(guò)的濾紙吸干莢果表皮殘留水分，再用手術(shù)刀縱切莢果后夾取莢果內(nèi)種子，接種15 d后統(tǒng)計(jì)污染率，探究天宮石斛莢果適宜消毒時(shí)間。

圖1 天宮石斛蘭盛花期Fig.1 Flowering period of Dendrobium aphyllum

圖2 天宮石斛蘭莢果Fig.2 Pods of Dendrobium aphyllum

1.2.2莢果萌發(fā)與原球莖誘導(dǎo)

將處理過(guò)的種子分別接種于①M(fèi)S+蛋白胨1 g/L+白糖25 g/L+瓊脂5.8 g/L+活性炭1 g/L、②MS+蛋白胨1 g/L+土豆30 g/L+白糖25 g/L+瓊脂5.8 g/L+活性炭1 g/L、③MS+蛋白胨1 g/L+香蕉30 g/L+白糖25 g/L+瓊脂5.8 g/L+活性炭1 g/L、④MS+蛋白胨1 g/L+地瓜30 g/L+白糖25 g/L+瓊脂5.8 g/L+活性炭1 g/L、⑤MS+蛋白胨1 g/L+椰乳30 g/L+白糖25 g/L+瓊脂5.8 g/L+活性炭1 g/L、⑥MS+蛋白胨1 g/L+胡蘿卜30 g/L+白糖25 g/L+瓊脂5.8 g/L+活性炭1 g/L、⑦M(jìn)S+蛋白胨1 g/L+青瓜30 g/L+白糖25 g/L+瓊脂5.8 g/L+活性炭1 g/L誘導(dǎo)培養(yǎng)基(pH值為7.6～7.8)，每種培養(yǎng)基分別接種10瓶，共接種70瓶。接種后置于培養(yǎng)室中，將培養(yǎng)室溫度控制在(23±2)℃，先暗培養(yǎng)15 d，待種子轉(zhuǎn)綠后(圖3)，進(jìn)行光培養(yǎng)(1 600～1 800 lx、每天光照10 h)，觀(guān)察各培養(yǎng)基生長(zhǎng)狀況，研究不同有機(jī)添加物對(duì)天宮石斛原球莖誘導(dǎo)的影響。

圖3 15 d后天宮石斛蘭種子轉(zhuǎn)綠Fig.3 The seeds of Dendrobium aphyllum turn green after 15 days

1.2.3原球莖增殖

將MS+蛋白胨1 g/L+土豆30 g/L+白糖25 g/L+瓊脂5.8 g/L+活性炭1 g/L誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)45 d后的原球莖分別轉(zhuǎn)移至添加了6-BA(0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L)，NAA(0.1、0.3、0.5、1.0 mg/L)，白糖(25.0 g/L)，瓊脂(5.8 g/L)，蛋白胨(1.0 g/L)，活性炭(1 g/L)的MS培養(yǎng)基中，然后置于溫度為(23±2)℃、光照強(qiáng)度為1 600～1 800 lx的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，每天光照10 h。每個(gè)處理接種3瓶，每瓶接種4～6個(gè)原球莖。培養(yǎng)30 d后查看原球莖生長(zhǎng)狀況，調(diào)查不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)天宮石斛蘭原球莖增殖以及分化的影響。

1.2.4生根壯苗誘導(dǎo)

將在增殖分化階段形成的無(wú)根苗轉(zhuǎn)接至添加活性炭(0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 g/L)，6-BA(1.5 mg/L、NAA 1.0 mg/L)，白糖(25.0 g/L)，瓊脂(5.8 g/L)，蛋白胨(1.0 g/L)，土豆(30.0 g/L)的MS培養(yǎng)基中，然后置于培養(yǎng)室進(jìn)行光培養(yǎng)，培養(yǎng)條件與增殖分化培養(yǎng)階段相同。每個(gè)處理接種6瓶，每瓶接種10～15株。分別在培養(yǎng)30 d、60 d時(shí)觀(guān)察苗生長(zhǎng)狀況，記錄不同活性炭用量對(duì)天宮石斛蘭小苗生根壯苗的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒處理時(shí)間對(duì)外植體污染率的影響

種子經(jīng)消毒處理后，經(jīng)過(guò)15 d暗培養(yǎng)，其中部分接種瓶出現(xiàn)污染，未污染接種瓶種胚轉(zhuǎn)化為深綠色，相當(dāng)一部分接種瓶出現(xiàn)半污染半轉(zhuǎn)綠狀態(tài)，由于接種瓶已經(jīng)污染，后期會(huì)出現(xiàn)全部污染的現(xiàn)象，還有一部分接種瓶未出現(xiàn)污染，但種胚一直為黃色，沒(méi)有轉(zhuǎn)綠，這部分材料呈現(xiàn)出永久休眠狀態(tài)。由表1可知，75%乙醇(浸泡30 s)+2%NaClO(浸泡10 min)的污染率最低，僅為30%，萌發(fā)率最高，達(dá)70%，明顯優(yōu)于其他參試組；75%乙醇(浸泡30 s)+2%NaClO(浸泡14 min)的污染率和萌發(fā)率都為0。因此，若莢果消毒不徹底易產(chǎn)生污染，莢果消毒處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)[11]，則可使天宮石斛蘭莢果因受毒害而使種胚出現(xiàn)無(wú)法轉(zhuǎn)綠或進(jìn)入永久休眠狀態(tài)。

表1 不同消毒時(shí)間對(duì)天宮石斛莢果消毒效果的影響Table 1 Comparison of disinfection effects of different disinfection times on pods of Dendrobium aphyllum

2.2 種子萌發(fā)與原球莖的誘導(dǎo)

天宮石斛蘭種子在以MS+蛋白胨1 g/L+白糖25 g/L+瓊脂5.8 g/L+活性炭1 g/L為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加各種有機(jī)添加物30 g/L的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上先暗培養(yǎng)15 d、再轉(zhuǎn)移至光照(10 h/d)條件下培養(yǎng)，30 d后觀(guān)察發(fā)現(xiàn)所有培養(yǎng)基種子萌發(fā)基本完成[12]。研究發(fā)現(xiàn)，天宮石斛蘭種胚在誘導(dǎo)過(guò)程中，各種培養(yǎng)基均不同程度地出現(xiàn)白化現(xiàn)象(圖4)，其中土豆30 g/L有機(jī)添加物的培養(yǎng)基誘導(dǎo)率最高，達(dá)95%，白化程度最低，為5%；椰乳30 g/L的有機(jī)添加物培養(yǎng)基誘導(dǎo)率最低，僅為10%，白化程度最高，達(dá)90%；由表2可知，ck組處理培養(yǎng)基誘導(dǎo)率明顯低于添加土豆、香蕉、青瓜有機(jī)物的培養(yǎng)基，高于添加地瓜、椰乳、胡蘿卜有機(jī)物的培養(yǎng)基；由表2可知，各種培養(yǎng)基均出現(xiàn)不同程度白化現(xiàn)象。試驗(yàn)結(jié)果表明，土豆、香蕉、青瓜有機(jī)物對(duì)天宮石斛蘭種胚誘導(dǎo)起促進(jìn)作用，地瓜、椰乳、胡蘿卜有機(jī)物對(duì)天宮石斛蘭種胚誘導(dǎo)起抑制作用，其中添加土豆的培養(yǎng)基促進(jìn)效果最佳，添加椰乳的培養(yǎng)基抑制作用最強(qiáng)；各種培養(yǎng)基中均出現(xiàn)不同程度白化現(xiàn)象，說(shuō)明培養(yǎng)基中氮含量過(guò)高，不適合天宮石斛種胚生長(zhǎng)。

圖4 部分原球莖出現(xiàn)白化現(xiàn)象Fig.4 Albinism of some protocorms

表2 不同有機(jī)添加物對(duì)天宮石斛原球莖誘導(dǎo)的影響Table 2 Effects of different organic additives on protocorminduction of Dendrobium aphyllum

2.3 6-BA與NAA濃度對(duì)天宮石斛原球莖增殖的影響

以MS+蛋白胨1 g/L+土豆30 g/L+白糖25 g/L+瓊脂5.8 g/L+活性炭1 g/L為基本培養(yǎng)基，以6-BA和NAA為因素變量，以6-BA和NAA不同濃度為水平變量，設(shè)置16個(gè)處理(附上不同濃度6-BA和NAA組合，詳見(jiàn)表3)，每個(gè)處理接3次重復(fù)。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可知，16個(gè)組合處理中，處理C 4平均增殖系數(shù)最高，達(dá)9.4，而平均增殖系數(shù)最低的為處理A 2，僅為1.6。研究表明，不同濃度6-BA和NAA組合對(duì)天宮石斛原球莖增殖促進(jìn)作用不同，添加6-BA 1.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L的MS+蛋白胨1 g/L+土豆30 g/L+白糖25 g/L+瓊脂5.8 g/L+活性炭1 g/L培養(yǎng)基促進(jìn)效果最明顯，而添加6-BA 1.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L的MS+蛋白胨1 g/L+土豆30 g/L+白糖25 g/L+瓊脂5.8 g/L+活性炭1 g/L培養(yǎng)基促進(jìn)效果最差。因此，在天宮石斛原球莖增殖階段，添加6-BA 1.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L可以增強(qiáng)天宮石斛原球莖增殖能力[13]。將每一個(gè)處理組合增殖原球莖分別接種在相同活性炭濃度培養(yǎng)基中，待生根壯苗后發(fā)現(xiàn)，C 4組合處理原球莖在生根壯苗時(shí)，葉片繁多、葉色翠綠，根系濃密且粗壯，莖稈直徑偏大，顏色呈現(xiàn)濃綠色[13]；A 2組合處理原球莖在生根壯苗時(shí)，生長(zhǎng)植株出現(xiàn)枯死現(xiàn)象并且植株生長(zhǎng)狀態(tài)呈現(xiàn)出葉片稀疏、葉色微微發(fā)黃，根系零散且細(xì)長(zhǎng)，莖稈直徑細(xì)小顏色淡綠色[14](如圖5所示)。結(jié)果表明，C 4組合處理原球莖在生根壯苗時(shí)要明顯優(yōu)于A(yíng) 2組合處理。

表3 不同激素組合對(duì)天宮石斛原球莖增殖影響試驗(yàn)方案Table 3 Effect of different hormone combinations on the increment of protocorm of Dendrobium aphyllum

表4 6-BA與NAA不同濃度對(duì)天宮石斛原球莖增殖影響的試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Effects of different concentrations of 6-BA and NAA concentrations on protocorm proliferation of Dendrobium aphyllum

2.4 生根壯苗培養(yǎng)

選擇生長(zhǎng)健壯，長(zhǎng)勢(shì)大致相同的天宮石斛叢生芽(如圖6)接種到含有不同濃度活性炭(0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 g/L)+MS+蛋白胨1 g/L+土豆30 g/L+白糖25 g/L+瓊脂5.8 g/L+活性炭1 g/L+6-BA 1.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L培養(yǎng)基中，然后置于培養(yǎng)室中，進(jìn)行連續(xù)光照培養(yǎng)，60 d后統(tǒng)計(jì)各培養(yǎng)基中生根以及植株生長(zhǎng)狀況。研究表明，隨著活性炭濃度升高，培養(yǎng)基中的平均根數(shù)和單株重量都有所增加，其中活性炭濃度為1.2 g/L時(shí)，根數(shù)多、植株根系生長(zhǎng)粗壯且平均根數(shù)與單株鮮重均達(dá)到最大值；活性炭濃度為0.3 g/L時(shí)，根數(shù)少、根系生長(zhǎng)細(xì)長(zhǎng)、植株矮小且平均根數(shù)與單株鮮重均為最小值。因此，在天宮石斛生根壯苗階段，添加不同濃度的活性炭對(duì)促進(jìn)生根效果不同，植株生長(zhǎng)狀況也有所不同[15]。

圖5 天宮石斛增殖培養(yǎng)Fig.5 Proliferation culture of Dendrobium aphyllum

圖6 天宮石斛叢生芽Fig.6 Clustered buds of Dendrobium aphyllum

3 小結(jié)與討論

3.1 消毒條件的優(yōu)化選擇

本試驗(yàn)在對(duì)外植體消毒處理時(shí)發(fā)現(xiàn)，天宮石斛莢果用2% NaClO消毒，接種后暗培養(yǎng)15 d進(jìn)行觀(guān)察統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)隨著對(duì)天宮石斛莢果消毒時(shí)間延長(zhǎng)，接種瓶污染率降低，當(dāng)消毒時(shí)間為10 min時(shí)污染率最低，成活率最高，消毒效果最佳；當(dāng)消毒時(shí)間超過(guò)10 min后污染率提高；當(dāng)消毒14 min時(shí)種子出現(xiàn)毒害或永久休眠狀態(tài)。因此，使用2% NaClO消毒天宮石斛種子處理時(shí)，消毒時(shí)間控制在10 min消毒效果最佳，污染率僅為30%，這與李艷冬等[16]采用2% NaClO消毒10 min研究結(jié)果大致相同。

圖7 生根壯苗培養(yǎng)Fig.7 Rrooting and strong seedling culture

表5 活性炭濃度對(duì)天宮石斛生根壯苗的影響Table 5 Effect of activated carbon concentration on Rooting and strong seedlings of Dendrobium aphyllum

圖8 天宮石斛移栽苗Fig.8 Transplanted seedlings of Dendrobium aphyllum

3.2 不同培養(yǎng)基對(duì)天宮石斛原球莖的影響

探究誘導(dǎo)原球莖過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，以蛋白胨1 g/L+白糖25 g/L+瓊脂5.8 g/L+活性炭1 g/L為基本培養(yǎng)基，分別在培養(yǎng)基中添加土豆、香蕉、地瓜、椰乳、胡蘿卜、青瓜有機(jī)物。在15 d暗培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)(每天光照10 h)條件下45 d后觀(guān)察培養(yǎng)基發(fā)現(xiàn)，添加土豆、香蕉、青瓜的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)率均高于對(duì)照組，其中添加土豆誘導(dǎo)率最高(達(dá)95%)。王云惠等[17]誘導(dǎo)原球莖培養(yǎng)基成分構(gòu)成中未添加任何有機(jī)物，誘導(dǎo)時(shí)間為60 d，表明添加有機(jī)物的培養(yǎng)基可以有效縮短誘導(dǎo)時(shí)間。因此，在天宮石斛原球莖誘導(dǎo)階段，添加土豆有利于天宮石斛原球莖的誘導(dǎo)。

圖9 天宮石斛作觀(guān)賞植物Fig.9 Dendrobium aphyllum as an ornamental plant

植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，要求無(wú)菌生長(zhǎng)環(huán)境并且需要滿(mǎn)足植物生長(zhǎng)的必需物質(zhì)，同時(shí)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是培養(yǎng)過(guò)程中不可或缺的因子，不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比對(duì)培養(yǎng)物質(zhì)的生長(zhǎng)有重要作用[18]。本試驗(yàn)在天宮石斛原球莖增殖階段以蛋白胨1 g/L+土豆30 g/L+白糖25 g/L+瓊脂5.8 g/L+活性炭1 g/L為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的6-BA與NAA組合，以期獲得天宮石斛原球莖增殖階段6-BA與NAA最佳組合。試驗(yàn)結(jié)果表明，6-BA與NAA的16種組合中，均可促進(jìn)天宮石斛蘭原球莖增殖，6-BA 1.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L組合增殖天宮石斛原球莖效果最佳，增殖效果高于龔建英等[19]的研究結(jié)果。

3.3 活性炭對(duì)組培苗的影響

活性炭能夠在植物生長(zhǎng)過(guò)程中吸收毒害物質(zhì)，而且添加適量活性炭之后，有利于在組培苗的底部形成一個(gè)較暗局部環(huán)境，有助于組培苗根系生長(zhǎng)發(fā)育。本研究發(fā)現(xiàn)，天宮石斛生根壯苗階段，活性炭最佳濃度為1.2 g/L，平均根數(shù)為8.54，略高于劉揚(yáng)等[20]的研究結(jié)果(7.49)，當(dāng)活性炭濃度≥1.2 g/L時(shí)，產(chǎn)生抑制作用，因?yàn)榛钚蕴吭谂囵B(yǎng)基中吸附有毒害代謝物質(zhì)的同時(shí)，也會(huì)吸收培養(yǎng)基中包含的礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)成分，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑以及其他必需維生素[21]。因此，一定要選擇最佳活性炭濃度，否則會(huì)影響組培苗的生長(zhǎng)。

本研究培養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)不同程度白化現(xiàn)象，可能是培養(yǎng)基中氮含量超標(biāo)[22]，其原因有待進(jìn)一步研究。