覃 成， 楊仕梅， 羅希榕， 李唐燕， 李 靖， 郭 婭，陀海燕， 涂韋波， 邱化榮

( 1.遵義職業(yè)技術(shù)學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)系/貴州省遵義辣椒種質(zhì)資源保護(hù)及繁育種植工程研究中心， 貴州 遵義 563006；2.遵義市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院/遵義市作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 遵義 563006)

辣椒(CapsicumannuumL.)為一年生或多年生茄科草本植物，原產(chǎn)中南美洲熱帶和亞熱帶地區(qū)，在全世界范圍內(nèi)廣泛種植，是我國(guó)主要種植的蔬菜品種之一[1]。目前貴州辣椒的種植規(guī)模、加工業(yè)規(guī)模、產(chǎn)品集散規(guī)模等均居全國(guó)第一，總產(chǎn)值近80億元，占全球貿(mào)易額的1.8%(http://www.fao.org)。辣椒現(xiàn)已成為貴州農(nóng)業(yè)生產(chǎn)結(jié)構(gòu)調(diào)整和鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略的重要蔬菜種類。

在辣椒生產(chǎn)用種方面，與主要農(nóng)作物(如玉米和水稻等)和其他大多數(shù)蔬菜作物(如番茄和大白菜等)一樣，雜種一代是目前和今后的主要利用形式。因此，高效選育優(yōu)良雜種一代以及大量繁殖高質(zhì)量的種子是辣椒選育工作者不斷追求的目標(biāo)。目前，大量繁殖辣椒雜種一代種子的方法主要有人工去雄和利用雄性不育系進(jìn)行人工授粉兩種。由于后者可免除人工去雄，達(dá)到提高雜種一代種子純度和降低雜種一代繁種成本的目的，從而成為大量繁殖辣椒雜種一代種子的理想途徑。因此，如何更好地利用辣椒雄性不育選育優(yōu)良雜種一代的研究備受關(guān)注。

辣椒中已報(bào)道的雄性不育類型主要有兩種，即質(zhì)核互作雄性不育(Cytoplasmic Male Sterility，CMS)和細(xì)胞核雄性不育(Genic Male Sterility，GMS)。其中，CMS是由細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核互作產(chǎn)生的，對(duì)于諸如辣椒這類以果實(shí)作為收獲對(duì)象的作物而言，在利用CMS時(shí)，必須同時(shí)選育出不育系、保持系和恢復(fù)系以實(shí)現(xiàn)“三系”配套，其中以不育系×恢復(fù)系來(lái)大量繁殖雜種一代種子供生產(chǎn)應(yīng)用。一般來(lái)說(shuō)，經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)期的嚴(yán)格選育，可以獲得100%不育株的CMS系以實(shí)現(xiàn)“三系”配套，所以，辣椒CMS仍然是目前最常用的不育類型。但是，在辣椒選育種實(shí)踐中，有時(shí)也會(huì)遇到以下兩種情況，一是辣椒CMS的不育度容易受環(huán)境條件影響；二是辣椒CMS的恢復(fù)基因較多的存在于小果型材料中，而在大果型辣椒尤其是燈籠形甜椒材料中，由于普遍缺乏恢復(fù)基因而較難選育獲得優(yōu)良的恢復(fù)系。這就使得在利用辣椒CMS時(shí)存在一定的局限或者需要更長(zhǎng)的選育時(shí)間。

GMS則只受細(xì)胞核基因控制，且大多屬于單基因隱性遺傳。與CMS相比，GMS通常具有不育性更為穩(wěn)定以及不受恢保關(guān)系限制而容易選育獲得各種類型的恢復(fù)(父本)系等優(yōu)點(diǎn)，而且不存在不育胞質(zhì)負(fù)效應(yīng)和胞質(zhì)單一化的潛在風(fēng)險(xiǎn)。然而，迄今為止，通過(guò)常規(guī)方法利用GMS繁殖辣椒雜種一代種子仍存在的最大缺點(diǎn)是，必須在開(kāi)花初期逐一拔除GMS兩用系作母本的群體內(nèi)約50%的可育株。這就要求繁殖辣椒雜種一代種子的眾多農(nóng)戶具有識(shí)別不育株和可育株的能力以及認(rèn)真負(fù)責(zé)的態(tài)度。但在實(shí)際操作過(guò)程中，這也是較難保證雜種一代種子純度的主要原因之一，從而影響了辣椒GMS的大規(guī)模應(yīng)用。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外科學(xué)家針對(duì)主要農(nóng)作物育種，先后提出了利用隱性核不育高效繁殖雜種一代種子的“SPT(Seed Production Technology)技術(shù)”和“智能不育雜交育種技術(shù)”，并在玉米和水稻中得到了證實(shí)和應(yīng)用[2-3]。這為辣椒等蔬菜作物高效利用GMS提供了理論依據(jù)。但是，該技術(shù)的應(yīng)用是以克隆得到確切的隱性核不育基因?yàn)榍疤岬摹Ｆ?，仍未精?zhǔn)定位到調(diào)控辣椒隱性核不育的基因。

為解析植物不育系的分子機(jī)制，越來(lái)越多的生物技術(shù)應(yīng)用到植物選育過(guò)程中，Zhang等[4]對(duì)棉花進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)棉花雄性不育的候選調(diào)控基因；Tang等[5]通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)對(duì)紅麻細(xì)胞質(zhì)雄性不育進(jìn)行系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)不育系代謝主要涉及關(guān)鍵代謝途徑。本研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)辣椒不育系和可育系花芽進(jìn)行分析，從差異蛋白亞細(xì)胞定位、保守結(jié)構(gòu)域、GO和KEGG富集、代謝通路富集、蛋白互作等方面進(jìn)行分析，以篩選和鑒定辣椒不育系相關(guān)的關(guān)鍵蛋白，從分子生物學(xué)角度為辣椒的遺傳育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

辣椒S 033-A可育系和S 033-B不育系屬于細(xì)胞核雄性不育系，朝天椒類型，種植在遵義職業(yè)技術(shù)學(xué)院辣椒種植基地，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的植株，對(duì)S 033-A可育系和S 033-B不育系的花芽進(jìn)行取樣，每個(gè)株系3個(gè)重復(fù)，取樣后立即置于-80 ℃液氮中備用。

1.2 蛋白質(zhì)提取及肽段酶解

兩個(gè)株系S 033-A可育系和S 033-B不育系采用SDT[4%(w/v)SDS,100 mmol/L Tris/HCl pH 7.6, 0.1 mol/L DTT]裂解法提取蛋白質(zhì)，然后采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。每個(gè)樣品取適量蛋白質(zhì)采用Filter Aided Sample Preparation (FASP)方法進(jìn)行胰蛋白酶酶解，采用C 18 Cartridge對(duì)肽段進(jìn)行脫鹽，肽段凍干后加入40 μL 0.1%甲酸溶液復(fù)溶，肽段定量(OD280)。

1.3 串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽(Tandem Mass Tag,TMT)定量分析

各樣品分別取100 μg肽段，按照Thermo公司TMT標(biāo)記試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行標(biāo)記。組別2個(gè)，每個(gè)組別含有3個(gè)重復(fù)樣本，共計(jì)6個(gè)樣本。

1.4 LC-MS/MS分析及數(shù)據(jù)分析

每份樣品采用納升流速的HPLC液相系統(tǒng)Easy nLC進(jìn)行分離。緩沖液A為0.1%甲酸水溶液，緩沖液B為0.1%甲酸乙腈水溶液(乙腈為84%)。色譜柱用95%的A液平衡，樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器上樣到上樣柱(Thermo Scientific Acclaim PepMap 100,100 μm×2 cm,nanoViper C 18)，經(jīng)過(guò)分析柱(Thermo scientific EASY column,10 cm,ID 75 μm,3 μm,C 18-A 2)分離，流速為300 nL/min。

樣品經(jīng)色譜分離后用 Q-Exactive 質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。檢測(cè)方式為正離子，母離子掃描范圍300～1 800 m/z，一級(jí)質(zhì)譜分辨率為70 000 at 200 m/z，AGC(Automatic Gain Control) target為1 e6，Maximum IT為50 ms，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間(Dynamic exclusion)為60.0 s。多肽和多肽碎片的質(zhì)量電荷比按照下列方法采集：每次全掃描(full scan)后采集20個(gè)碎片圖譜(MS 2 scan)，MS 2 Activation Type為HCD，Isolation window為2 m/z，二級(jí)質(zhì)譜分辨率 17 500 at 200 m/z，Normalized CollisionEnergy為30 eV，Underfill為0.1%。

1.5 生物信息學(xué)分析

蛋白質(zhì)聚類分析利用R語(yǔ)言包Complexheatmap對(duì)樣品和蛋白質(zhì)的表達(dá)量?jī)蓚€(gè)維度進(jìn)行分類(距離算法：歐幾里得，連接方式：Average linkage)，并生成層次聚類熱圖。CELLO(http://cello.life.nctu.edu.tw/)的方法進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)[6]。利用Pfam數(shù)據(jù)對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析[7]，利用InterProScan軟件包進(jìn)行比對(duì)[8]。利用Blast 2 GO對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)集合進(jìn)行GO注釋[9]，利用KAAS軟件對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行KEGG注釋，利用ClusterProfiler對(duì)GO和KEGG進(jìn)行富集分析[10]?；?IntAct (http://www.ebi.ac.uk/intact/main.xhtml)或者 STRING(http://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)中的信息查找目標(biāo)蛋白質(zhì)之間的直接和間接相互作用關(guān)系，并使用 CytoScape v 3.2.1生成相互作用網(wǎng)絡(luò)并對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)鑒定及相對(duì)定量

在對(duì)兩個(gè)辣椒品種的蛋白質(zhì)分析中，共鑒定到二級(jí)圖譜373 379個(gè)，數(shù)據(jù)庫(kù)匹配譜圖總數(shù)為96 379個(gè)，肽段總數(shù)為42 364條，唯一肽段總數(shù)為38 304條，鑒定到蛋白總數(shù)為7 667個(gè)，可定量蛋白為7 629個(gè)。

為展示比較組間表達(dá)蛋白質(zhì)的顯著性差異，將比較組中的蛋白質(zhì)以表達(dá)差異倍數(shù)(Fold Change, FC)表示，并對(duì)其進(jìn)行差異分析，最終得到504個(gè)顯著差異蛋白(FC>1.2且p<0.05)。其中在S 033-A中上調(diào)351個(gè)蛋白(FC>1.2且p<0.05)，在S 033-B中上調(diào)153個(gè)蛋白(FC<0.83且p<0.05)(圖1)。

2.2 亞細(xì)胞定位及結(jié)構(gòu)域分析

對(duì)得到的504個(gè)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位及結(jié)構(gòu)域分析。亞細(xì)胞定位最多的為細(xì)胞質(zhì)，含有153個(gè)差異表達(dá)蛋白，細(xì)胞核含有145個(gè)，葉綠體含有137個(gè)，質(zhì)膜含有95個(gè)，線粒體中含有64個(gè)，胞外含有57個(gè)，液泡中含有9個(gè)，溶酶體含有9個(gè)，其他含有2個(gè)(圖2)。

504個(gè)差異表達(dá)蛋白結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，共有421個(gè)蛋白具有結(jié)構(gòu)域(圖3)，結(jié)果顯示，定位比較多的分別為谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶N(9個(gè))，過(guò)氧化物酶(8個(gè))，尿苷二磷酸葡萄糖醛酸/尿苷二磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(8個(gè))，熱激蛋白/α晶狀體家族(6個(gè))，細(xì)胞色素P 450(6個(gè))，DEAD/DEAH-box解旋酶(6個(gè))，RNA解旋酶(6個(gè))，P Bet_v_1蛋白家族(6個(gè))，PAP原纖蛋白(6個(gè))，谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶C(5個(gè))，捕光葉綠素 a/b 結(jié)合蛋白酶(5個(gè))，果膠酯酶(5個(gè))，果膠甲酯酶(5個(gè))，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(4個(gè))，半胱氨酸蛋白酶(4個(gè))，BURP(4個(gè))，組織蛋白酶前肽抑制劑結(jié)構(gòu)域(4個(gè))，谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶(4個(gè))，烯基-(?；d體蛋白)還原酶(4個(gè))，Ras酶(3個(gè))。

2.3 GO和KEGG富集分析

對(duì)得到的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO注釋，并對(duì)其進(jìn)行可視化分析，結(jié)果(圖4)發(fā)現(xiàn)，在GO注釋中主要分為三大類，分別為生物學(xué)過(guò)程、分子功能和細(xì)胞組成。在生物學(xué)過(guò)程中，差異表達(dá)蛋白主要富集在光合作用(GO:0015979，23)、光合作用光反應(yīng)(GO:0019684，17)、光合電子傳遞鏈(GO:0009767，7)、脫毒(GO:0098754，13)、光合作用光捕獲(GO:0009765，7)、有毒物質(zhì)響應(yīng)(GO:0009636，13)、光系統(tǒng)Ⅱ組成(GO:0010207，5)和電子傳遞鏈(GO:0022900，8)；在分子功能過(guò)程中，差異表達(dá)蛋白主要富集在谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性(GO:0004364，7)、色素結(jié)合(GO:0031409，4)、poly(U)RNA結(jié)合(GO:0008266，2)、葡聚糖內(nèi)-1,3-β-葡糖苷酶(GO:0042973，3)、轉(zhuǎn)移酶(轉(zhuǎn)移烷基或芳基(甲基除外)的基團(tuán))(GO:0016765，10)和氧化還原酶(作用于CH-NH 2組供體)(GO:0016638，4)；在細(xì)胞組成過(guò)程中，差異表達(dá)蛋白主要富集在葉綠體類囊體(GO:0009534，30)、質(zhì)體類囊體(GO:0031976，30)、類囊體(GO:0009579，35)、葉綠體(GO:0009507，7)、質(zhì)體(GO:0009536，81)和類囊體膜(GO:0042651，24)。

注：紅色實(shí)心圓點(diǎn)表示上調(diào)的差異表達(dá)蛋白，藍(lán)色實(shí)心圓點(diǎn)表示下調(diào)的差異表達(dá)蛋白，灰色實(shí)心圓點(diǎn)表示無(wú)差異表達(dá)的蛋白。 圖1 S 033-B_VS_S 033-A火山圖 Fig.1 S 033-B_VS_S 033-A volcano map

注：不同顏色代表相應(yīng)的亞細(xì)胞定位，數(shù)字代表定位到對(duì)應(yīng)亞細(xì)胞的差異表達(dá)蛋白數(shù)目。圖2 S 033-B_VS_S 033-A 組差異表達(dá)蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位餅圖Fig.2 Pie map of subcellular localization of differentially expressed proteins in S 033-B_VS_S 033-A group

對(duì)上述差異表達(dá)蛋白進(jìn)行KEGG注釋，并對(duì)其進(jìn)行可視化分析，結(jié)果(圖5)發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)蛋白主要注釋到光合作用生物的碳固定作用(ko 00710，11)、藥物代謝-細(xì)胞色素P 450(ko 00982，7)、細(xì)胞色素P 450對(duì)外源性藥物的代謝作用(ko 00980，7)、光合作用(ko 00195，9)、單萜生物合成(ko 00902，3)、谷胱甘肽代謝(ko 00480，10)、類黃酮生物合成(ko 00941，4)、雙組分系統(tǒng)(ko 02020，5)、苯丙素類生物合成(ko 00940，9)、藥物代謝-其他酶(ko 00983，7)、光合作用-天線蛋白(ko 00196，4)和玉米素生物合成(ko 00908，3)。

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

為研究蛋白之間的相互作用關(guān)系，利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建辣椒不育系蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖(圖6)。在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖中，主要分為5個(gè)大類別(Degree≥4)，其余的可分為8個(gè)小類(Degree<4)。對(duì)421個(gè)已確定結(jié)構(gòu)域的蛋白進(jìn)一步確定，取已注釋到GO和KEGG中的，且存在蛋白互作關(guān)系的蛋白，最終發(fā)現(xiàn)51個(gè)交集(圖7)。在S 033-B中上調(diào)表達(dá)的有11個(gè)，在S 033-A中上調(diào)表達(dá)的有40個(gè)。在S 033-A上調(diào)的差異表達(dá)蛋白中，最為顯著且Degree>20的有5個(gè)蛋白，分別是Capana12g001382(Degree=44)、Capana01g000893(Degree=40)、Capana05g002020(Degree=31)、Capana02g002193(Degree=29)、Capana10g001330(Degree=26)，Capana12g001382基因GO注釋到生物學(xué)過(guò)程如光合作用、光合作用光反應(yīng)、光合電子傳遞鏈、前體代謝物和能量的產(chǎn)生、光系統(tǒng)Ⅰ的光合電子傳遞、應(yīng)激反應(yīng)等，分子功能有催化活性、運(yùn)輸活動(dòng)、水解酶活性等。細(xì)胞組成有葉綠體類囊體、質(zhì)體類囊體、類囊體、葉綠體、質(zhì)體、類囊體膜等，參與到KEGG通路光合作用途徑；Capana01g000893(Degree=40)，其GO注釋到細(xì)胞代謝過(guò)程、氮化合物代謝過(guò)程等生物學(xué)過(guò)程。ATP結(jié)合、尿苷激酶活性等分子功能，胞液和葉綠體等細(xì)胞組成，參與到光合生物的碳固定過(guò)程；Capana05g002020(Degree=31)，其GO注釋到去磷酸化和碳水化合物代謝過(guò)程，催化活性、水解酶活性、果糖1,6-二磷酸1-磷酸酶活性等分子功能。參與到光合生物的碳固定過(guò)程；Capana02g002193(Degree=29)，其GO注釋到光合作用、光系統(tǒng)中的光合電子傳遞、ATP的合成耦合質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)等生物學(xué)過(guò)程，質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶活性(旋轉(zhuǎn)機(jī)制)、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性等分子功能。葉綠體被膜、葉綠體類囊體膜等細(xì)胞組成，參與到光合作用和氧化磷酸化過(guò)程；Capana10g001330(Degree=26)，其GO注釋到去磷酸化和碳水化合物代謝過(guò)程等生物學(xué)過(guò)程，催化活性、水解酶活性、果糖1,6-二磷酸1-磷酸酶活性等分子功能，參與到光合作用生物的碳固定、AMPK信號(hào)通路、甲烷代謝、磷酸戊糖途徑、糖酵解/糖異生、果糖和甘露糖代謝等途徑。

注：橫坐標(biāo)表示差異表達(dá)蛋白的數(shù)目，縱坐標(biāo)表示不同的結(jié)構(gòu)域名稱。 圖3 S 033-B_VS_S 033-A 組差異表達(dá)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析 Fig.3 Domain analysis of differentially expressed proteins in S 033-B_VS_S 033-A group

注：橫坐標(biāo)表示不同的GO富集，縱坐標(biāo)表示差異表達(dá)蛋白的數(shù)目。BP為生物學(xué)過(guò)程；MF為分子功能；CC為細(xì)胞組成。 圖4 S 033-B_VS_S 033-A 組差異表達(dá)蛋白GO富集分析 Fig.4 GO enrichment analysis of differentially expressed proteins in S 033-B_VS_S 033-A group

注：橫坐標(biāo)代表富集比例，縱坐標(biāo)表示差異蛋白統(tǒng)計(jì)結(jié)果，顏色表示顯著性。 圖5 S 033-B_VS_S 033-A 組差異表達(dá)蛋白KEGG富集分析 Fig.5 KEGG enrichment analysis of differentially expressed proteins in S 033-B_VS_S 033-A group

在S 033-B上調(diào)的差異表達(dá)蛋白中，最為顯著的是前5個(gè)蛋白，其中Capana03g001373和Capana03g001371(Degree=13)含有相同的保守結(jié)構(gòu)域，GO注釋到細(xì)胞代謝過(guò)程、肽代謝過(guò)程、肽生物合成過(guò)程、基因表達(dá)等生物學(xué)過(guò)程，分子功能、結(jié)構(gòu)分子活性、核糖體的結(jié)構(gòu)組成等分子功能和細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞組成、細(xì)胞、細(xì)胞器等細(xì)胞組成，參與到KEGG通路核糖體途徑，2個(gè)蛋白GO和KEGG注釋結(jié)果一致；Capana10g001612，GO注釋到前核糖體大亞基前體的組裝、核糖體大亞基組裝、細(xì)胞代謝途徑、基因表達(dá)等生物學(xué)過(guò)程，結(jié)構(gòu)分子活性、核糖體的結(jié)構(gòu)組成等分子功能和胞質(zhì)部分、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器、胞內(nèi)細(xì)胞器等細(xì)胞組成，參與到KEGG通路核糖體途徑；Capana10g002431，GO注釋到細(xì)胞代謝過(guò)程、翻譯、肽生物合成過(guò)程等生物學(xué)過(guò)程，結(jié)構(gòu)分子活性、核糖體的結(jié)構(gòu)組成等分子功能和胞質(zhì)、細(xì)胞器、胞漿大核糖體亞基等細(xì)胞組成，參與到KEGG通路核糖體途徑；Capana01g000098，GO注釋到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白定位的建立、靶向膜的共翻譯蛋白、胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)壬飳W(xué)過(guò)程，7 S RNA結(jié)合、RNA結(jié)合、核酸結(jié)合等分子功能和胞質(zhì)、信號(hào)識(shí)別粒子等細(xì)胞組成，參與到蛋白質(zhì)輸出和聚糖生物合成途徑等KEGG通路。

2.5 候選蛋白的確定

兩個(gè)辣椒品系的蛋白質(zhì)分析共鑒定到504個(gè)顯著差異表達(dá)蛋白，其中421個(gè)含有保守結(jié)構(gòu)域，365個(gè)注釋到GO數(shù)據(jù)庫(kù)，133個(gè)注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，130個(gè)存在蛋白互作關(guān)系。在這些差異表達(dá)蛋白中，51個(gè)蛋白有交集，其中在S 033-B中上調(diào)表達(dá)的蛋白有11個(gè)，其余40個(gè)在S 033-A中上調(diào)表達(dá)。通過(guò)GO和KEGG富集分析選取極顯著差異(p<0.01)表達(dá)的蛋白，同時(shí)結(jié)合蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析(Degree>10)，最終得到6個(gè)蛋白為關(guān)鍵候選基因(Capana01g002398、Capana05g002550、Capana09g001520、Capana05g002020、Capana10g001330和Capana06g001463)，且在S 033-B中均呈現(xiàn)負(fù)調(diào)控趨勢(shì)(圖7)。其中Capana01g002398和Capana05g002550含有相同蛋白保守結(jié)構(gòu)域，其GO富集到光合作用、光合作用光響應(yīng)、光合作用光收獲、前體代謝物和能量的產(chǎn)生、光合作用光系統(tǒng)Ⅰ的光收集、應(yīng)激反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程，分子功能富集到離子結(jié)合、金屬離子結(jié)合、有機(jī)環(huán)化合物結(jié)合等，細(xì)胞組成富集到葉綠體類囊體、質(zhì)體類囊體、類囊體、葉綠體，KEGG富集到光合作用-天線蛋白途徑。Capana09g001520蛋白GO富集到生物學(xué)過(guò)程的光合作用、光合作用光響應(yīng)、光合作用光收獲、前體代謝物和能量的產(chǎn)生；分子功能富集到色素結(jié)合、離子結(jié)合、金屬離子結(jié)合等，細(xì)胞組成富集到葉綠體類囊體、質(zhì)體類囊體、類囊體、葉綠體，KEGG富集到光合作用-天線蛋白途徑。Capana05g002020和Capana10g001330含有相同蛋白保守結(jié)構(gòu)域，其GO富集到分子功能的果糖1,6-二磷酸1-磷酸酶活性，KEGG富集到光合作用生物的碳固定途徑。Capana06g001463蛋白GO富集到生物學(xué)過(guò)程能量耦合質(zhì)子輸運(yùn)、ATP的合成耦合質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)；細(xì)胞組成富集到細(xì)胞部分、膜部分、膜蛋白復(fù)合物等。

圖6 S 033-B_vs_S 033-A 組差異表達(dá)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖 Fig.6 Interaction network diagram of differentially expressed proteins in S 033-B_VS_S 033-A group

注：A表示差異表達(dá)蛋白、保守結(jié)構(gòu)域、GO、KEGG和蛋白互作的交集；B表示顯著性保守結(jié)構(gòu)域；C～D表示顯著富集GO和KEGG蛋白；E表示蛋白互作中Degree>10。 圖7 關(guān)鍵候選蛋白維恩圖Fig.7 Venn diagram of key candidate proteins

3 討 論

雜交育種技術(shù)作為一種遺傳育種手段，在農(nóng)業(yè)、經(jīng)濟(jì)作物等研究方面具有重要價(jià)值及意義。本研究對(duì)辣椒不育系和保持系中辣椒花芽進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，通過(guò)對(duì)兩個(gè)品系蛋白進(jìn)行鑒定，鑒定出總蛋白數(shù)為7 667個(gè)，可定量蛋白為7 629個(gè)，表明在花芽中，轉(zhuǎn)錄翻譯為蛋白較多，且有較多蛋白參與開(kāi)花過(guò)程。亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)主要在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、葉綠體和線粒體等部位，而細(xì)胞核同線粒體之間的相互作用會(huì)影響植物的形態(tài)特征，包括生長(zhǎng)和發(fā)育[12]。亞細(xì)胞定位普遍在細(xì)胞核等部位，由于其內(nèi)部存在相互作用，產(chǎn)生非功能性花粉，導(dǎo)致辣椒雄性花粉不育成為可能。

在504個(gè)差異蛋白中，有421個(gè)蛋白在數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)存在保守結(jié)構(gòu)域，保守結(jié)構(gòu)域主要為谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)，過(guò)氧化物酶結(jié)構(gòu)域，UDP-葡萄糖苷和UDP-葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域，熱激蛋白結(jié)構(gòu)域以及細(xì)胞色素結(jié)構(gòu)域等。植物生長(zhǎng)過(guò)程中，酶具有催化作用和非催化作用，起到保護(hù)植物機(jī)體以及調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)節(jié)細(xì)胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)等作用，推測(cè)不育系通過(guò)降低酶活性造成辣椒雄性不育。

GO富集分析主要集中在光合作用、光合作用光反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程，谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性、色素集合等分子功能，葉綠體類囊體、質(zhì)體類囊體等細(xì)胞組成中。Zhou等[13]通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)在不育系花芽中，差異基因主要富集到碳水化合物能量代謝、花粉壁合成、GO富集到蛋白質(zhì)合成與降解、類黃酮生物合成、植物激素信號(hào)傳導(dǎo)等生物學(xué)過(guò)程。Li等[14]通過(guò)iTRAQ-based蛋白質(zhì)組學(xué)探究大豆雄性不育的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)雄性不育的發(fā)生可能與能量供應(yīng)不足、蛋白質(zhì)合成和降解失衡、細(xì)胞程序性死亡有關(guān)；對(duì)差異表達(dá)蛋白分析發(fā)現(xiàn)，存在能量代謝、蛋白質(zhì)合成等過(guò)程。諸多植物不育的研究表明，能量代謝、蛋白質(zhì)合成等可能參與植物不育發(fā)育過(guò)程。本研究鑒定的6個(gè)候選蛋白同樣參與到能量代謝、光合作用、能量耦合質(zhì)子輸運(yùn)等生物學(xué)過(guò)程。上述研究涉及的差異表達(dá)蛋白主要富集在光合作用碳固定、細(xì)胞色素P 450、光合作用、單萜生物合成、類黃酮生物合成等途徑。通過(guò)KEGG富集分析，本研究鑒定的6個(gè)候選蛋白同樣注釋到光合作用和光合作用-天線蛋白，推測(cè)該不育系可能為光溫敏不育系，對(duì)光照較為敏感，因缺乏相應(yīng)的光合作用和能量代謝過(guò)程，導(dǎo)致辣椒雄性不育，無(wú)法產(chǎn)生可育花粉。

隨著對(duì)雜交育種的深入研究，越來(lái)越多的基因被克隆和功能驗(yàn)證，具有調(diào)控植物不育的功能。趙婷婷等[15]同源克隆辣椒MS1基因，發(fā)現(xiàn)NtMS1基因具有控制煙草花粉育性功能。目前已有眾多不育相關(guān)基因被克隆，陳文濤等[16]通過(guò)同源克隆，從紅麻中克隆出同紅麻雄性不育相關(guān)的HcMS1基因；王清華等[17]研究發(fā)現(xiàn),大蔥atp6基因在保持系中表達(dá)較不育系高1.14倍；王姣等[18]克隆了辣椒胞質(zhì)雄性不育CaCOX3基因，發(fā)現(xiàn)在小孢子成熟期時(shí)該基因在胞質(zhì)雄性不育系中表達(dá)明顯高于保持系，推測(cè)其可能引起能量代謝異常，造成不育。Jeong K等[19]研究發(fā)現(xiàn)了辣椒雄性不育基因CaMS1。本研究通過(guò)對(duì)差異蛋白系統(tǒng)鑒定發(fā)現(xiàn)，MS基因并未參與辣椒不育系花芽調(diào)控過(guò)程，表明S 033-B品系的不育系同CaMS 1調(diào)控的不育系屬不同類型，其不育系調(diào)控分子機(jī)制也不同。

綜上，本研究對(duì)兩個(gè)辣椒品系(不育系和保持系)的花芽進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)研究，但并未完全解析辣椒不育相關(guān)的關(guān)鍵候選蛋白，仍然存在不足，接下來(lái)將結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)、功能基因組學(xué)和基因編輯等方法，對(duì)辣椒不育系和保持系進(jìn)行系統(tǒng)深入研究，對(duì)候選蛋白進(jìn)行基因克隆和功能驗(yàn)證，以確定其關(guān)鍵蛋白。

4 結(jié) 論

在遵義朝天椒不育系和保持系中，鑒定出7 667個(gè)蛋白，其中可定量蛋白為7 629個(gè)，差異表達(dá)分析的結(jié)果顯示，保持系S 033-A中351個(gè)蛋白上調(diào)表達(dá)，不育系S 033-B中153個(gè)蛋白上調(diào)表達(dá)。亞細(xì)胞定位最多的為細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核以及葉綠體，GO和KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，大部分差異表達(dá)的蛋白主要富集在光合作用和光合作用碳固定。通過(guò)以上分析，最終確定6個(gè)蛋白為不育系關(guān)鍵候選蛋白，這些發(fā)現(xiàn)為辣椒雜交育種和雄性不育系利用提供了理論支撐。