張雨萌，宋博，楊寶雨，王曉丹，張文遠(yuǎn)，謝寧，逄曉陽，呂加平，張書文

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193）

0 引 言

近20 年來我國(guó)乳制品工業(yè)發(fā)展飛速，但嬰幼兒配方奶粉等產(chǎn)品需要的乳品配料長(zhǎng)期依賴進(jìn)口。這不僅消耗大量外匯，增加企業(yè)成本，而且產(chǎn)品的生產(chǎn)容易受到國(guó)際形勢(shì)、運(yùn)輸情況等不確定因素的影響。因此，乳品配料的空缺和短板對(duì)我國(guó)乳業(yè)發(fā)展的提出了重要挑戰(zhàn)。另外，我國(guó)北方地區(qū)會(huì)出現(xiàn)季節(jié)性原料奶相對(duì)過剩，賣奶難或奶價(jià)低迷現(xiàn)象，嚴(yán)重挫傷養(yǎng)殖積極性。本文利用膜分離技術(shù)生產(chǎn)乳品配料能有效提高鮮乳的利用價(jià)值，是乳品配料國(guó)產(chǎn)化的重要途徑。

膜分離是乳品加工中常用的一種分離技術(shù)，乳制品中的不同成分根據(jù)粒徑不同以壓力為驅(qū)動(dòng)力得到分離[1]。與其他分離手段相比，微濾是物理過程不會(huì)引入新的雜質(zhì)，能夠最大程度地保留樣品的天然結(jié)構(gòu)。同時(shí)，微濾處理的溫度較低，不會(huì)使乳清蛋白發(fā)生變性，確保蛋白質(zhì)以及其他成分的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。除此之外，微濾具有操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)節(jié)能、對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)[2]。可用于非熱除菌、乳制品濃縮、乳清脫鹽以及乳清蛋白和酪蛋白的分離?？追藏У萚3]和Zhang Wenjian 等[4]利用膜分離技術(shù)微濾除菌降低UHT 超高溫滅菌乳的纖溶酶活性，提高牛乳產(chǎn)品質(zhì)量并延長(zhǎng)其貨架期。Mccarthy 等[5]證明了可以在中試規(guī)模上采用低溫微濾（8.9 ℃）生產(chǎn)更接近母乳蛋白質(zhì)的乳制品成分。李珺柯[6]和張媛等[7]采用低溫微濾膜技術(shù)使β-酪蛋白從酪蛋白膠束中解離得到含有β-酪蛋白和乳清蛋白的新型復(fù)合蛋白配料以及脫除β-酪蛋白的牛乳。Zulewska等[8]比較了陶瓷膜與卷式有機(jī)膜的分離效果，結(jié)果表明陶瓷膜對(duì)乳清蛋白的脫除率更高，成本更低。

膜分離效果與物料組成、膜材質(zhì)、膜孔徑以及膜設(shè)備操作參數(shù)有關(guān)，目前采用分離牛乳成分的陶瓷膜規(guī)格多為100 nm，但關(guān)于不同孔徑陶瓷膜對(duì)乳品分離效果影響的研究較少，尤其是膜技術(shù)在羊乳成分分離方面的應(yīng)用研究。本研究以脫脂牛羊乳為原料，通過膜分離技術(shù)對(duì)其不同組分進(jìn)行分離，比較兩種孔徑的陶瓷膜對(duì)脫脂乳分離效率以及分離效果的影響。旨在為牛羊乳乳品配料加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮羊乳與鮮牛乳分別采自北京市海淀區(qū)羊媽媽牧場(chǎng)和北京三元綠荷第一牧場(chǎng)。

硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、硼酸、氫氧化鈉、鹽酸、硝酸、考馬斯亮藍(lán)、醋酸、甲醇（均為分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；β-巰基乙醇，美國(guó)Sigma 公司；8%～16%梯度膠，南京金斯瑞有限公司；寬范圍彩色預(yù)染蛋白質(zhì)Marker，北京天根生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PT-20TS LAB 殺菌機(jī)，日本Powerpoint 株式會(huì)社；FT15-A 碟片離心機(jī)，英國(guó)Armfield 公司；陶瓷膜中試設(shè)備（膜長(zhǎng)度為1020 mm，膜面積為0.24 m2/個(gè)，膜材料為Al3O2/ZrO2/TiO2，孔道數(shù)為19，膜截留面示意圖如圖1 所示），上海凱鑫分離技術(shù)有限公司；K9840 半自動(dòng)微量凱氏定氮儀，濟(jì)南海能儀器股份有限公司；DIgieye DigitalImaging 電子眼，英國(guó)VireVide公司；電泳儀，美國(guó)Bio-Rad 公司；GenoSens1850 凝膠成像系統(tǒng)，上海秦翔科學(xué)儀器有限公司；pH 211 pH計(jì)，意大利HANNA 有限公司。

圖1 陶瓷膜橫截面示意圖

1.3 方法

1.3.1 膜分離工藝流程

經(jīng)過巴氏殺菌（72 ℃，15 s）的原料乳，在8 000 rpm條件下用碟片離心機(jī)離心得到36 kg 脫脂乳。根據(jù)脫脂乳的粒徑分布選擇兩種孔徑（50、100 nm）的陶瓷膜進(jìn)行微濾處理，當(dāng)濃縮倍數(shù)為3 時(shí)，加入與透過液等質(zhì)量的去離子水（24 kg）進(jìn)行洗濾操作，此過程重復(fù)兩次。膜處理過程中通過換熱器控制循環(huán)罐中料液溫度為50 ℃，進(jìn)口壓力0.18 MPa，出口壓力0.08 MPa，壓差0.1 MPa，液體流速為130 L/min，收集3 個(gè)階段的透過液和截留液待測(cè)，工藝流程如下。

圖2 膜分離工藝流程圖

1.3.2 粒徑分布測(cè)定

采用MicrotracS3500 激光粒度分析儀測(cè)定脫脂乳蛋白質(zhì)粒徑分布。調(diào)零后進(jìn)樣測(cè)定粒徑分布。

1.3.3 膜通量、脫除率的測(cè)定

式中：m1為滲透液中物質(zhì)質(zhì)量（kg）；m2為脫脂乳中物質(zhì)質(zhì)量（kg）。物質(zhì)可以是蛋白質(zhì)、乳糖、礦物質(zhì)等。

1.3.4 不同分離組分含量測(cè)定

采用凱氏定氮法測(cè)定各階段物料中的總氮（AOAC 991.20;33.2.11）、非蛋白氮（AOAC 991.21;33.2.12）和非酪蛋白氮（AOAC 998.05;33.2.64）含量，根據(jù)公式計(jì)算粗蛋白、真蛋白、酪蛋白和乳清蛋白含量。

粗蛋白含量（g/100 g）=總氮含量×6.38

真蛋白含量（g/100 g）=（總氮含量-非蛋白氮含量）×6.38

酪蛋白含量（g/100 g）=（總氮含量-非酪蛋白氮含量）×6.38

乳清蛋白含量（g/100 g）=真蛋白含量-酪蛋白含量

酪蛋白/真蛋白（%）=（酪蛋白含量/真蛋白含量）×100

固形物含量根據(jù)（AOAC 990.20;33.2.44）方法測(cè)定。

1.3.5 截留液和滲透液色度分析

采用電子眼測(cè)定脫脂乳以及3 次微濾過程中截留液和透過液的色度變化。儀器使用前進(jìn)行白平衡和顏色校正，待樣品放至室溫后，測(cè)定樣品的黑白值、紅綠值和黃藍(lán)值。每個(gè)樣品3 個(gè)平行。

1.3.6 SDS-PAGE 電泳分析

采用SDS-PAGE 對(duì)各階段的截留液和透過液進(jìn)行定性分析。將樣品蛋白濃度稀釋至為2 mg/mL。再與含有β-巰基乙醇的樣品緩沖液以1∶1 的體積比混合。99 ℃水浴加熱5 min，離心（500 g，2 min）。取10 μL樣品上樣，在140 V 條件下運(yùn)行40 min。電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)R-250 染色30 min，脫色2 次至條帶清晰。使用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.3.7 膜分離過程中樣品pH 測(cè)定

使用校準(zhǔn)后的pH 計(jì)對(duì)各階段截留液和透過液的pH 進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品測(cè)定3 次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，并用Origin Pro 9.1 軟件作圖。采用方差分析比較不同樣品的均值差異，P＜0.05 表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 粒徑測(cè)定

如圖3 所示，脫脂羊乳的粒徑分布包括78～531 nm和3.58～5.56 μm 兩個(gè)范圍，其中低粒徑分布的顆粒約占總數(shù)的98.3%。有研究表明羊乳中單個(gè)脂肪球粒徑范圍為0.73～8.58 μm[10]；而酪蛋白粒徑分布為91.3～1381 nm[11]。因此粒徑分布圖中右側(cè)峰可能是離心脫脂后殘余的脂肪球，左側(cè)為酪蛋白。乳清蛋白粒徑低于S3500 激光粒度儀的最低檢測(cè)線（10 nm），因此無乳清蛋白粒徑分布。脫脂牛乳酪蛋白粒徑分布范圍是20～700 nm[9]。

圖3 脫脂羊乳的粒徑分布

根據(jù)乳清蛋白和酪蛋白粒徑的差異，理論上可以采用平均膜孔徑為10～78 和10～43.8 nm 的陶瓷膜分離羊乳和牛乳中的蛋白成分。而實(shí)際選用膜孔徑一般是理論值的2～5 倍，即分離羊乳和牛乳的陶瓷膜孔徑分別為20～390 和20～219 nm。目前關(guān)于乳蛋白膜分離研究中多采用100～150 nm 平均孔徑的陶瓷膜[12]，但由于該膜孔徑較接近于牛羊乳的平均粒徑，在分離過程可能出現(xiàn)膜孔堵塞的情況從而影響分離效率，因此可以考慮使用孔徑更小的膜。目前用于乳品加工業(yè)中的膜材料包括有機(jī)膜、陶瓷膜和不銹鋼膜等，與其他膜材料相比，陶瓷膜使用壽命長(zhǎng)，應(yīng)用范圍廣，具有耐熱性和耐酸堿性[13]。結(jié)合現(xiàn)有的膜規(guī)格，本研究采用50 nm及100 nm 陶瓷膜分離牛羊乳中蛋白組分，并對(duì)分離效果進(jìn)行比較。

2.2 膜通量測(cè)定

在進(jìn)口壓力0.18 MPa，出口壓力0.08 MPa，壓差0.1 MPa，樣品溫度50 ℃的條件下，分別使用100 nm和50 nm 陶瓷膜對(duì)脫脂乳進(jìn)行膜分離處理。如圖4 所示，脫脂牛乳和羊乳的膜通量均隨著微濾過程的進(jìn)行而降低，這主要是由于膜分離過程中截留液的蛋白含量不斷增加，液體黏度增加，降低了傳質(zhì)速率所致；同時(shí)膜表面濃差極化作用增強(qiáng)，表面膜阻力增大，造成膜通量進(jìn)一步下降[9]。加去離子水洗濾會(huì)破壞濃差極化，降低表面膜阻力，因此階段2、3 的初始膜通量會(huì)高于階段1、2 的最終膜通量。但階段2、3 初始膜通量低于階段1 初始膜通量，這可能是是由于階段1 之后形成了無法消除的膜污染[14]，降低膜分離效率造成的。在脫脂羊乳膜分離過程中，100 nm 和50 nm 陶瓷膜的平均膜通量分別為90.58 kg/（m2·h）和96.89 kg/（m2·h）。脫脂牛乳50 nm 陶瓷膜的膜通量為80.61 kg/（m2·h），100 nm 陶瓷膜的平均膜通量為66 kg/（m2·h）[15]。

圖4 陶瓷膜分離過程膜通量變化

在乳品加工工業(yè)中，膜孔徑的選擇對(duì)生產(chǎn)效率和分離效果有著十分重要的影響。Hurt 等[16]和Zulewska等[8]采用單根100 nm 陶瓷膜在50 °C 條件下對(duì)巴氏殺菌脫脂牛乳分離的膜通量分別為54.2 kg/（m2·h）和54.08 kg/（m2·h），低于本研究中100 nm 陶瓷膜的平均膜通量，這可能由于本研究中膜設(shè)備中包含三根陶瓷膜，膜面積的增加減小了微濾過程膜表面極化的可能，同時(shí)也增加了入口處流體的湍動(dòng)程度，在入口處更難發(fā)生結(jié)垢現(xiàn)象。Adams 等[17]采用140 nm Isoflux 陶瓷膜在50 °C 條件下對(duì)脫脂牛乳進(jìn)行分離，階段3 的膜通量為55.21 kg/（m2·h），高于單根100 nm 陶瓷膜的膜通量，但低于本研究100 nm 和50 nm 陶瓷膜的膜通量，這說明膜孔徑對(duì)膜分離效率有顯著影響。兩種脫脂乳膜分離過程中，50 nm 陶瓷膜的膜通量均顯著高于100 nm 的膜通量（P＜0.05）。這可能由于脫脂乳中接近100 nm 粒徑的顆粒分布多于接近50 nm 的粒子，在膜分離過程中這些粒子可能會(huì)吸附到陶瓷膜上并堵塞膜通道，降低膜分離效率。比較相同孔徑下脫脂牛乳和脫脂羊乳的膜通量發(fā)現(xiàn)，在相同操作參數(shù)下，脫脂牛乳的平均膜通量（80.61 kg/（m2·h））均低于脫脂羊乳平均膜通量（96.89 kg/（m2·h））。這可能是由于脫脂牛乳和脫脂羊乳的粒徑分布差異造成的，脫脂牛乳在50 nm 和100 nm 粒徑分布的顆粒含量均高于脫脂羊乳，這意味著在膜分離過程中更易發(fā)生膜孔的堵塞。膜通量結(jié)果表明50 nm 陶瓷膜可用于分離脫脂羊乳與脫脂牛乳的蛋白成分，且分離效率均高于100 nm陶瓷膜。

2.3 SDS-PAGE 定性分析

如圖5 所示，采用SDS-PAGE 方法對(duì)50 nm 膜分離過程中的截留液和透過液進(jìn)行定性分析。結(jié)果顯示，截留液中都含有αs-酪蛋白（αs-CN）、β-酪蛋白（β-CN）、κ-酪蛋白（κ-CN）、β-乳球蛋白（β-Lg）和α-乳白蛋白（α-La）。酪蛋白條帶無明顯差異。透過液中含有β-乳球蛋白（β-Lg）和α-乳白蛋白（α-La）。Jorgensen 等[18]的毛細(xì)管電泳研究結(jié)果表明經(jīng)過50 nm和100 nm 陶瓷膜微濾后的透過液中酪蛋白含量可以忽略不計(jì)，截留液中含有酪蛋白以及少量乳清蛋白。Adams 等[19]的SDS-PAGE 結(jié)果與本結(jié)果一致。這說明50 nm 陶瓷膜幾乎可以完全截留酪蛋白。隨微濾次數(shù)增加，透過液的乳清蛋白條帶顏色變淺，這是由于每個(gè)微濾階段加入去離子水，乳清蛋白含量逐漸降低。這一結(jié)果與表5 脫除率結(jié)果一致，說明乳清蛋白脫除率降低，乳清蛋白在每個(gè)微濾階段都得到有效分離。

表5 牛、羊乳各組分各階段脫除率比較

圖5 脫脂乳、截留液和透過液的SDS-PAGE 圖譜

2.4 50 nm 陶瓷膜在牛乳和羊乳分離中的應(yīng)用

2.4.1 微濾階段牛、羊乳pH 變化

采用50 nm 陶瓷膜對(duì)牛乳和羊乳進(jìn)行微濾處理。如表1 所示，隨著微濾過程的進(jìn)行，牛乳和羊乳初始液、截留液和透過液的pH 均呈現(xiàn)顯著增加趨勢(shì)（P＜0.05）。這是由于在微濾過程中加入去離子水，使乳品初始液、截留液和透過液中原有的氫離子和緩沖鹽不斷被稀釋[17]。

表1 牛、羊乳在微濾各階段pH 的變化

2.4.2 各階段牛羊乳透過液和截留液成分變化

牛乳和羊乳透過液成分隨微濾階段的變化結(jié)果如表2 所示，固形物、粗蛋白、真蛋白和乳清蛋白含量隨微濾階段增加而顯著降低（P＜0.05）。這是由于在微濾過程中不斷加入去離子水，每個(gè)階段能透過陶瓷膜的蛋白成分越來越少。兩者透過液中均不含酪蛋白成分，說明酪蛋白被陶瓷膜截留在截留液中。采用140 nm Isoflux 陶瓷膜在50 ℃條件下對(duì)牛乳進(jìn)行微濾處理，透過液中固形物、真蛋白和乳清蛋白成分變化與本結(jié)果一致[17]。Mercier-Bouchard 等[20]采用100 nm 卷式有機(jī)膜對(duì)脫脂牛乳在濃縮倍數(shù)為3 的條件下進(jìn)行微濾，透過液中含有少量酪蛋白。說明50 nm 陶瓷膜能夠有效分離酪蛋白和其他成分。

表2 牛、羊乳在微濾各階段透過液的成分變化

牛乳和羊乳截留液成分在微濾各階段變化如表3所示，在微濾過程中，固形物、粗蛋白、真蛋白、乳清蛋白含量均顯著降低（P＜0.05）。這是由于在微濾過程中乳糖、乳清蛋白、礦物質(zhì)和小分子氮化合物會(huì)通過陶瓷膜被脫除。以脫脂牛乳為原料時(shí)，隨著微濾過程的進(jìn)行，截留液中酪蛋白含量顯著降低（P＜0.05）。而牛乳透過液中幾乎不含酪蛋白成分，這一現(xiàn)象可能是由于部分酪蛋白被截留在陶瓷膜表面及膜孔中造成的。不僅導(dǎo)致膜通量降低，還會(huì)造成蛋白得率的下降。但以羊乳為原料時(shí)，隨微濾過程進(jìn)行，3 個(gè)階段下的酪蛋白含量沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。有研究采用100 nm GP 陶瓷膜對(duì)脫脂牛乳進(jìn)行微濾處理，隨微濾過程進(jìn)行截留液中酪蛋白含量沒有顯著變化，階段3 得到的截留液中酪蛋白占真蛋白的91.57%[21]。說明50 nm 陶瓷膜能夠完全截留羊乳中的酪蛋白成分，且膜孔不易被蛋白堵塞，能夠有效分離乳清蛋白。

表3 牛、羊乳在微濾各階段截留液的成分變化

2.4.3 微濾階段牛羊乳透過液和截留液色度變化

乳中的酪蛋白膠束和脂肪等膠體顆粒能夠均勻地反射所有波長(zhǎng)的可見光，白光下乳品呈現(xiàn)白色，乳品中同時(shí)含有胡蘿卜素和葉黃素使乳品呈現(xiàn)乳黃色[22]。牛乳、羊乳透過液和截留液隨微濾過程的色度變化趨勢(shì)一致。與脫脂乳相比，隨微濾階段的增加截留液的顏色發(fā)生顯著變化（P＜0.05），樣品逐漸偏亮、偏紅和偏藍(lán)。Adams 等[17]采用140 nm Isoflux 陶瓷膜在50 ℃條件下對(duì)牛乳進(jìn)行微濾處理，截留液的色度變化趨勢(shì)與本研究結(jié)果一致。這是陶瓷膜將脫脂乳中的乳清蛋白、礦物質(zhì)、維生素等成分分離到透過液中，截留液酪蛋白含量顯著增加造成的。50 nm 陶瓷膜微濾得到的牛、羊乳透過液均澄清如圖6 所示，有研究采用200 nm 卷式有機(jī)膜進(jìn)行微濾，得到的透過液外觀渾濁[20]，說明50 nm 陶瓷膜分離效果優(yōu)于200 nm 卷式有機(jī)膜，得到的透過液中不含酪蛋白，與料液成分結(jié)果一致，見表4。透過液隨微濾過程進(jìn)行顏色變淺，亮度值無顯著變化，紅綠值顯著增加，黃藍(lán)值顯著降低（P＜0.05）。透過液中含有維生素成分，并且隨微濾階段增加被去離子水稀釋，含量降低，因此透過液顏色逐漸變淺。

圖6 牛、羊乳在微濾各階段透過液和截留液的外觀比較（a、c 為牛乳；b、d 為羊乳）

表4 牛、羊乳在微濾各階段透過液和截留液的色度變化

2.4.4 微濾階段牛羊乳脫除率的比較

牛乳和羊乳在微濾各階段的脫除率呈顯著降低趨勢(shì)，與SDS-PAGE 結(jié)果一致，累計(jì)脫除率增加。乳清蛋白總脫除率達(dá)到96%以上，鈣脫除率達(dá)到31%以上，磷脫除率達(dá)到55%以上。有研究采用20 nm 不銹鋼膜對(duì)脫脂牛乳進(jìn)行3 倍濃縮、3 次洗濾，乳清蛋白累積脫除率為92.38%[23]。采用300 nm 有機(jī)膜對(duì)脫脂牛乳微濾處理，最終乳清蛋白累積脫除率為70.3%[24]。Hurt 等[25]采用100 nm 陶瓷膜對(duì)脫脂牛乳進(jìn)行3 倍濃縮3 次洗濾，乳清蛋白累積脫除率在96%以上。本研究在不阻擋乳清蛋白透過陶瓷膜的理想條件下，理論乳清蛋白累積脫除率為98%，實(shí)際值與其接近，表明50 nm 陶瓷膜能夠有效分離乳清蛋白和酪蛋白，為該技術(shù)在乳品加工業(yè)中的推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

3 結(jié) 論

本研究采用50、100 nm 陶瓷膜在50 ℃條件下對(duì)脫脂牛乳和脫脂羊乳進(jìn)行微濾處理。脫脂牛乳和脫脂羊乳在50 nm 陶瓷膜分離平均膜通量分別為80.61 kg/（m2·h）和96.89 kg/（m2·h），都高于100 nm 陶瓷膜中的膜通量。SDS-PAGE 結(jié)果表明，牛乳和羊乳在50 nm 陶瓷膜中的分離效果也優(yōu)于100 nm 陶瓷膜。牛乳和羊乳在50 nm 陶瓷膜分離過程中截留液和透過液成分結(jié)果表明牛、羊乳的酪蛋白和乳清蛋白都能得到有效分離，乳清蛋白脫除率高達(dá)96%以上。本研究可為牛乳和羊乳的乳基配料加工提供一定理論和數(shù)據(jù)參考。