臧銘圻 ，劉彤宇 ，王思宏 ，金麗華 *

（1.東北林業(yè)大學 生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.延邊大學 分析測試中心，吉林 延吉 133002）

八寶景天Hylotelephium erythrostictum為景天科多年生肉質(zhì)草本植物[1]，有研究表明，八寶景天具有清熱解毒、活血止痛等功效，外用可治療咽喉腫痛、跌打損傷、疔瘡癰腫和高血壓等病癥，內(nèi)服可治療蕁麻疹和乳腺炎等病癥[2]。

果蠅屬于雙翅目昆蟲，具有體積小、易飼養(yǎng)、繁殖快、后代數(shù)目多等優(yōu)點。果蠅在研究遺傳與動物發(fā)育等領域已經(jīng)成為重要的模式生物，在生理、疾病和免疫反應等方面研究中同樣具有重要地位[3]。腸道不僅是生物體重要的消化器官，也是最大的免疫器官。果蠅的腸道中存在一種多功能腸道干細胞（intestinal stem cells，ISCs），其具有干細胞的特性。這類細胞可以通過分裂產(chǎn)生新的同類干細胞和腸下皮細胞（enteroblasts，EBs）[4]。腸下皮細胞經(jīng)過進一步分化過程形成具有分泌功能的腸內(nèi)分泌細胞（enteroendocrine cells，EEs）和具有營養(yǎng)吸收功能的腸上皮細胞（enterocytes，ECs）[5-6]。果蠅腸道免疫應答反應可以使腸道上皮細胞產(chǎn)生大量的活性氧自由基（ROS）和抗菌肽，從而保護腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)[3]。正常情況下，果蠅腸道內(nèi)的ROS 水平較低，但外源物質(zhì)或致炎因子會刺激EC 細胞導致腸道細胞內(nèi)ROS 水平升高。同時，EC 細胞可以通過激活腸道的JAK/STAT 等途徑誘導腸道干細胞增殖，從而補充受到損傷的腸上皮細胞，并維持腸道穩(wěn)態(tài)[7]。

目前國內(nèi)外對八寶景天影響腸道干細胞分化及腸道修復的研究較少，大部分研究主要集中在其藥理特性和景觀應用，如八寶景天對土壤中重金屬元素具有吸附積累作用，其乙醇提取物可以清除自由基、具有抗氧化作用等[2]。因此，根據(jù)八寶景天具有治療炎癥的特性，可以進一步探究其對腸道炎癥的影響[2]。本試驗利用致炎因子十二烷基硫酸鈉（SDS）誘導果蠅腸道損傷以后，通過喂食八寶景天水提物，分析果蠅生存率、腸道上皮死亡細胞數(shù)量、腸道內(nèi)ROS 水平、腸道前體細胞形態(tài)和數(shù)量、腸道形態(tài)變化等，探究八寶景天水提物對致炎因子引起的果蠅腸道干細胞損傷的修復效果。

1 材料、試劑及主要儀器

1.1 動 物

野生型黑腹果蠅Drosophila melanogaster的w1118品系和esg-Gal4 UAS-GFP品系轉(zhuǎn)基因果蠅為試驗室保存。果蠅培養(yǎng)條件為：溫度（25±0.5）℃、相對濕度60%～70%。

1.2 試 劑

十二烷基硫酸鈉（SDS）購自美國 Amresco 公司，百草枯（paraquat，PQ）購自美國 Sigma 公司，7-氨基放線菌素（7-AAD）、二氫乙啶（DHE）、綠色螢光蛋白（GFP）抗體、rabbit Alexa Fluor488 抗體和Hoechst 購自Thermofisher 公司。中藥八寶景天購自哈爾濱市人民同泰藥店，由東北林業(yè)大學生命科學學院馮富娟教授鑒定為景天科八寶景天。

1.3 儀 器

ALC-210.4 型電子分析天平購自北京賽多利斯公司，Elix5 型去離子水系統(tǒng)購自Millipore 公司，SZ51 型顯微鏡購自Olympus 公司，Zeiss Scope A1型熒光顯微鏡購自Zeiss 公司。

2 試驗方法

2.1 八寶景天水提物的制備

稱取20 g 八寶景天，加入200 mL 去離子水浸泡12 h，用中火熬制3 h，用紗布過濾后收集濾液。在剩余的濾渣中加入200 mL 去離子水，用同樣的方法再提取1 次。最后將兩次濾液合并，加熱濃縮至100 mL，即得到質(zhì)量濃度為200 mg·mL-1（20%）的八寶景天水提物，用去離子水將其稀釋至10%，置于冰箱4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 果蠅培養(yǎng)基的制備

稱取25 g 麥芽粉，放入60 ℃的200 mL 去離子水中浸泡20 min 后過濾，即為麥芽粉濾液。依次稱取瓊脂粉 2.8 g、酵母 8.4 g、黃豆粉 4.9 g、玉米粉35.6 g，再加入300 mL 去離子水，加熱至粘稠，邊攪拌邊加入麥芽粉濾液，煮沸后加入37.5 mL 麥芽糖飴，攪拌均勻后再次煮沸5 min，然后停止加熱，冷卻至 60 ℃左右，加入 2.5 mL 防腐劑（10% Nipagin），攪拌均勻后倒入果蠅管或果蠅瓶中。

2.3 果蠅生存率的測定

隨機收集3 組羽化3～5 d 的w1118品系果蠅，每組30 只，雌雄各半，饑餓處理2 h 后，分別置于不同的果蠅管中誘導培養(yǎng)，每個果蠅管中放入5 張圓形濾紙片，濾紙片分別用 400 μL 5 %蔗糖（SUC）、0.6%SDS 溶液（含5%蔗糖）和加入10%八寶景天水提物的0.6%SDS（含5%蔗糖）溶液浸濕，培養(yǎng)6 d，每24 h 更換1 次濾紙片，記錄存活果蠅數(shù)量，計算生存率

生存率（%）=每個時間節(jié)點果蠅的存活數(shù)/試驗開始時的總數(shù)

為進一步證明八寶景天水提物對其他致炎因子誘導后果蠅生存率影響，分別喂食PQ 和NaCl 后分析果蠅的生存率。6 mmol·L-1PQ 和 0.4 mol·L-1NaCl 環(huán)境下的生存率測定方法同上。以上每組試驗重復3 次。

2.4 果蠅腸道上皮細胞死亡情況測定

隨機收集3 組羽化3～5 d 的w1118品系雌果蠅，每組20 只，挑取處理方法同2.3，誘導培養(yǎng)96 h，每24 h 更換一次濾紙片。在顯微鏡下于PBS（NaCl 137 mmol·L-1，KCl 2.7 mmol·L-1，Na2HPO44.3 mmol·L-1，KH2PO41.4 mmol·L-1，調(diào)節(jié) pH 值為 7.2～7.4）中提取果蠅腸道（置于冰上），然后用7-AAD（1∶200）染色 30 min；用 PBS 清洗 4 次，每次 10 min；4% 多聚甲醛固定30 min；用PBS 清洗4 次，每次10 min；然后用 Hoechst（1∶500）染細胞核 10 min；最后用PBS 清洗3 次，每次5 min；使用70%甘油封片后置于熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄，試驗重復2 次。

2.5 果蠅腸道上皮細胞RROOSS水平的測定

挑取處理果蠅方法同2.3，誘導培養(yǎng)48 h，每24 h 更換一次濾紙片。顯微鏡下于常溫PBS 中提取果蠅腸道，然后用 1 mmol·L-1DHE（1∶200）即5 μmol·L-1DHE 染色 30 min；PBS 清洗 4 次，每次5 min；4%多聚甲醛固定5 min；然后用PBS 沖洗1次后，加入Hoechs（t1∶500）染色5 min；最后用PBS清洗3 次，每次3 min；70%甘油封片后置于熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄，試驗重復2 次。

2.6 果蠅腸道前體細胞形態(tài)與數(shù)量的測定

esg-Gal4 UAS-GFP品系果蠅自身攜帶綠色熒光蛋白GFP，且其能夠?qū)η绑w細胞進行特異性標記，根據(jù)這一特點對果蠅腸道前體細胞形態(tài)和數(shù)量進行測定。隨機收集3 組羽化3～5 d 的esg-Gal4 UAS-GFP品系雌果蠅，每組20 只。處理誘導方法同2.4，誘導時間為16 h。將分離出的腸道置于4%多聚甲醛中固定30 min；用PBST（PBS+0.1% Triton X-100）清洗 5 次，每次 10 min；使用 PBST+5%goat serum 封閉 30 min，加入一抗 rabbit-GFP（1∶200），4 ℃過夜。第 2 天用 PBST 清洗 5 次；用二抗rabbit Alexa Fluor488（1∶200）結(jié)合 2 h；用 PBST 清洗，然后用Hoechst（1∶500）染色10 min；最后再用PBST 清洗 4 次，每次 5 min；70% 甘油封片后置于熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄，試驗重復2 次。

2.7 果蠅腸道形態(tài)的測定

挑取處理果蠅及誘導方法同2.3。在顯微鏡下于常溫PBS 溶液中提取果蠅腸道，并使用70% 甘油封片后，置于自然光顯微鏡下觀察并拍照記錄，試驗重復2 次。

2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用ImageJ 軟件進行腸道長度、細胞數(shù)量、相對熒光強度等指標的測量統(tǒng)計，采用Prism 6 軟件進行統(tǒng)計學分析，組間差異采用單因素方差分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 八寶景天水提物對致炎因子誘導后果蠅生存率的影響

隨機收集w1118品系果蠅經(jīng)過喂食SDS 誘導腸道損傷6 d 后，生存率為11.11%，但添加了10% 八寶景天水提物的生存率為100%，與喂食SDS 組相比，果蠅生存率增加了88.89%，沒有出現(xiàn)死亡，兩組具有極顯著差異（P＜0.000 1）（圖 1 A）。

圖1 八寶景天對喂食SDS、PQ、NaCl果蠅生存率的影響

百草枯會導致輔酶耗盡與活性氧自由基的產(chǎn)生[8]，使機體產(chǎn)生多種應激反應，進一步釋放氧自由基、蛋白水解酶等物質(zhì)，從而加重生物體組織內(nèi)損傷[9]。喂食NaCl 會導致腸道中積累大量的免疫細胞，促炎性細胞因子增加，嚴重時還可加劇神經(jīng)炎癥[10]。同時高鹽環(huán)境會使果蠅腸道的微生物菌群紊亂，從而降低果蠅的運動能力與生存率[11]。

喂食PQ 組4 d 后的生存率為2.22%，但添加了10%八寶景天水提物的果蠅生存率為34.44%，兩組相比，添加八寶景天水提物組果蠅生存率增加了32.22%，也具有較大差異（P＜0.000 1）（圖 1 B）。培養(yǎng)至 5 d 時，與 PQ 組（生存率 0%）相比，添加了10%八寶景天水提物組的果蠅仍有存活，且存活率達到20.00%。此外，喂食NaCl 組6 d 后，果蠅生存率為13.33%，但添加了10% 八寶景天水提物的果蠅生存率為56.67%，與喂食NaCl 組相比，添加八寶景天水提物組果蠅生存率增加了43.34%，也具有很大差異（P＜0.000 1）（圖1 C）。本組結(jié)果說明八寶景天水提物能夠顯著抵御致炎因子對果蠅的損害作用，并由此延長果蠅的存活時間。

3.2 八寶景天水提物對致炎因子引起的果蠅腸道上皮細胞死亡的影響

結(jié)果表明（圖2），喂食蔗糖的果蠅腸道中僅能觀察到極少數(shù)的死亡細胞。經(jīng)過SDS 長時間誘導處理后，果蠅腸道上皮細胞中死亡細胞數(shù)量顯著增加（P＜0.000 1）。但是，添加八寶景天水提物后，腸道死亡細胞數(shù)量顯著減少，與喂食蔗糖組接近（P＜0.01）。由此可知，八寶景天可以非常有效地緩解致炎因子SDS 所造成的腸道上皮細胞大量死亡現(xiàn)象，從而緩解果蠅腸道由于外來因子誘導產(chǎn)生的損傷。

圖2 八寶景天對SDS誘導的果蠅腸道上皮細胞死亡數(shù)量的影響

3.3 八寶景天水提物對降低果蠅腸道內(nèi)過量RROOSS的作用

正常情況，生物體內(nèi)ROS 處于不斷產(chǎn)生與被抗氧化系統(tǒng)清除的狀態(tài)，整體保持動態(tài)平衡[12]。活性氧自由基使雙層膜結(jié)構(gòu)受到破壞并且對細胞器結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生損害，繼而損傷蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物大分子[13]。果蠅腸道在應對如SDS 等誘導因子產(chǎn)生的炎癥反應過程中會產(chǎn)生過量的ROS，引起腸道細胞損傷[14]。因此，利用DHE 染色標記不同條件下果蠅腸道細胞內(nèi)ROS 的含量（圖3），便于觀察與統(tǒng)計分析不同條件下果蠅腸道上皮細胞內(nèi)ROS 的水平差異。結(jié)果表明，在正常條件下，果蠅腸道上皮細胞內(nèi)ROS 含量很少，經(jīng)SDS 誘導48 h 后，果蠅腸道內(nèi)ROS 水平顯著升高，而添加八寶景天水提物后，果蠅腸道內(nèi) ROS 含量明顯減少（P＜0.000 1）。該結(jié)果表明，八寶景天水提物可以清除過量的ROS，緩解由致炎因子誘導而引起的腸道內(nèi)ROS 水平上升的情況，避免過多的ROS 對腸道細胞造成損傷。

圖3 八寶景天對SDS誘導的果蠅腸道上皮細胞ROS水平的影響

3.4 八寶景天水提物對致炎因子引起的果蠅腸道前體細胞的影響

SDS 等致炎因子誘導腸道干細胞過度增殖和分化，從而破壞腸道穩(wěn)態(tài)[7]。本試驗所用的esg-Gal4 USP-GFP轉(zhuǎn)基因果蠅中，其自身攜帶的綠色熒光蛋白（GFP）能特異性標記腸道干細胞（ISC）和腸下皮細胞（EB）[15]。當喂食蔗糖時，果蠅腸道內(nèi)前體細胞（ISC 和EB）大小與數(shù)目為正常水平。經(jīng)致炎因子誘導以后，腸道中的GFP 陽性細胞相對面積明顯增大，而且數(shù)量顯著增加（P＜0.000 1）。但是，添加八寶景天水提物后，腸道中的GFP 陽性細胞相對面積顯著減小，與SDS 組相比數(shù)目顯著降低，與只喂食蔗糖組的正常水平幾乎沒有區(qū)別。此結(jié)果表明，八寶景天水提物可以有效地抑制由SDS 誘導的果蠅腸道內(nèi)陽性細胞面積變大及前體細胞數(shù)量過度增加的現(xiàn)象，抑制其促進過度增殖和分化的活性（圖 4）。

圖4 八寶景天對SDS誘導后果蠅腸道前體細胞的影響

3.5 果蠅腸道形態(tài)變化

喂食SDS 誘導腸道細胞死亡，同時導致ROS水平升高，并引起腸道干細胞過度增殖和分化。以上生理活動都有可能引起腸道形態(tài)發(fā)生變化，因此分析八寶景天水提物對腸道長度的影響。隨機收集誘導后的果蠅并分離腸道，在顯微鏡下觀察果蠅腸道形態(tài)變化。喂食SDS 的果蠅和只喂食蔗糖的正常果蠅相比，喂食SDS 的果蠅腸道長度明顯縮短35.44%（P＜0.000 1）；而添加八寶景天水提物組的果蠅腸道長度比只喂食蔗糖的正常果蠅腸道長度縮短 6.63%（P＞0.05），且比喂食 SDS 的果蠅腸道長度增加了 44.62%（P＜0.001）（圖 5）。此結(jié)果也證明了八寶景天水提物可保護腸道上皮細胞免受SDS 誘導的炎癥損傷，抑制腸道長度的縮短。

圖5 八寶景天對SDS誘導后果蠅腸道形態(tài)的影響

4 討 論

果蠅腸道干細胞可以分化出同類ISC 與EB 細胞，而EB 細胞可以分化出EC 細胞與EE 細胞[15]。在正常條件下干細胞的增殖與分化活性較低，但是當腸道受到來自外源的病原體或致炎因子的刺激后，其干細胞增殖與分化的活性明顯增強[7]。果蠅喂食SDS 后，腸道干細胞增殖和分化速度顯著提高，其目的是補充凋亡或死亡的腸道上皮細胞，從而降低腸道損傷。但是，腸道上皮細胞過度的增殖與分化會破壞腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。腸道干細胞通過過度增殖分化以應對SDS 誘導產(chǎn)生的氧化應激，但在此過程中產(chǎn)生過量的ROS 會對腸道細胞造成損傷[16]。本試驗結(jié)果表明，八寶景天水提物能提高致炎因子SDS 誘導損傷后的果蠅生存率，緩解致炎因子誘導的上皮細胞大量死亡情況，降低腸道內(nèi)過量的活性氧（ROS）的水平，抑制前體細胞過度增殖與分化現(xiàn)象，維持腸道形態(tài)，從而保護腸道上皮細胞免受誘導損傷，維持腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)。由此可見，八寶景天可以緩解由致炎因子SDS 所造成的腸道損傷。果蠅的消化系統(tǒng)在干細胞形態(tài)與功能方面和脊椎動物存在一定的相似性[17]。本試驗結(jié)果在研究八寶景天對腸道上皮細胞的保護作用，開發(fā)相關治療藥物等方面具有一定的參考意義。