陳若璽， 鄭 勝， 郭春燕， 張 強

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬龍巖第一醫(yī)院皮膚科， 龍巖 364000)

銀屑病是一種炎性表皮過度增生性皮膚病，影響全球約2%～3%的人口，復(fù)發(fā)率高[1]。臨床上，其特征是表皮角質(zhì)細(xì)胞增生、角化不全和大量白細(xì)胞的皮膚浸潤，表現(xiàn)為皮膚表面有紅斑和鱗狀斑塊[2]。大量研究表明，細(xì)胞因子在銀屑病進(jìn)程中具有重要作用，白細(xì)胞介素(IL)-17、IL-22、IL-23和腫瘤壞死因子(TNF-α)的表達(dá)水平升高，誘導(dǎo)皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的過度增殖[3, 4]。

咪喹莫特(imiquimod，IMQ)，屬咪唑喹啉類化合物，是一種小分子免疫調(diào)節(jié)劑。咪喹莫特可作為Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)激動劑激活宿主的免疫反應(yīng)，引起免疫調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄，被發(fā)現(xiàn)可以通過IL-23/IL-17炎性反映軸、IL-27誘導(dǎo)自然殺傷細(xì)胞分泌Ⅱ型干擾素(interferon-γ，IFN-γ)、TNF-α、氧化應(yīng)激誘導(dǎo)粘附分子、趨化因子等多條途徑參與銀屑病樣皮炎的發(fā)生過程[5, 6]。由于其致病過程較為直接，發(fā)病速度快，故目前也有利用咪喹莫特造模小鼠銀屑病樣皮炎模型的實驗應(yīng)用。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)黃芪中含多糖、皂甙、黃酮、氨基酸等多種有效成分，這些活性成分均有促進(jìn)抗體生成和免疫反應(yīng)的作用，其中以對黃芪多糖(astragalus polysacharin，AP)的研究報道為多[7-9]。黃芪多糖是黃芪的主要活性成分之一，已有研究表明，黃芪多糖具有調(diào)節(jié)炎癥和免疫功能的作用，本文旨在探討黃芪多糖對咪喹莫特誘導(dǎo)銀屑病樣皮炎的干預(yù)作用及其機(jī)制，為黃芪多糖在臨床上用于治療銀屑病樣皮炎提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康C57BL/6小鼠40只，雌性，6～8周齡，由南京大學(xué)模型動物研究中心提供。將小鼠飼養(yǎng)在屏障環(huán)境中，小鼠在保持12 h的明暗循環(huán)，給予正常小鼠飼料與滅菌水適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。

1.2 主要試劑及儀器

黃芪多糖(批號：20170916，合肥中龍神力動物藥業(yè)有限公司)；麗科杰咪喹莫特乳膏(湖北科益藥業(yè)股份有限公司，貨號：120710)；醫(yī)用白凡士林(南京特納斯生物技術(shù)開發(fā)有限公司，貨號：20180130)；小鼠TNF-α(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，貨號：E-EL-M0049c)ELISA檢測試劑盒；小鼠IL-1β(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，貨號：E-EL-M0037c)ELISA檢測試劑盒；小鼠IL-6(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，貨號：E-EL-M0044c)ELISA檢測試劑盒。

微型高速離心機(jī)(美國Labnet，型號C2500-R-230V)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(日本ASONE，型號ICV-450)，全自動酶標(biāo)儀(美國Thermo Scientific，型號Multiskan MK3)，全自動全封閉組織脫水機(jī)(型號：Leica ASP200S)；石蠟包埋機(jī)(型號：Leica EG1150H)；半自動輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(型號：Leica RM2245)；全自動染色機(jī)(型號：Leica Autostainer XL)；全自動玻片封片機(jī)(型號：Leica CV5030)。

1.3 小鼠銀屑病模型的建立及分組設(shè)計

40只雌性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為空白對照組、模型組、黃芪多糖高劑量組(200 mg/kg)、中劑量組(100 mg/kg)和低劑量組(50 mg/kg)，共5組，每組8只。從小鼠背上刮去2 cm×2 cm面積的皮毛，除空白對照組外，用玻璃棒將5%咪哇莫特乳膏涂抹于其他各組小鼠背部，涂抹劑量為62.5 mg，1次/日，連續(xù)6 d。在建模的同時對各組實驗小鼠進(jìn)行分別給藥，給藥的方式為灌胃?？瞻讓φ战M、模型組小鼠灌胃等體積的0.9%生理鹽水；黃芪多糖高、中、低劑量組分別給予黃芪多糖(200 mg/kg)、黃芪多糖(100 mg/kg)、黃芪多糖(50 mg/kg)。給藥的容積均為 10 ml/kg 體質(zhì)量，1次/日，連續(xù)給藥6 d。于實驗第7日，小鼠麻醉后剪取背部皮膚，摘眼球取血，分離血清，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 小鼠皮損 PASI 評分

小鼠銀屑病模型評分標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)臨床銀屑病面積和嚴(yán)重程度指數(shù)(PASI)進(jìn)行客觀評分系統(tǒng)。將紅疹分為0 - 4級，0為無；1為輕微；2為中等；3為嚴(yán)重；4為非常嚴(yán)重[10]。每天記錄體重和得分。

1.5 ELISA檢測

用ELISA試劑盒檢測血清樣品中TNF-α、IL-1β、IL-6的水平。具體方法嚴(yán)格按照試劑盒操作說明。

1.6 實時定量PCR實驗

每組樣品加入1 ml Trizol，待細(xì)胞充分裂解，每組加入250 μl氯仿，常溫靜置5 min 后離心20 min。離心結(jié)束后，每組樣品加入相同體積的異丙醇，常溫靜置 5 min后離心30 min。離心結(jié)束后，除去上清，用75 %乙醇洗滌沉淀2次，常溫通風(fēng)處晾干，即得到RNA樣品。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。根據(jù)說明書配置PCR反應(yīng)體系，使用熒光定量PCR儀進(jìn)行Real-Time PCR，反應(yīng)程序為：預(yù)變性，50℃ 2 min；解鏈，95℃ 10 min；PCR反應(yīng)，95℃ 15 s，45個循環(huán)；60℃ 1 min。收集熒光實時定量 PCR數(shù)據(jù)，并分析結(jié)果。引物序列如下：TNF-α forward: 5’-CTGAACTTCGGGGTGATCGG-3’；TNF-α reverse: 5’-GGCTTGTCACTCGAATTTTGAGA-3’；IL-1β forward: 5’-GCAACTGTTCCTGAACTCAACT-3’；IL-1β reverse: 5’-ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT-3’；IL-6 forward: 5’-TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC-3’；IL-6 reverse: 5’-TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC-3’；β-actin forward: 5’-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3’；β-actin reverse: 5’-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3’。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)

分離小鼠腋窩淋巴結(jié)，制備單細(xì)胞懸液。使用FACS緩沖液中的表面抗原抗體進(jìn)行表面染色，然后用適當(dāng)?shù)目贵w在冰上染色30 min。使用活性染料消除死亡細(xì)胞。細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色用細(xì)胞固定液/細(xì)胞外膜液，固定細(xì)胞并滲透，加入FITC標(biāo)記的CD11b抗體進(jìn)行染色。利用BD公司FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測CD11b陽性細(xì)胞比例。

1.8 Western blot

用PBS漂洗細(xì)胞，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解，離心10 000 r/min，20 min，提取蛋白質(zhì)。用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，用8%～12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳。采用的是半干法轉(zhuǎn)移蛋白到硝酸纖維素膜。用1%牛血清白蛋白(BSA)封閉。后用PBS洗去BSA，一抗用PBST稀釋至工作液濃度，4℃孵育過夜。24 h后，用PBST清洗3次，每次5 min。用PBST稀釋二抗至工作液濃度，避光37℃恒溫?fù)u床反應(yīng)1 h。后用PBST清洗。用ImageJ Setup軟件掃描蛋白條帶的灰度值。檢測GSDMD和Caspase-11蛋白水平，內(nèi)參蛋白為β-actin，以目的蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值之比表示蛋白表達(dá)的相對水平。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 黃芪多糖對咪喹莫特誘導(dǎo)小鼠銀屑病樣皮膚炎癥的影響

與對照組相比，模型組小鼠皮膚表現(xiàn)為出鱗屑及紅斑，皮膚組織皮質(zhì)顯著增厚(P<0.01)，PASI 評分顯著增加(P<0.01)。與模型組相比，黃芪多糖高、中劑量組小鼠銀屑病樣皮損癥狀及皮膚組織皮質(zhì)增厚顯著減輕，且呈濃度依賴性(P<0.05，表1)， PASI 評分顯著減少，且呈濃度依賴性(P<0.01，表1)。與對照組相比，實驗第6日模型組小鼠體重顯著降低(P<0.01)，黃芪多糖高、中劑量組小鼠的體重下降被緩解(P<0.05，表2)。此外，與對照組相比，模型組小鼠脾臟重量顯著增加(P<0.01)，而與模型組相比，黃芪多糖高、中劑量組小鼠的脾臟重量顯著減少(P<0.05，表2)。以上結(jié)果表明，黃芪多糖能顯著改善咪喹莫特誘導(dǎo)銀屑病樣皮炎的癥狀。

Tab. 1 The epidermal thickness and clinical score of imiquimod-induced psoriasiform dermatitis n=8)

Tab. 2 The body weight and spleen weight of imiquimod-induced psoriasiform dermatitis n=8)

2.2 黃芪多糖對咪喹莫特誘導(dǎo)小鼠炎癥因子表達(dá)的影響

ELISA檢測結(jié)果表明，與對照組相比，模型組小鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌顯著增加(P<0.01)。與模型組相比，黃芪多糖高、中劑量組小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌減少，且高劑量組效果最顯著(P<0.05，表3)。實時定量PCR檢測結(jié)果表明，與對照組相比，模型組小鼠皮膚組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.01)。與模型組相比，黃芪多糖高、中劑量組小鼠皮膚組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)顯著減少，且高劑量組效果最顯著(P<0.05，表4)。上述結(jié)果表明，黃芪多糖可改善咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠炎癥因子的表達(dá)。

Tab. 3 The serum levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 in imiquimod-induced psoriasiform dermatitis mice(pg/ml, n=5)

Tab. 4 The mRNA levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 in imiquimod-induced psoriasiform dermatitis n=5)

2.3 黃芪多糖對咪喹莫特誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞浸潤的影響

利用流式細(xì)胞術(shù)研究黃芪多糖對咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病小鼠模型中免疫細(xì)胞浸潤的影響。實驗結(jié)果顯示，對照組小鼠CD11b+巨噬細(xì)胞比例為 3.51%±0.53%，模型組小鼠CD11b+巨噬細(xì)胞比例為22.29%±2.84%，黃芪多糖高劑量組小鼠CD11b+巨噬細(xì)胞比例為12.40%±1.56%。與對照組相比，模型組小鼠CD11b+巨噬細(xì)胞在淋巴結(jié)的浸潤顯著增加(P<0.01)。與模型組相比，黃芪多糖高劑量組小鼠CD11b+巨噬細(xì)胞在淋巴結(jié)的浸潤顯著減少(P<0.05)。進(jìn)一步檢測皮膚組織中與巨噬細(xì)胞相關(guān)的趨化因子mRNA表達(dá)水平的結(jié)果表明，與對照組相比，模型組小鼠皮膚組織中Ccl2、Cx3cl1和Cxcl10的mRNA表達(dá)水平顯著增加(P<0.01)。與模型組相比，黃芪多糖高劑量組小鼠皮膚組織中Ccl2、Cx3cl1和Cxcl10的mRNA水平顯著減少(P<0.05，表5)。

Fig. 1 The CD11b+ cell infiltration in lymph nodes of imiquimod-induced psoriasiform dermatitis mice

Tab. 5 The mRNA levels of Ccl2, Cx3cl1 and Cxcl10 in imiquimod-induced psoriasiform dermatitis n=5)

2.4 黃芪多糖對巨噬細(xì)胞焦亡的影響

檢測細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)的結(jié)果表明，與對照組相比，模型組小鼠巨噬細(xì)胞中GSDMD-N和Cleaved-caspase-11蛋白的表達(dá)顯著升高(P<0.01)，GSDMD和Pro-caspase-11蛋白的表達(dá)沒有顯著差異(P>0.05)。與模型組相比，黃芪多糖高、中劑量組小鼠巨噬細(xì)胞中GSDMD-N和Cleaved-caspase-11蛋白的表達(dá)顯著降低，且高劑量組效果最顯著(P< 0.05，表6)。進(jìn)一步檢測血清中LDH的結(jié)果表明，對照組小鼠血清中LDH水平為(1488.33±274.75)U/L，模型組小鼠血清中LDH水平為(7024.00±336.35)U/L，黃芪多糖高、中、低劑量組小鼠血清中LDH水平為(3042.41±453.64)U/L、(5207.29±451.25)U/L、(6015.31±771.26)U/L。與對照組相比，模型組小鼠血清中LDH的釋放顯著增加(P< 0.01)。與模型組相比，黃芪多糖高、中劑量組小鼠血清中LDH的釋放減少(P<0.05)。

Fig. 2 The protein expressions of GSDMD-N, GSDMD, cleaved-caspase-11 and pro-caspase-11 in macrophages of imiquimod-induced psoriasiform dermatitis mice

Tab. 6 The protein levels of GSDMD-N, GSDMD, cleaved-caspase-11 and pro-caspase-11 in macrophages of imiquimod-induced psoriasiform dermatitis n=5)

3 討論

銀屑病樣皮炎是一種常見的、慢性、炎癥性皮膚病，以皮膚紅斑、丘疹、鱗屑為主要特征，目前臨床尚無有效的治療方法[11]。組織病理學(xué)特點是，銀屑病樣皮炎組織中存在大量炎癥細(xì)胞[12]，具體為角質(zhì)形成細(xì)胞的過度增殖和分化異常、表皮大量中性粒細(xì)胞浸潤和真皮淺層血管周圍被以淋巴細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤[13]。目前，許多研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病與炎癥密切相關(guān)[14]。據(jù)報道，經(jīng)典的促炎細(xì)胞因子 TNF-α在銀屑病樣皮膚炎癥中發(fā)揮關(guān)鍵作用，導(dǎo)致體內(nèi)強烈炎癥的誘導(dǎo)炎性因子如 iNOS、COX-2、IL-6和 IL-1β的釋放[15]。因此，抗炎治療能緩解銀屑病樣皮膚炎癥。

據(jù)報道，巨噬細(xì)胞在銀屑病樣皮膚炎癥中發(fā)揮重要作用[16]。巨噬細(xì)胞主要由TLR 7、8 和 9表達(dá)，咪喹莫特的主要生物學(xué)效應(yīng)是通過對TLR 7和8的激動介導(dǎo)的[17]。銀屑病是一種細(xì)胞因子和趨化因子驅(qū)動的疾病，其病變是由于免疫細(xì)胞浸潤和角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖所致[18]。巨噬細(xì)胞通過激活TLR可以誘導(dǎo)多種炎性因子的產(chǎn)生[19]。除此之外，細(xì)胞焦亡也是巨噬細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子的重要因素。細(xì)胞焦亡又稱細(xì)胞炎性壞死，是一種程序性細(xì)胞死亡。在微生物感染時會導(dǎo)致巨噬細(xì)胞Caspase-11的激活，進(jìn)而引發(fā)GSDMD被切割，形成的N端GSDMD寡聚化在細(xì)胞膜上形成孔道，最終造成細(xì)胞焦亡[20]。細(xì)胞焦亡的發(fā)生導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂，引起細(xì)胞內(nèi)容物釋放進(jìn)而激活強烈的炎癥反應(yīng)。鑒于巨噬細(xì)胞活化和細(xì)胞焦亡在促炎因子釋放過程中發(fā)揮的重要作用，抑制巨噬細(xì)胞在皮膚組織中的浸潤和活化是治療銀屑病的可行策略。

有關(guān)黃芪多糖具有調(diào)節(jié)炎癥和免疫作用的研究已有多方面報道[21]，但目前就黃芪多糖對銀屑病樣皮炎的作用尚未有報道。本研究結(jié)果表明，黃芪多糖可以改善咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病，且高劑量組效果最明顯。已有研究證實，TNF-α、IL-1β和IL-6信號傳導(dǎo)在銀屑病發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用[22]，黃芪多糖治療可明顯抑制血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌以及皮損組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA 表達(dá)。在銀屑病中，巨噬細(xì)胞的浸潤是該疾病進(jìn)展的關(guān)鍵因素。而黃芪多糖減少皮損組織中巨噬細(xì)胞的浸潤，并降低Ccl2、Cx3cl1和Cxcl10的mRNA表達(dá)。細(xì)胞焦亡對于巨噬細(xì)胞活化至關(guān)重要。本研究結(jié)果提示，黃芪多糖能抑制Caspase-11和GSDMD的活化并降低LDH的釋放，說明黃芪多糖能抑制巨噬細(xì)胞焦亡。綜合以上研究結(jié)果表明，黃芪多糖能通過抑制巨噬細(xì)胞焦亡減少促炎因子釋放，改善咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮膚炎癥。