盛 濤， 孟慶斌， 李學(xué)齊， 孫彩玉， 賈明珠

(黑龍江科技大學(xué) 環(huán)境與化工學(xué)院， 哈爾濱 150022)

0 引 言

我國(guó)是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)大國(guó)，每年農(nóng)作物秸稈產(chǎn)量約9 億t，但絕大部分沒(méi)有被合理利用，這不僅導(dǎo)致資源的浪費(fèi)，同時(shí)也是溫室氣體的主要來(lái)源[1-3]。秸稈的主要成分是纖維素、半纖維素及木質(zhì)素。纖維素及半纖維素是重要的可再生碳水化合物，其糖化產(chǎn)物可作為生產(chǎn)清潔能源和高值化學(xué)品的原料。

秸稈類(lèi)生物質(zhì)的資源化一般需要預(yù)處理、糖化和發(fā)酵3個(gè)過(guò)程。其中，糖化是木質(zhì)纖維素類(lèi)生物質(zhì)資源化利用的核心步驟，也是限速步驟[4]。常見(jiàn)的秸稈糖化方式包括纖維素酶糖化法與酸糖化法。與酸糖化法相比，纖維素酶糖化法設(shè)備要求低，水解效率高，條件溫和且不產(chǎn)生影響下游發(fā)酵的抑制物。纖維素酶包括內(nèi)切葡聚糖苷酶(Endocellulose)、外切葡聚糖苷酶(Exocellulose)以及β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)，纖維素類(lèi)生物質(zhì)的糖化由3種纖維素酶協(xié)同作用完成。商品纖維素酶大多由里氏木霉(Trichoderma reesei)和黑曲霉(Asperillium niger)發(fā)酵產(chǎn)生。里氏木霉的內(nèi)切葡聚糖苷酶及外切葡聚糖苷酶的活性較高，但β-葡萄糖苷酶的活性較低；黑曲霉可高效降解木聚糖等半纖維素，但缺乏特定的纖維素酶組分[5]。單一真菌分泌的纖維素酶水解纖維素能力比較有限，為解決這個(gè)問(wèn)題，通常需要將不同真菌產(chǎn)生的纖維素酶進(jìn)行復(fù)配，以求達(dá)到最佳糖化效果，這直接增加了纖維素酶的成本。與真菌分泌的游離酶不同，厭氧細(xì)菌通過(guò)細(xì)胞表面分泌一種多酶復(fù)合物降解纖維素，其稱(chēng)為纖維小體。熱纖梭菌(Ruminiclostridiumthermocellum)是一種能夠利用纖維素的嗜熱厭氧革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，其產(chǎn)生的纖維小體是迄今為止研究最廣、降解纖維素效果最有效的纖維酶復(fù)合體之一[6]。但是，熱纖梭菌纖維小體降解纖維素的產(chǎn)物主要是纖維二糖，纖維二糖的積累會(huì)導(dǎo)致纖維小體的反饋抑制，嚴(yán)重影響了纖維素類(lèi)生物質(zhì)的糖化效率[7]。因此，找到具有纖維二糖降解能力的熱纖梭菌，研究其代謝纖維二糖的規(guī)律對(duì)提高生物質(zhì)能源利用至關(guān)重要。

本課題組在前期研究中篩選到一株可高效糖化木質(zhì)纖維素的微生物熱纖梭菌M3(R.thermocellumM3)[8]，菌株M3不僅可糖化纖維素類(lèi)底物，且糖化產(chǎn)物中單糖的含量高達(dá)97%，纖維二糖僅占2%左右，這說(shuō)明菌株M3可有效消除纖維二糖的反饋抑制。同時(shí)，批式發(fā)酵是目前應(yīng)用最為廣泛的細(xì)菌培養(yǎng)方式，培養(yǎng)基一次性投加，產(chǎn)品一次性收獲，工藝簡(jiǎn)單，時(shí)間短、效率高。在批式發(fā)酵過(guò)程中，可以獲得細(xì)菌代謝過(guò)程中的瞬時(shí)變化規(guī)律，更好地反應(yīng)其代謝特點(diǎn)。因此，筆者旨在通過(guò)批式培養(yǎng)R.thermocellumM3探究其在不同纖維二糖濃度下纖維素酶活變化和生長(zhǎng)特性，并篩選出與纖維二糖降解相關(guān)的差異基因，為構(gòu)建高效降解木質(zhì)纖維素菌株提供有效可靠的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源與培養(yǎng)基成分

熱纖梭菌R.thermocellumM3保藏在黑龍江科技大學(xué)環(huán)境與化工學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。

配置纖維二糖降解培養(yǎng)基1 000 mL，經(jīng)過(guò)高溫除氧和調(diào)節(jié)pH為7.5后裝入充好氮?dú)獾膮捬跗恐忻芊猓?15 ℃下滅菌15 min。培養(yǎng)基成分：K2HPO4，1.5 g/L；KH2PO4，3 g/L；MgSO4·7H2O，0.2 g/L;CaCl2·2H2O，0.05 g/L；(NH4)2SO4，1.0 g/L；NaCl，1.0 g/L；KCl，0.2 g/L；纖維二糖質(zhì)量濃度分別為10、20及30 g/L。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

所有樣本均采用100 mL厭氧瓶進(jìn)行培養(yǎng)，設(shè)置3種纖維二糖質(zhì)量濃度分別為10、20、30 g/L，分別按10%的菌體接種量于60 ℃和30 ℃、pH為7.5的條件下培養(yǎng)14 d。每24 h取一次樣，考察R.thermocellumM3降解纖維二糖的3種纖維素酶活變化及菌體生長(zhǎng)情況。

1.3 分析方法

內(nèi)切葡聚糖苷酶酶活：將1 mL粗酶液與1 mL用檸檬酸緩沖液配置的濃度為1%羧甲基纖維素鈉溶液混合后在50 ℃下振蕩30 min，用DNS法測(cè)量混合液中葡萄糖產(chǎn)量。一個(gè)酶活單位 [IU] 定義為每分鐘釋放1 μmol葡萄糖當(dāng)量的酶的量[9]。

外切葡聚糖苷酶酶活：將1 mL粗酶液與1 mL用檸檬酸緩沖液配置的濃度為1%微晶纖維素溶液混合后在50 ℃下振蕩30 min，用DNS法測(cè)量混合液中葡萄糖產(chǎn)量。一個(gè)酶活單位 [IU] 定義為每分鐘釋放1 μmol葡萄糖當(dāng)量的酶的量[9]。

β-葡萄糖苷酶酶活：測(cè)定方法參照Ghose等(1987)[10]所描述的方法，以4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)為底物測(cè)定β-葡萄糖苷酶活性。在60 ℃下，將樣品與含有2 mmol pNPG、50 mmol檸檬酸鹽緩沖液和15 mmol CaCl2(pH=6)的200 μL溶液孵育20 min，添加50 μL 1 mol的Na2CO3后終止反應(yīng)，并測(cè)量405 nm處的吸光度。β-葡萄糖苷酶活性表示為單位體積酶液每分鐘所產(chǎn)生pNP的量(μmol)。

細(xì)胞生長(zhǎng)量：以菌體吸光度值變化代表細(xì)胞增長(zhǎng)變化趨勢(shì)，采用分光光度計(jì)在600 nm處測(cè)定樣品的吸光度值代表菌濁η，樣品與空白培養(yǎng)基之間的差值即細(xì)胞濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 底物質(zhì)量濃度

圖1是R.thermocellumM3在溫度為60 ℃的條件下，以不同質(zhì)量濃度纖維二糖為底物產(chǎn)纖維素酶的酶活變化情況。從圖1可以看出，底物質(zhì)量濃度為10 g/L時(shí)，R.thermocellumM3的β-葡萄糖苷酶活性最高為0.314 IU/mL，隨著底物質(zhì)量濃度從10 g/L增長(zhǎng)到30 g/L時(shí)，β-葡萄糖苷酶活性出現(xiàn)了不同程度降低。較高的底物負(fù)荷可以節(jié)約工藝的成本，但過(guò)高的底物質(zhì)量濃度會(huì)對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)形成反饋抑制,進(jìn)而影響纖維素酶的分泌。有研究表明，當(dāng)纖維二糖濃度超過(guò)2%時(shí)，熱纖梭菌的生長(zhǎng)會(huì)受到抑制[12]。值得注意的是,R.thermocellumM3生長(zhǎng)在不同質(zhì)量濃度纖維二糖下分泌的β-葡萄糖苷酶活性展示出了相同的趨勢(shì)，先降低再逐漸升高并存在一定的延滯期，相比于其他兩種質(zhì)量濃度的樣本，纖維二糖質(zhì)量濃度為10 g/L的樣本在培養(yǎng)初期可以觀察到更明顯的下降趨勢(shì)。推測(cè)菌株在纖維二糖生長(zhǎng)初期所測(cè)得的β-葡萄糖苷酶活來(lái)自于種子液，此時(shí)β-葡萄糖苷酶被用來(lái)分解纖維二糖產(chǎn)生葡萄糖為細(xì)菌的生長(zhǎng)提供原料并幫助細(xì)菌逐漸適應(yīng)新的生存環(huán)境，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度過(guò)高時(shí)會(huì)抑制菌株對(duì)底物的利用。表1為不同溫度下、不同質(zhì)量濃度纖維二糖對(duì)R.thermocellumM3菌體生長(zhǎng)的影響。培養(yǎng)溫度為30 ℃、底物質(zhì)量濃度為10、20、30 g/L時(shí)，菌體的菌濁分別記為η30-10、η30-20、η30-30；培養(yǎng)溫度為60 ℃、底物質(zhì)量濃度為10、20、30 g/L時(shí)，菌體的菌濁分別記為η60-10、η60-20、η60-30。

圖1 60 ℃下不同底物質(zhì)量濃度下R. thermocellum M3降解纖維二糖酶活特性Fig. 1 Enzyme activity characteristics of R. thermocellum M3 degrading cellobioseunder different substrate concentrations at 60 ℃

從表1中可以看出R.thermocellumM3在纖維二糖上生長(zhǎng)出現(xiàn)了一定的延滯期。內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶是纖維素酶中至關(guān)重要的兩種酶，當(dāng)R.thermocellumM3生長(zhǎng)在以纖維二糖為碳源的底物上時(shí)，內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶始終呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，這是因?yàn)閮?nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的作用是降解纖維素?zé)o定型區(qū)域和結(jié)晶區(qū)域，由于酶的生產(chǎn)需要底物的誘導(dǎo)，所以該菌株在缺乏纖維素的底物中分泌的酶活性較低。Johnson 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，纖維二糖作為底物時(shí)可顯著抑制熱纖梭菌纖維小體中外切葡萄糖苷酶的合成。Raman[14]對(duì)熱纖梭菌生長(zhǎng)降解纖維二糖過(guò)程進(jìn)行定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析，結(jié)果表明，熱纖梭菌中的纖維素體亞基組成具有底物特異性調(diào)節(jié)能力，以更好地適應(yīng)生物體在不同條件下的生長(zhǎng)需要，與生長(zhǎng)在纖維素上相比，生長(zhǎng)在纖維二糖上時(shí)，錨定蛋白Olpb，外切葡聚糖酶基因CelS、CelK,內(nèi)切葡聚糖酶基因CelJ(GH9)表達(dá)降低。

表1 不同溫度、不同質(zhì)量濃度纖維二糖對(duì)R. thermocellum M3菌體生長(zhǎng)的影響

2.2 溫度條件

從圖2中可以看出，培養(yǎng)溫度為30 ℃時(shí)，R.thermocellumM3在3種不同底物質(zhì)量濃度下產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶活性始終高于內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶，這與R.thermocellumM3在高溫下降解纖維二糖的酶活特性相同。在以質(zhì)量濃度為10 g/L的纖維二糖培養(yǎng)基中所檢測(cè)出的β-葡萄糖苷酶酶活性最高，達(dá)到0.148 IU/mL，其次是質(zhì)量濃度為20 g/L和30 g/L的纖維二糖培養(yǎng)基，活性分別為0.124 IU/mL和0.113 IU/mL?？梢钥闯?隨著底物質(zhì)量濃度的升高，并沒(méi)有對(duì)β-葡萄糖苷酶的活性造成太顯著的影響。

圖2 30 ℃下R. thermocellum M3降解不同質(zhì)量濃度纖維二糖酶活特性Fig. 2 Enzyme activity characteristics of R. thermocellum M3 degrading different concentrations of cellobiase at 30 ℃

熱纖梭菌是一種革蘭氏陽(yáng)性嗜熱厭氧菌，在纖維素等為底物時(shí)的最佳生長(zhǎng)溫度為55～60 ℃[8]。從表1中可以看出，以纖維二糖為底物時(shí)R.thermocellumM3在30 ℃培養(yǎng)條件下的菌濁高于60 ℃。纖維二糖作為底物時(shí)，β-葡萄糖苷酶將纖維二糖水解為葡萄糖，葡萄糖進(jìn)入細(xì)菌的糖酵解環(huán)節(jié)生成丙酮酸，丙酮酸進(jìn)一步降解生成乙酸和乳酸等代謝副產(chǎn)物,同時(shí)為細(xì)胞的新陳代謝提供ATP。有研究發(fā)現(xiàn)[15]，高溫條件下有利于熱纖梭菌生長(zhǎng)，但纖維小體中承載纖維素酶的支架蛋白在高溫條件下不穩(wěn)定，因此細(xì)菌分泌的酶活穩(wěn)定性會(huì)受到抑制，進(jìn)而不能為細(xì)菌生長(zhǎng)提供足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量。同時(shí)，菌體產(chǎn)生的代謝副產(chǎn)物會(huì)影響菌體細(xì)胞本身的生長(zhǎng)。Herrer等[16]對(duì)熱纖梭菌在不同底物上的生長(zhǎng)溫度進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，熱纖梭菌的最佳生長(zhǎng)溫度并不是最佳酶活溫度，同時(shí)纖維素酶的分泌與細(xì)胞的生長(zhǎng)息息相關(guān)。

2.3 KEGG代謝通路

Sheng等[8]研究發(fā)現(xiàn)，R.thermocellumM3不僅可糖化纖維素類(lèi)底物，且糖化產(chǎn)物中單糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)97%，纖維二糖僅占2%左右。本研究的結(jié)果表明，R.thermocellumM3可以在纖維二糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過(guò)2%的底物上生長(zhǎng)，雖然β-葡萄糖苷酶的活性有所降低，但并沒(méi)有被完全抑制，R.thermocellumM3纖維小體可在一定程度上緩解纖維二糖的反饋抑制作用。為了研究差異基因涉及的通路，對(duì)差異基因進(jìn)行了KEGG代謝通路分析。結(jié)果顯示，與纖維二糖降解相關(guān)的基因包括BglA(EC3.2.1.86)、BglX(EC3.2.1.21)與BglB(EC3.2.1.21)，由圖3可以看出，BglA (EC3.2.1.86)基因涉及的通路是Gly-

圖3 R. thermocellum M3 降解纖維二糖KEGG相關(guān)通路(部分)Fig. 3 KEGG pathways of R. thermocellum M3 degrading cellobiose (part)

colysis(糖酵解)：map00010及Starch and sucrose metabolism(淀粉及蔗糖代謝)：map00500代謝通路。在淀粉及蔗糖代謝通路下，BglA主要的功能是將一分子磷酸化纖維二糖轉(zhuǎn)化為一分子葡萄糖和一分子磷酸化葡萄糖，隨后進(jìn)入糖降解途徑轉(zhuǎn)化為丙酮酸鹽并產(chǎn)生少量的ATP(能量)和NADH(還原力)[17]，與此同時(shí)，熊果苷與水楊苷類(lèi)物質(zhì)也可被BglA轉(zhuǎn)化為磷酸化葡萄糖，最終進(jìn)入糖酵解代謝路徑。BglX(EC3.2.1.21)和BglB(EC3.2.1.21)基因主要涉及淀粉及蔗糖代謝通路，BglB是熱纖梭菌中常見(jiàn)的β-葡萄糖苷酶基因，其主要的功能是將一分子纖維二糖分解為兩分子葡萄糖，有研究表明，BglB在有低濃度葡萄糖存在的時(shí)候會(huì)受到抑制，并且溫度較高會(huì)對(duì)該基因表達(dá)的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響[18]。

3 結(jié) 論

(1)R.thermocellumM3在批式培養(yǎng)下以纖維二糖為底物時(shí)，細(xì)菌的生長(zhǎng)具有延滯性，檢測(cè)出最大β-葡萄糖苷酶酶活為0.314 IU/mL，隨著底物濃度的升高，β-葡萄糖苷酶酶活逐漸降低，葡聚糖酶和外切葡聚糖酶酶活遠(yuǎn)低于β-葡萄糖苷酶酶活。

(2)以纖維二糖為底物時(shí)，R.thermocellumM3在30 ℃培養(yǎng)條件下的β-葡萄糖苷酶酶活低于60 ℃培養(yǎng)條件下，但菌體的生長(zhǎng)能力與酶活呈負(fù)相關(guān)。

(3)與纖維素相比，R.thermocellumM3降解纖維二糖有3個(gè)基因表達(dá)差異明顯，分別為BglA、BglB和BglX，以上基因涉及的代謝通路分別是糖酵解通路和淀粉與蔗糖代謝通路。