王 惠 戰(zhàn) 倩 穆高航 李秀峰 王藝璇 徐志偉 鞠吉雨

（濰坊醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，濰坊 261053）

遺傳因素在系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）發(fā)病中發(fā)揮重要作用［1］。目前人類全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）已發(fā)現(xiàn)100 多種狼瘡易感基因，但由于臨床研究的局限性，其致病機(jī)制極少在人體中得到確證。因此，研究自發(fā)性SLE模型小鼠發(fā)病機(jī)制對揭示人類SLE發(fā)病機(jī)制具有重要意義［2］。自發(fā)性SLE模型小鼠NZM2410品系中已發(fā)現(xiàn)3 個(gè)狼瘡易感基因座，分別為 Sle1、Sle2、Sle3。前期研究發(fā)現(xiàn)，Sle2 基因座內(nèi)上皮內(nèi)T 細(xì)胞的選擇和維持分子6（selection and upkeep of intraepithelial T cells 6，Skint6）基因發(fā)生點(diǎn)突變，提前形成終止密碼，導(dǎo)致蛋白翻譯中斷，因此推測這種突變可能與Sle2 基因座致病特性有關(guān)［3-4］。本研究通過CRISPR/Cas9 技術(shù)制備Skint6 基因突變小鼠模型，并對該模型小鼠脾臟淋巴細(xì)胞亞群比例變化進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 野生型B6-WT（B6 wild type）小鼠購自南京大學(xué)模式動(dòng)物中心；基因突變B6-Skint6M（B6 Skint6 mutant）小鼠委托賽業(yè)生物科技有限公司（廣州）制備，均為6 月齡，每組12 只，雌雄各半，飼養(yǎng)于SPF環(huán)境。所有實(shí)驗(yàn)操作均經(jīng)濰坊醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 試劑 考馬斯亮藍(lán)5×G-250、紅細(xì)胞裂解液購 自 Solarbio 公 司 ；RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser 試劑購 自 TaKaRa 公司；HRM 擴(kuò)增試劑購自Roche 公司；轉(zhuǎn)錄因子測定試劑盒購自eBioscience 公司；FACS 檢測所用抗體：大鼠抗小鼠CD16/CD32 抗體、PE 標(biāo)記的CD3、CD1d、PD-1、Foxp3 抗體、V450 標(biāo)記的 CD19、CD69、CD25 抗體、APC 標(biāo)記的 NK1.1、CD19、CXCR5 抗體、PE-Cy5 標(biāo)記的 CD4 抗體、FITC 標(biāo)記的 CD4、CD44、CD5、B220抗體均購自BD Pharmingen公司。

1.2 方法

1.2.1 B6-Skint6M小鼠制備及鑒定 將小鼠Skint6基因的 gRNA（guide RNA）和 含 W168*（TGG 至TGA）突變的供體寡核苷酸及Cas9 共同注射到小鼠受精卵中，產(chǎn)生靶向的敲入后代，gRNA 靶序列為：5'-ATGCATCCCCCCCAAACAGCACAGG-3'。SDS 法提取鼠尾DNA，根據(jù)小鼠基因組序列設(shè)計(jì)一對引物，其中正向引物：5'-CTCCATTCCATGTGAGGCT?GT-3'（113236415~113236435），反向引物：5'-CT?GTTTTGTTTTCAACCAGCTACA-3（'113236539~113-236516），擴(kuò)增片段長度 125 bp。HRM-PCR 篩選B6-Skint6M突變小鼠，反應(yīng)條件：先加入 2×Master Mix 10 μl，正反向引物各0.5 μl，MgCl23 μl，DNA 模板1μl，ddH2O補(bǔ)足體積至20μl。擴(kuò)增條件：預(yù)變性95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，57 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，45 個(gè)循環(huán)；HRM 程序 95 ℃ 1 min，40 ℃ 1 min，65 ℃ 1 s；冷卻40 ℃10 s。PCR產(chǎn)物進(jìn)行20 g/L瓊脂糖電泳和測序。測序引物為：5'-CACATTATACCTGGTAGGA?CAAAG-3'。

1.2.2 小鼠體質(zhì)量及脾臟指數(shù)的測定 CO2處死小鼠，稱取小鼠體質(zhì)量及脾臟質(zhì)量，計(jì)算脾臟指數(shù)=脾臟濕重（mg）/小鼠體質(zhì)量（g），并進(jìn)行比較。

1.2.3 小鼠尿蛋白測定 考馬斯亮藍(lán)G-250 法測定兩組小鼠尿蛋白，將標(biāo)準(zhǔn)品按0、2、4、6、8、12、16、20 μl分別加至96孔板，加1×PBS補(bǔ)足體積至20 μl。將收集的小鼠尿液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，取20 μl 加入96 孔板，各孔加入200 μl 稀釋后的染色液，室溫放置3~5 min，酶標(biāo)儀測定各樣本595 nm 處對應(yīng)的吸光度值（A595），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算兩組小鼠尿蛋白含量，連續(xù)測定3 d。

1.2.4 qRT-PCR 檢 測 小 鼠 皮 膚 Skint6 mRNA 表達(dá) CO2處死小鼠，取每只小鼠取皮膚約50 mg置于研磨器中，立即加入2 ml RNAiso Plus 提取皮膚總RNA 并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。Skint6 基因擴(kuò)增正向引物：5'-GCACATGGAAATTCGCTGGTT-3'，反向引物：5'-AAGAAGCAGTGGTAGGACCC-3'，擴(kuò)增片段為201 bp。以β-actin 為內(nèi)參，擴(kuò)增片段為200 bp。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性 2 min，94 ℃ 30 s，50 ℃30 s，72 ℃ 30 s，擴(kuò)增 40 個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物行 20 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR 產(chǎn)物條帶位置。根據(jù)ΔCt=CtGene?Ctβ-actin，2?ΔΔCt計(jì)算 mRNA 相對表達(dá)，各樣品重復(fù)3次。

1.2.5 FACS 測定小鼠脾臟淋巴細(xì)胞亞群 取小鼠脾臟中段約50 mg 置于研磨器中，加入3 ml PBS冰上充分研磨，轉(zhuǎn)至15 ml離心管，350 g 離心5 min，棄上清，加入7 ml 紅細(xì)胞裂解液重懸，冰上裂解5 min，混勻 2~3 次，加入 PBS 終止裂解，350 g 離心5 min，棄上清，PBS 洗滌細(xì)胞后計(jì)算脾細(xì)胞總數(shù)。流式染色緩沖液調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107個(gè)/ml并進(jìn)行免疫細(xì)胞染色，其中PE-CD3 標(biāo)記T 細(xì)胞、V450-CD19 標(biāo)記 B 細(xì)胞、PE-CD3、FITC-CD4 標(biāo)記輔助/誘導(dǎo) T 淋巴細(xì)胞、PE-CD3、Pacific blue-CD8 標(biāo)記細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞、PE-CD3、FITC-CD4、Pacific blue-CD8 標(biāo)記 DNeg 細(xì)胞、APC-NK1.1 標(biāo)記 NK 細(xì)胞、PE-Cy5-CD4、V450-CD69、FITC-CD44 標(biāo)記活化的 CD4+T 細(xì)胞、FITC-CD4、CD25-V450、PE-Foxp3 標(biāo)記調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞（Treg）、FITC-CD4、APC-CXCR5、PE-CD1d 標(biāo)記濾泡輔助性T（Tfh）細(xì)胞、APC-CD19、FITC-CD5、PECD1d標(biāo)記調(diào)節(jié)性B細(xì)胞（Breg）、PE-CD3、B220-FITC標(biāo)記非典型CD3+B220+細(xì)胞，每管加入100 μl 細(xì)胞懸液并加入1μl 封閉抗體（大鼠抗小鼠CD16/CD32抗體），4 ℃避光孵育10 min，分別加入相應(yīng)亞群標(biāo)記抗體進(jìn)行細(xì)胞表面分子染色，4 ℃避光孵育40 min，染色緩沖液洗滌2 次，400μl 染色緩沖液重懸細(xì)胞，300 目濾網(wǎng)過濾后上機(jī)檢測。Treg 亞群測定：根據(jù)上述步驟進(jìn)行CD4-FTIC、CD25-V450 抗體染色，染色結(jié)束后每管加入500 μl 破膜固定液，4 ℃避光孵育 40 min，加入 1 ml 破膜洗液 4 ℃ 、1 400 g 離心5 min，洗滌2次，加入Foxp3-PE抗體染色4 ℃避光孵育40 min，1 ml破膜洗液洗滌2次，過濾上機(jī)檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 FACS 檢測結(jié)果采用Flow10.0軟件進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad Prism 8.0軟件，計(jì)量資料采用表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05時(shí)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 B6-Skint6M小鼠鑒定 HRM-PCR 小鼠基因分型鑒定結(jié)果顯示：B6-WT 小鼠DNA 擴(kuò)增片段的TM值為 83.52 ℃；B6-Skint6+/?雜合子小鼠 DNA 擴(kuò)增片段TM 值為 82.30 ℃；B6-Skint6M小鼠 DNA 擴(kuò)增片段TM 值為 83.08 ℃，即小鼠 DNA 擴(kuò)增片段 TM 值B6-WT>B6-Skint6M>B6-Skint6+/?，可有效區(qū)分 3 種小鼠。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，擴(kuò)增片段長度為125 bp，符合預(yù)期。DNA 序列測定結(jié)果表明，B6-Skint6M在504位核苷酸發(fā)生G 到A 的改變，Skint6基因突變小鼠構(gòu)建成功（圖1）。

圖1 Skint6基因突變小鼠鑒定Fig.1 Identification of Skint6 gene mutant mice

2.2 qRT-PCR 檢 測 小 鼠 Skint6 mRNA 表 達(dá)qRT-PCR 結(jié)果表明，兩組小鼠皮膚均可檢測到Skint6 mRNA 表達(dá)，與對照組 B6-WT 小鼠相比，實(shí)驗(yàn)組B6-Skint6M小鼠mRNA 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，圖2）。

圖2 小鼠皮膚中Skint6 mRNA水平Fig.2 Skint6 mRNA level in mouse skin

2.3 Skint6 基因突變對小鼠體質(zhì)量、脾臟指數(shù)的影響 兩組小鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。B6-Skint6M雄性小鼠和雌性小鼠與相應(yīng)性別的B6-WT 小鼠組相比，脾臟指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，表1）。

表1 Skint6 基因突變對B6-WT 小鼠體質(zhì)量、脾臟指數(shù)的影響（，n=6）Tab.1 Effects of Skint6 gene mutation on body mass and spleen index of B6-WT mice（，n=6）

表1 Skint6 基因突變對B6-WT 小鼠體質(zhì)量、脾臟指數(shù)的影響（，n=6）Tab.1 Effects of Skint6 gene mutation on body mass and spleen index of B6-WT mice（，n=6）

Groups B6-WT ♂B6-Skint6M ♂B6-WT ♀B6-Skint6M ♀Weight/g 32.51±1.70 31.26±0.79 23.15±2.10 21.73±0.79 Spleen index/（mg·g?1）3.10±0.53 3.40±0.59 3.70±0.33 4.10±0.45

2.4 小鼠尿蛋白測定 兩組小鼠尿蛋白定量測定結(jié)果表明，與B6-WT組雄性小鼠尿蛋白相比，B6-Skint6M雄性小鼠尿蛋白含量明顯增高（P<0.001，圖3A）；同樣，與B6-WT 組雌性小鼠的尿蛋白相比，B6-Skint6M雌性小鼠尿蛋白含量也明顯增高（P<0.05，圖3B）。

圖3 Skint6基因突變對B6-WT小鼠尿蛋白影響Fig.3 Effects of Skint6 gene mutation on urine protein of B6-WT mice

2.5 Skint6 基因突變導(dǎo)致小鼠脾臟淋巴細(xì)胞亞群比例失調(diào) FACS 及細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果表明，與B6-WT小鼠相比，B6-Skint6M模型小鼠脾臟細(xì)胞總數(shù)及淋巴細(xì)胞總數(shù)明顯增多（P<0.01），其脾臟淋巴細(xì)胞亞群中CD3+T 細(xì)胞比例及細(xì)胞絕對數(shù)均明顯增高（P<0.01，圖4A；P<0.05，表2），CD19+B淋巴細(xì)胞比例明顯降低（P<0.05，圖4B，表2），但其細(xì)胞絕對數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，表2），NK1.1 細(xì)胞亞群比例及細(xì)胞絕對數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，表2）。進(jìn)一步分析兩組小鼠脾臟CD3+T 淋巴細(xì)胞亞群中CD4+T 和CD8+T 淋巴細(xì)胞亞群比例及細(xì)胞計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)與B6-WT 小鼠相比，B6-Skint6M小鼠脾臟CD3+T淋巴細(xì)胞亞群中CD4+T細(xì)胞亞群比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，表2），但其細(xì)胞絕對數(shù)明顯增多（P<0.05，表 2），CD8+T 細(xì)胞比例明顯降低（P<0.01，圖4C，表2），其細(xì)胞絕對數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，表2），CD4/CD8增高（P<0.01，表2）且DNeg細(xì)胞比例及細(xì)胞絕對數(shù)均明顯增高（P<0.01，圖4D；P<0.05，表2）；進(jìn)一步分析T 細(xì)胞膜分子表達(dá)發(fā)現(xiàn)，CD4+CD69+活化T 細(xì)胞比例及細(xì)胞絕對數(shù)均明顯增高（P<0.05，圖4F；P<0.01，表2），CD4+CD44hiT 細(xì)胞比例及其細(xì)胞絕對數(shù)均明顯增高（P<0.01，圖4E；表 2），Treg 比例及絕對數(shù)明顯降低（P<0.001，圖4H、表2），Tfh 細(xì)胞比例及絕對數(shù)明顯增高（P<0.05，圖4G、表2）。此外，B6-Skint6M小鼠脾臟Breg比例及細(xì)胞絕對數(shù)明顯增高（P<0.05，圖4I、表2）；CD3+T 淋巴細(xì)胞亞群中非典型CD3+B220+T 細(xì)胞亞群比例及細(xì)胞絕對數(shù)明顯增高（P<0.001，圖4J、表2）。

圖4 Skint6基因突變對小鼠脾臟淋巴細(xì)胞亞群的影響Fig.4 Effect of Skint6 gene mutation on mice spleen lymphocyte subsets

表2 兩組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞亞群比較（，n=6，%）Tab.2 Comparison of splenic lymphocyte subsets of two groups of mice（，n=6，%）

表2 兩組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞亞群比較（，n=6，%）Tab.2 Comparison of splenic lymphocyte subsets of two groups of mice（，n=6，%）

Note：Compared with control group，1）P<0.05，2）P<0.01，3）P<0.001.

Items Control（%）B6-Skint6M（%）1.39±0.041）2.87±0.15 1.19±0.102）3.48±0.192）0.02±0.003）0.53±0.091）0.51±0.061）0.74±0.083）Total WBC Total lymphocytes CD3+CD19+CD3+CD4+CD3+CD8+CD3+CD4–CD8–CD4/CD8 NK1.1 CD4+CD69+CD4+CD44hi Treg Tfh Breg CD3+B220+?Cell counts（×106）72.18±4.84?Cell counts（×106）93.58±4.972）72.54±0.3552.19±2.0565.40±0.533）60.46±1.792）41.68±1.04 53.79±1.17 53.78±0.76 40.86±0.64 21.51±1.89 27.39±0.19 10.76±0.94 8.28±0.84 47.38±1.512）49.02±1.461）56.48±1.19 36.48±1.292）6.20±0.191.27±0.147.55±0.542）26.98±1.601）27.83±1.60 13.45±0.971）8.81±0.78 1.78±0.121）1.27±0.04 4.69±0.58 1.49±0.09 4.55±0.21 1.93±0.28 4.17±0.35 1.19±0.07 1.43±0.06 1.27±0.04 2.44±0.18 0.80±0.08 2.47±0.26 0.13±0.02 0.30±0.04 0.35±0.04 0.30±0.02 1.39±0.041）4.68±0.67 1.89±0.131）5.60±0.252）0.34±0.042）5.55±0.391）1.64±0.151）2.77±0.293）

3 討論

NZM2410 小鼠是SLE 研究中常用的自發(fā)性紅斑狼瘡模型小鼠，具有典型的人類SLE 特征［5］。前期研究發(fā)現(xiàn)其Sle2c1rec1d1（rec1d1）亞基因座可以與Fas 基因缺陷的易感基因座lpr 協(xié)同作用，促進(jìn)B6-lpr 小鼠淋巴結(jié)和脾的增大、CD3+T 淋巴細(xì)胞亞群中非典型CD3+B220+T 細(xì)胞增多以及腎臟、肺炎加重［3］。經(jīng)對 rec1d1 亞基因座 DNA 全外顯子測序后發(fā)現(xiàn)，該亞基因座僅存在Skint6基因504位核苷酸G到A 的改變，造成Skint6 基因mRNA 提前出現(xiàn)終止密碼子，導(dǎo)致Skint6蛋白表達(dá)提前終止［5］。因此推測Skint6 基因突變可能是rec1d1 亞基因座的致病原因。本研究通過制備B6-Skint6M小鼠確定Skint6 突變基因突變是否為rec1d1亞基因座的致病基因。

Skint蛋白家族位于小鼠4號染色體上，包含11個(gè)Skint（Skint1~11）家族成員，胞外區(qū)與人類嗜酪蛋白家族分子同源，可調(diào)節(jié)小鼠皮膚 Vγ5Vδ1 γδT 細(xì)胞的發(fā)育和功能，多數(shù)成員表達(dá)于胸腺和皮膚，但Skint6僅表達(dá)于皮膚［6-9］。本研究結(jié)果表明，與6月齡B6-WT 小鼠相比，B6-Skint6M小鼠體質(zhì)量、脾臟指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。Skint6基因突變后其皮膚Skint6 mRNA 水平未見明顯變化。狼瘡性腎炎是SLE 最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，尿蛋白是其受累的主要標(biāo)志［10-12］。本研究對兩組小鼠蛋白尿定量檢測后發(fā)現(xiàn)B6-Skint6M小鼠尿蛋白含量高于B6-WT 小鼠，雄性小鼠尤為明顯。因此，Skint6 基因突變可能是rec1d1 亞基因座促進(jìn)B6-lpr 小鼠腎臟炎癥發(fā)生的原因。

T 淋巴細(xì)胞亞群的紊亂與SLE 發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切［13-14］。FACS 測定及細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果表明，與B6-WT 小鼠相比，B6-Skint6M組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞亞群中T 淋巴細(xì)胞比例及細(xì)胞絕對數(shù)明顯升高，B淋巴細(xì)胞比例降低，CD3+T淋巴細(xì)胞亞群中B220+細(xì)胞即非典型CD3+B220+T 細(xì)胞亞群比例及細(xì)胞絕對數(shù)明顯升高。另外，發(fā)現(xiàn)B6-Skint6M小鼠脾臟淋巴細(xì)胞亞群中CD4+CD44hiT 淋巴細(xì)胞，CD4+CD69+活化T細(xì)胞和Tfh比例及細(xì)胞絕對數(shù)提高，而Treg比例及細(xì)胞絕對數(shù)減少，說明體內(nèi)T 細(xì)胞整體處于亢進(jìn)狀態(tài)，反應(yīng)性明顯增強(qiáng)。全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）通過OASIS對兩個(gè)SLE GWAS 數(shù)據(jù)集整合分析后確定 CD44 是 SLE 相關(guān)基因［15］。研究表明，SLE 患者 T細(xì)胞中CD44表達(dá)增加，Treg絕對數(shù)減少或功能減弱可促進(jìn) SLE 發(fā)病及疾病活動(dòng)［16-17］。臨床 SLE 患者中，Treg減少，而CD4+CD69+活化T細(xì)胞表達(dá)增加，導(dǎo)致體內(nèi)免疫平衡失調(diào)，增強(qiáng)自身反應(yīng)性T 細(xì)胞活性［18-19］。Tfh 細(xì)胞在漿細(xì)胞形成和抗體分泌過程中發(fā)揮重要作用［20］。無論是在SLE 小鼠模型中，還是SLE 患者體內(nèi)，均可觀察到 Tfh 細(xì)胞異常擴(kuò)增［21-22］。SLE患者Tfh細(xì)胞水平和Bregs水平顯著相關(guān)，Tfh細(xì)胞可促進(jìn)Breg 擴(kuò)增［23］。本研究亦表明B6-Skint6M小鼠脾臟中Tfh 細(xì)胞、Breg 比例及細(xì)胞絕對數(shù)明顯上升。2020 年 ALEXANDE 等［24］研究表明，DNeg 數(shù)隨著MRL/lpr 小鼠疾病惡化而增加，且可加劇腎臟炎癥；臨床小兒SLE患者DNeg數(shù)與腎臟功能也顯著相關(guān)，因此DNeg 在狼瘡性腎炎中起重要作用，并可能成為狼瘡的標(biāo)志物。本研究表明，B6-Skint6M小鼠脾臟CD3+CD4?CD8?（DNeg）細(xì)胞比例及絕對數(shù)明顯增高。

綜上所述，本研究初步證實(shí)Skint6 基因突變可導(dǎo)致小鼠脾臟淋巴細(xì)胞比例失調(diào)及免疫功能紊亂。因此認(rèn)為Skint6 基因突變與小鼠SLE 發(fā)病有關(guān)，但其機(jī)制尚不明確，一種可能是Skint6 基因突變導(dǎo)致Skint6 表達(dá)缺失，另一種可能由于Skint6 蛋白翻譯提前終止形成的分泌型肽段與免疫細(xì)胞表面某受體結(jié)合從而導(dǎo)致免疫細(xì)胞數(shù)量和功能變化，具體通過何種機(jī)制發(fā)揮作用尚需進(jìn)一步研究。