王 嵐 袁佳儀 司玉瑩 陳念貞 宗 明 范列英 （同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200120）

中性粒細(xì)胞外捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NETs）是以中性粒細(xì)胞染色質(zhì)解聚為DNA 骨架，附著組蛋白、蛋白酶和其他顆粒蛋白（如髓過氧化物酶、彈性蛋白酶）等形成的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在清除病原體等有害物中起重要作用。但NETs 過度形成或NETs 產(chǎn)物清除失調(diào)將導(dǎo)致組織損傷、炎癥并誘發(fā)自身免疫性疾?。?］。研究顯示，RA 患者外周血中性粒細(xì)胞自發(fā)形成NETs 增多，NETs 產(chǎn)物與抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（anti-citrullinated protein antibodies，ACPAs）和炎癥標(biāo)志物水平相關(guān)，可能是促進(jìn)ACPA生成的主要機(jī)制之一［2-3］。目前RA 患者體內(nèi)NETs形成增多的機(jī)制尚未闡明。SIRL-1 是表達(dá)于中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等髓系吞噬細(xì)胞表面的抑制性受體，SIRL-1 mAb能夠通過與SIRL-1特異性結(jié)合活化SIRL-1 信號、抑制 NETs 形成［4-5］。SIRL-1 基因多態(tài)性可影響其在單核細(xì)胞上的表達(dá)，與特應(yīng)性皮炎發(fā)病相關(guān)［6］。本研究分析RA 患者外周血髓系吞噬細(xì)胞（中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞）和關(guān)節(jié)滑膜組織SIRL-1表達(dá)，探討SIRL-1對RA-NETs形成的作用。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象 外周靜脈血取自2019 年11 月至2020 年1 月于同濟(jì)大學(xué)附屬上海市東方醫(yī)院就診的RA 患者38 例和同期健康體檢者（healthy con?trol，HC）46例，樣本來自血常規(guī)檢查后的剩余血液。RA 組女 34 例，男 4 例，平均年齡（51.39±9.83）歲；HC 組女38 例，男8 例，平均年齡（55.16±14.46）歲，兩組性別和年齡分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.371 0，P=0.160 7）。RA和OA關(guān)節(jié)滑膜組織蠟塊（RA患者5例，OA患者4例）來自關(guān)節(jié)鏡手術(shù)切除和病理檢查后的剩余滑膜組織。RA 患者符合2018 年修訂的中國類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診療指南，OA 患者符合中華醫(yī)學(xué)會骨科學(xué)分會“骨關(guān)節(jié)炎診療指南（2018 年版）”。研究方案經(jīng)同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批備案［2016（倫）審第（011）號］。

1.1.2 主要試劑與儀器 聚-L-賴氨酸溶液、BSA、Triton X-100（Sigma-Aldrich 公司）；Hanks 平衡鹽溶液、RPMI1640 培養(yǎng)基、FBS（Gibco 公司）；Ficoll-PaquePLUS（GE Health 公司）；流式抗體CD11b/CD14/CD15/CD16、FITC 標(biāo)記羊抗鼠 IgG（BD 公司）；SIRL-1 mAb（Hycult 公司）；兔抗MPO 單克隆抗體（Abcam公司）；DyLight 594 標(biāo)記的羊抗鼠IgG（Introgen 公司）；Hoechst 33342、SYTOXTMGreen Nucleic Acid Stain（Thermo Fisher Scientific 公司）；Fluoromount-G熒光封片劑（Southern Biotech 公司）；流式細(xì)胞術(shù)分析儀（BD Calibur）；多功能酶標(biāo)儀（Spectra Max M5）；熒光顯微鏡（Leica DM6000B）。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化 將 5 例 RA 和 4 例 OA 滑膜組織切片高溫脫蠟，滴加3%H2O2，室溫靜置15 min 清除內(nèi)源性過氧化物酶。加入20%正常山羊血清封閉液室溫孵育30 min，加入一抗SIRL-1 mAb（1∶100 稀釋）4 ℃濕盒過夜，第2 天室溫下復(fù)溫1 h，加入相應(yīng)二抗室溫孵育1 h，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，沖洗，烤干，封片。顯微鏡下觀察，陽性部位呈褐色，胞核呈藍(lán)色。200 倍視野下計(jì)數(shù)每個(gè)視野下陽性細(xì)胞數(shù)，每張切片計(jì)數(shù)30個(gè)視野。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù) 收集30 例RA 患者、38 例HC新鮮EDTA 抗凝血，取100 μl 全血進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。采用特異性二抗FITC 標(biāo)記SIRL-1 mAb，通過 FSC/SSC 和 CD11b、CD14、CD15、CD16 篩選中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞。每個(gè)樣本計(jì)數(shù)10 000 個(gè)細(xì)胞，檢測 SIRL-1 表達(dá)，F(xiàn)lowJo 軟件處理數(shù)據(jù)。

1.2.3 人外周血中性粒細(xì)胞分離 采用Ficoll-PaquePLUS梯度密度離心法從EDTA 抗凝血中分離最下層細(xì)胞，加入紅細(xì)胞裂解液靜置10 min，Hanks 緩沖鹽溶液洗2 次，分離得到原代中性粒細(xì)胞，含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。

1.2.4 NETs 免疫熒光染色 預(yù)先配制0.001%多聚賴氨酸溶液包被細(xì)胞爬片，將計(jì)數(shù)完成的中性粒細(xì)胞按3×105個(gè)/孔接種于 24 孔板，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)4 h，Hanks 平衡鹽溶液清洗3 次，4%多聚甲醛固定，0.25%TritonX-100 透化，1%BSA 封閉，加入兔抗MPO 單克隆抗體（1∶100）4 ℃孵育過夜。次日加入Alex Fluor 488 標(biāo)記的抗兔 IgG（1∶200）室溫避光孵育 1 h。Hoechst 33342 復(fù)染，F(xiàn)luoromount-G 封片，熒光顯微鏡下200 倍視野觀察NETs 形成情況。為更直接地觀察NETs 形成，采用活細(xì)胞膜不透性染料SYTOX Green 對胞外DNA 進(jìn)行染色，熒光顯微鏡觀察拍照。

1.2.5 NETs 定量檢測 參照文獻(xiàn)［7-8］，采用細(xì)胞膜通透性染料Hoechst 33342、活細(xì)胞膜不滲透染料SYTOX Green 和髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）熒光顯微鏡下可視化NETs 形成，并采用活細(xì)胞膜不滲透染料SYTOX Green通過熒光強(qiáng)度定量評估同個(gè)體來源的中性粒細(xì)胞NETs 形成。選擇分離純化的中性粒細(xì)胞（RA 組8 例，HC 組8 例），免疫熒光染色方法同上，酶標(biāo)儀檢測：接種到黑色平底96 孔培養(yǎng)皿（3×105個(gè)/孔，200 μl 體系），根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件選擇是否采用SIRL-1 mAb 處理1 h，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)3 h，SYTOX Green 染色20 min，如細(xì)胞膜完好，染料則不能與細(xì)胞內(nèi)DNA 結(jié)合，Spectra Max M5 多功能酶標(biāo)檢測熒光強(qiáng)度（Ex：485 nm，Em：520 nm）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0 和Graphpad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖。符合正態(tài)分布的各組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)。P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RA 患者和OA 患者關(guān)節(jié)滑膜中SIRL-1 表達(dá)比較 采用SIRL-1 mAb對5例RA 關(guān)節(jié)滑膜和4例OA關(guān)節(jié)滑膜進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，有棕色顆粒附著為陽性細(xì)胞，200 倍鏡下統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣本30 個(gè)視野表達(dá)SIRL-1 的陽性平均細(xì)胞數(shù)，結(jié)果顯示，RA 患者表達(dá) SIRL-1 的 陽 性 細(xì) 胞 數(shù) 少 于 OA 組［（3.943±2.889）個(gè)vs（12.780±7.284）個(gè)，P<0.05，圖1］。

2.2 RA 患者外周血SIRL-1 表達(dá)比較 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，RA 患者 CD14?CD11b+CD15+CD16+中性粒細(xì)胞、CD14+CD11b?單核細(xì)胞SIRL-1 表達(dá)低于HC（P<0.05，P<0.01）；RA 患者CD14?CD11b+CD15+CD16?嗜酸性粒細(xì)胞表面SIRL-1 表達(dá)雖略低于HC，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，圖2）。

圖2 RA和HC外周血主要吞噬細(xì)胞SIRL-1表達(dá)Fig.2 Expression of SIRL-1 on surface of primary phago?cytes cells in peripheral blood from RA patients and HC

2.3 SIRL-1 抑制RA 患者中性粒細(xì)胞形成NETs與HC 組相比，RA 組大部分中性粒細(xì)胞分葉核結(jié)構(gòu)消失，胞外可明顯觀察到大量Hoechst 33342 和MPO 共定位的NETs，RA 組中性粒細(xì)胞更易自發(fā)形成NETs；而SIRL-1 mAb 預(yù)處理的中性粒細(xì)胞NETs形成明顯減少（圖3A）。多功能酶標(biāo)儀對同一樣本中性粒細(xì)胞的胞外DNA 進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示RA 組胞外DNA 熒光強(qiáng)度明顯高于HC組（P<0.001）。HC組中，與無 SIRL-1 mAb 處理相比，SIRL-1 mAb 處理后DNA 熒光強(qiáng)度有減弱趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；RA 組 SIRL-1 mAb 顯 著 降 低 細(xì)胞外NETs-DNA水平（P<0.05，圖3B）。

圖3 RA 患者中性粒細(xì)胞自發(fā)形成NETs 的情況及SIRL-1 mAb對RA-NETs的影響Fig.3 Spontaneous NETs formation produced by neutro?phils from RA patients and effect of NETs on formation mediated by SIRL-1 mAb

3 討論

NETs 在發(fā)揮胞外抗菌作用的同時(shí)暴露胞內(nèi)成分，其清除缺陷及隨后反應(yīng)過程的調(diào)節(jié)失衡會加重某些自身免疫性疾病嚴(yán)重程度［9］。NETs 釋放與ACPA 存在一定相關(guān)性，已有臨床研究證實(shí)RA 患者體內(nèi)NETs增多并與RA 疾病活動度和ACPA 滴度呈正相關(guān)。目前已知PADI4 催化組蛋白瓜氨酸化導(dǎo)致染色質(zhì)解聚是NETs 形成的必要環(huán)節(jié)［10］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，PADI4在RA患者外周血單個(gè)核細(xì)胞及關(guān)節(jié)滑膜組織中表達(dá)明顯升高，與RA 發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［11］。NETs 暴露瓜氨酸化蛋白刺激免疫系統(tǒng)被認(rèn)為是促進(jìn)ACPA 生成的主要機(jī)制之一，導(dǎo)致器官組織慢性、自身免疫性炎癥性損傷［3，12-13］。表明調(diào)控NETs形成對RA防治具有重要作用。

SIRL-1是2010年首次報(bào)道的免疫抑制受體，與PD-1、CTLA-4 等免疫抑制受體表達(dá)部位不同，目前僅發(fā)現(xiàn)SIRL-1 表達(dá)于髓系吞噬細(xì)胞表面，在中性粒細(xì)胞和多數(shù)單核細(xì)胞上高表達(dá)、部分髓樣樹突狀細(xì)胞上中度表達(dá)，而來源于淋巴干細(xì)胞的淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞不表達(dá)［14］。中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞均為髓樣干細(xì)胞分化而來，細(xì)胞膜上均帶有FcR 和補(bǔ)體受體。報(bào)道指出，SIRL-1 mAb 能夠激活中性粒細(xì)胞SIRL-1 信號，通過抑制FcR 受體介導(dǎo)的MEK-ERK 信號通路、抑制吞噬細(xì)胞內(nèi)NADPH 氧化酶依賴性ROS 產(chǎn)生、抑制正常人抗中性粒細(xì)胞抑菌肽抗體誘導(dǎo)的NETs 形成［4］。本研究采用免疫組織化學(xué)染色法分析了RA和OA患者關(guān)節(jié)滑膜中SIRL-1表達(dá)，雖未特異性標(biāo)記滑膜組織中的髓系吞噬細(xì)胞，但從免疫組化切片直觀判斷RA 關(guān)節(jié)滑膜組織中SIRL-1+細(xì)胞明顯少于OA關(guān)節(jié)滑膜組織。進(jìn)一步采用流式細(xì)胞術(shù)分析外周血中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞SIRL-1 表達(dá)，發(fā)現(xiàn)RA 患者中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞中SIRL-1表達(dá)明顯降低。

現(xiàn)有研究顯示RA 患者外周血中NETs 形成明顯增多［15］。本研究通過細(xì)胞免疫熒光和酶標(biāo)儀檢測胞外游離DNA 共同證實(shí)了RA患者的中性粒細(xì)胞比HC的中性粒細(xì)胞更易自發(fā)形成NETs。

為闡明SIRL-1 信號對RA 患者中性粒細(xì)胞形成NETs 的影響，課題組收集活動期RA 患者外周血和HC 外周血各8例，通過密度梯度離心法體外分離中性粒細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組采用SIRL-1 mAb（1∶50）刺激中性粒細(xì)胞1 h，為保證抗體與細(xì)胞表面抗原充分結(jié)合，課題組將刺激時(shí)的反應(yīng)體系維持在50μl，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SIRL-1 信號能夠激活中性粒細(xì)胞表面SIRL-1 信號；采用SIRL-1 mAb 刺激的RA 中性粒細(xì)胞與未使用SIRL-1 mAb 組相比，NETs 形成水平明顯降低，與在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的觀點(diǎn)相似［5］。說明SIRL-1 mAb能夠調(diào)控SIRL-1信號，抑制NETs產(chǎn)生。

綜上，RA 患者關(guān)節(jié)滑膜和外周血中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞存在SIRL-1 表達(dá)降低的現(xiàn)象，RA 患者中性粒細(xì)胞更易自發(fā)形成NETs，SIRL-1 mAb 活化SIRL-1 信號抑制RA 中性粒細(xì)胞NETs 形成。提示SIRL-1 表達(dá)可能與 NETs 形成相關(guān)，調(diào)控 SIRL-1 信號可能為RA生物防治提供新的策略。