楊寶芹 劉高仁 邵艷社 王自闖 （河南省中醫(yī)院婦產(chǎn)科，鄭州 450003）

子宮內(nèi)膜癌（endometrial carcinoma，EC）是當(dāng)今社會最常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一［1］。據(jù)不完全統(tǒng)計，全球范圍內(nèi)每年超過20 萬女性患有EC，其病死率僅次于女性同類型惡性腫瘤中的宮頸癌和卵巢癌［2］。目前為止，EC 的主要治療方法是手術(shù)，然后是輔助放射治療和化療；然而，這些療法并未有效減少EC 病死的風(fēng)險，EC 術(shù)后2~3 年的復(fù)發(fā)率仍超過60%［3］。近些年，中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)在一些疾病的治療上發(fā)揮了很好的療效［4］。白術(shù)是中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的重要組成部分，用于治療各種類型的疾病，白術(shù)多糖（polysaccharide ofAtractylodes macrocephala，PAM）是中藥白術(shù)的有效成分，已被證明具備包括抗腫瘤、抗氧化、抗微生物、抗炎等在內(nèi)的多種生物學(xué)功能［5］。研究顯示，PAM 對食管癌 Eca-109 細(xì)胞、人白血病U937 及Jurkat 細(xì)胞均具有很好的凋亡促進(jìn)作用［6-7］。而目前尚未有關(guān)于PAM對EC細(xì)胞增殖或凋亡影響的相關(guān)研究報道。本研究旨在從體外基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)出發(fā)，探究PAM 對人EC RL95-2 細(xì)胞凋亡的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人EC RL95-2細(xì)胞株（中科院細(xì)胞庫）；胎牛血清、青霉素鏈霉素混合液、RPMI1640 培養(yǎng)基（美國Gibco）；PAM（HPLC≥90%，wkq-08928，四川維克奇生物）；四唑鹽（MTT）細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒（北京索萊寶）；Annexin V-FITC/PI 雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（上海貝博生物）；線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1染色法）、Caspase9活性檢測試劑盒、細(xì)胞線粒體分離試劑盒（上海碧云天生物）；BCA 蛋白定量測定試劑盒、全蛋白提取試劑盒（南京建成生物）；兔抗細(xì)胞色素C（cytochrome C，Cyt C）（貨號：10993-1-AP）、兔抗細(xì)胞色素C氧化酶Ⅳ（cytochrome C oxidase Ⅳ，COX Ⅳ，貨號：11242-1-AP）、兔抗肌動蛋白（β-actin，貨號：20536-1-AP）、兔抗B 淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2，貨號：12789-1-AP）、兔抗Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax，貨號：50599-2-Ig）（武漢三鷹生物）；兔抗裂解型半胱天冬酶3（cleaved-Caspase3，貨號：ab2302）、山羊抗兔IgG二抗（貨號：ab97051）購自英國Abcam。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 采用含有100 U/ml 青霉素、0.1 mg/ml 鏈霉素和10%胎牛血清的RPMI1640 完全培養(yǎng)基，在溫度為37 ℃、5%CO2體積分?jǐn)?shù)、飽和濕度的條件下培養(yǎng)RL95-2 細(xì)胞。根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)定期換液，待細(xì)胞接近長滿培養(yǎng)瓶底部時，用0.25%的胰酶消化傳代。在正式實(shí)驗(yàn)開始之前，需對細(xì)胞進(jìn)行同步化培養(yǎng)處理后再進(jìn)行分組及藥物處理。

1.2.2 MTT法檢測PAM對RL95-2細(xì)胞增殖變化的影響 取生長旺盛的RL95-2 細(xì)胞，以1.0×105個/ml濃度接種于96 孔培養(yǎng)板。將細(xì)胞分為7 組：空白對照組（僅加DMSO）、不同濃度藥物組（分別加入溶解于DMSO中的7.5、15、30、60、120、240 mg/ml PAM），每組設(shè)置3 個平行復(fù)孔。分別在24 h、48 h 和72 h時測量各孔細(xì)胞的吸光度（OD）并記錄，計算藥物組細(xì)胞在不同生長時間點(diǎn)的增殖率，細(xì)胞增殖率（%）=藥物組平均OD 值/對照組平均OD 值×100%。所得數(shù)據(jù)以時間點(diǎn)為橫坐標(biāo)，以增殖率為縱坐標(biāo)，繪制藥物組細(xì)胞增殖率隨時間的變化圖，并采用Bliss 法計算PAM 在3 個不同時間點(diǎn)對RL95-2 細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.2.3 Annexin V-FITC/PI 雙染檢測 RL95-2 細(xì)胞凋亡水平 按1.2.2方法接種細(xì)胞后將細(xì)胞分為4組：空白對照組（僅加DMSO）、不同濃度藥物組（溶解于DMSO 中的15、30、60 mg/ml PAM），每組設(shè)置3 個平行復(fù)孔，加藥后常規(guī)培養(yǎng)48 h，參照Annexin V-FITC/PI 雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒相關(guān)操作，依次經(jīng)過離心收集細(xì)胞、重懸離心棄上清、染色避光孵育等步驟處理各組細(xì)胞，并及時進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。根據(jù)象限圖統(tǒng)計細(xì)胞總凋亡率，一般將第二象限和第四象限的細(xì)胞占比之和定義為細(xì)胞的總凋亡率。

1.2.4 JC-1 染色法檢測RL95-2 細(xì)胞線粒體膜電位變化 按1.2.3方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和分組。常規(guī)培養(yǎng)48 h 后參考線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1 染色法）相關(guān)操作，依次經(jīng)過離心收集細(xì)胞、染色避光孵育、離心收集細(xì)胞、緩沖液重懸細(xì)胞等步驟處理各組細(xì)胞，并及時進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。一般將第二象限B2細(xì)胞占比與第四象限B4細(xì)胞占比的比值看作線粒體膜電位的高低變化程度。

1.2.5 Western blot 檢測RL95-2 細(xì)胞線粒體Cyt C釋放及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 按1.2.3方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和分組。48 h后分離各組細(xì)胞的線粒體蛋白和細(xì)胞質(zhì)蛋白，并對所提蛋白進(jìn)行濃度檢測，然后依次經(jīng)過蛋白變性、蛋白上樣、SDS-PAGE 凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉和洗膜后，分別加入一抗Cyt C（1∶1 000）、COX Ⅳ（線粒體蛋白內(nèi)參，1∶1 500）、β-actin（細(xì)胞質(zhì)蛋白內(nèi)參，1∶1 000）；而對于凋亡蛋白的檢測實(shí)驗(yàn)，則按照全蛋白提取試劑盒分別提取各組RL95-2 細(xì)胞蛋白；僅抗體信息變化如下：一抗Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）；cleaved-Caspase3（1∶1 200）；β-actin（1∶1 000），在4 ℃下孵育過夜；PBS洗膜后加入羊抗兔IgG 二抗（1∶5 000）室溫孵育0.5 h；PBS 再次洗膜后用ECL 化學(xué)放光進(jìn)行顯色觀察；凝膠成像系統(tǒng)分析各指標(biāo)灰度值。

1.2.6 分光光度法檢測RL95-2 細(xì)胞Caspase9 酶的活性 按1.2.3方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和分組。常規(guī)培養(yǎng)48 h 后，參考Caspase9 活性檢測試劑盒相關(guān)操作，依次經(jīng)過離心收集細(xì)胞、裂解細(xì)胞收集上清、加工作液孵育、酶標(biāo)儀吸光度測定和標(biāo)準(zhǔn)曲線制作等步驟計算各組細(xì)胞Caspase9酶的活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析處理，計量資料均以表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用One-Way ANOVA 分析，組間兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)，P＜0.05代表差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PAM呈濃度和時間依賴性地抑制RL95-2細(xì)胞增殖 如圖1A 所示，同時間點(diǎn)細(xì)胞增殖率隨PAM濃度的增加而降低，且同濃度下細(xì)胞增殖率隨時間的增加而降低，提示PAM 呈明顯的時間和濃度依賴性地抑制RL95-2 細(xì)胞增殖。如圖1B 所示，根據(jù)Bliss法計算得出PAM在24 h、48 h和72 h時，RL95-2細(xì)胞的 IC50值分別為 142.12±5.72、69.67±4.99 和34.68±3.74，三者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=253.904，P=0.000）；與 24 h 相比，48 h 和 72 h 的 IC50差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）；72 h 的IC50與48 h相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

圖1 PAM呈濃度和時間依賴性地抑制RL95-2細(xì)胞增殖Fig.1 PAM inhibited proliferation of RL95-2 cells in a concentration and time-dependent manner

2.2 PAM 促進(jìn) RL95-2 細(xì)胞凋亡 如圖 2 所示，與空白對照組相比，藥物組（15、30、60 mg/ml PAM）RL95-2 細(xì)胞凋亡率均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。

圖2 PAM促進(jìn)RL95-2細(xì)胞凋亡Fig.2 PAM promoted apoptosis of RL95-2 cells

2.3 PAM 促進(jìn)RL95-2 細(xì)胞線粒體膜電位的降低如圖3 所示，與空白對照組相比，藥物組（15、30、60 mg/ml PAM）RL95-2 細(xì)胞線粒體膜電位均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。

圖3 PAM促進(jìn)RL95-2細(xì)胞線粒體膜電位的降低Fig.3 PAM promoted decreased of mitochondrial membrane potential in RL95-2 cells

2.4 PAM 促進(jìn)RL95-2 細(xì)胞線粒體中 Cyt C 的釋放 如圖4 所示，所提取的線粒體蛋白中無細(xì)胞質(zhì)特異性蛋白β-actin 表達(dá)，而所提取的細(xì)胞質(zhì)蛋白中無線粒體特異性蛋白COXⅣ表達(dá)，表明所提取蛋白純度均較高，無相互交叉污染。與空白對照組相比，3 個藥物組（15、30、60 mg/ml PAM）RL95-2 細(xì)胞線粒體中Cyt C蛋白表達(dá)量均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），細(xì)胞質(zhì)中Cyt C 蛋白表達(dá)量顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。

圖4 PAM促進(jìn)RL95-2細(xì)胞線粒體中Cyt C的釋放Fig.4 PAM promoted release of Cyt C in RL95-2 cells in mitochondria

2.5 PAM 促進(jìn) RL95-2 細(xì)胞中 Caspase9 酶的活性如圖5 所示，與空白對照組相比，3 個藥物組（15、30、60 mg/ml PAM）RL95-2 細(xì)胞中 Caspase9 酶的活性均顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。

圖5 PAM促進(jìn)RL95-2細(xì)胞中Caspase9酶的活性Fig.5 PAM promoted activity of Caspase9 enzyme in RL95-2 cells

2.6 PAM 促進(jìn)線粒體凋亡信號通路的激活 如圖 6 所示，與空白對照組相比，3 個藥物組（15、30、60 mg/ml PAM）RL95-2 細(xì)胞中抑凋亡蛋白 Bcl-2 的相對表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；而促凋亡蛋白 Bax 和 cleaved-Caspase3 的相對表達(dá)量顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。

圖6 PAM促進(jìn)線粒體凋亡信號通路的激活Fig.6 PAM promoted activation of mitochondrial apoptosis signaling pathway

3 討論

EC是臨床上較為常見的女性惡性腫瘤之一，當(dāng)前的治療方法主要以手術(shù)輔助放化療為主，預(yù)后較差是其臨床治愈率較低的主要原因。近些年，關(guān)于PAM 對于癌癥的藥理作用研究已有相關(guān)報道，這為PAM 臨床治療癌癥提供了很好的基礎(chǔ)理論。例如，體外研究顯示PAM 能通過線粒體凋亡信號通路促進(jìn)人食管癌細(xì)胞Eca109 凋亡，促進(jìn)細(xì)胞阻滯在S期［6］。體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)表明，PAM 能通過阻滯 S 期肝癌細(xì)胞H22，進(jìn)而抑制受體小鼠腫瘤的生長，發(fā)揮其抗腫瘤活性［8］。對神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6 細(xì)胞進(jìn)行藥理學(xué)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，PAM 可顯著抑制上述細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，其機(jī)制可能與線粒體凋亡信號通路密切相關(guān)［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，PAM 作用 EC 細(xì)胞RL95-2的 48 h IC50為69.67 mg/ml，且PAM 隨時間和劑量依賴性地抑制RL95-2 細(xì)胞增殖。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)顯示，60 mg/ml的PAM 可顯著促進(jìn)RL95-2細(xì)胞的凋亡、線粒體膜電位的降低及Cyt C的釋放；同時，細(xì)胞內(nèi)Caspase9 酶的活性顯著增加，線粒體凋亡信號通路被激活。以上結(jié)果表明，PAM 可有效作用于EC細(xì)胞RL95-2，其發(fā)揮的凋亡促進(jìn)作用可能與線粒體凋亡通路有關(guān)。

本研究證明了PAM 誘導(dǎo)EC 細(xì)胞凋亡可能與線粒體凋亡信號通路的激活有關(guān)。線粒體通路和死亡受體通路是當(dāng)前公認(rèn)的兩種細(xì)胞內(nèi)凋亡信號通路，Bcl-2 蛋白家族成員參與線粒體通路的調(diào)控。Bcl-2 蛋白家族分為兩大類：以 Bcl-2、Bcl-xl 為代表的抗凋亡蛋白和以Bax、Bad 為代表的促凋亡蛋白［10］。Bcl-2家族是最早發(fā)現(xiàn)的一組重要蛋白，其可改變線粒體外膜的通透性，從而調(diào)節(jié)線粒體凋亡蛋白的釋放量。Bcl-2 是第一個被發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞凋亡抑制蛋白，其不依賴細(xì)胞分裂來阻止程序性細(xì)胞凋亡；Bax 從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位至線粒體誘導(dǎo)Cyt C 的釋放，進(jìn)而引起下游Caspase 家族的凋亡執(zhí)行；而抗凋亡蛋白Bcl-2 過表達(dá)可抑制促凋亡蛋白Bax 轉(zhuǎn)位至線粒體，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖和異常存活［11］。由此可見，細(xì)胞內(nèi)Bcl-2 與Bax 的動態(tài)平衡是控制細(xì)胞生存或凋亡的關(guān)鍵。本研究結(jié)果顯示，藥物組較對照組細(xì)胞Bcl-2 蛋白相對表達(dá)量顯著減少，而Bax 及下游凋亡執(zhí)行者cleaved-Caspase3 的蛋白相對表達(dá)量顯著增多，Bcl-2 與Bax 的動態(tài)平衡被打破，癌細(xì)胞凋亡進(jìn)程加速，提示PAM 的作用機(jī)制與激活線粒體凋亡信號通路有關(guān)。

此外，Cyt C 從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中激活Caspase常常導(dǎo)致線粒體通路的激活。在眾多誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的蛋白中，Caspase 是執(zhí)行凋亡刺激、誘導(dǎo)細(xì)胞死亡所必需的蛋白。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，PAM 處理組的細(xì)胞線粒體與細(xì)胞質(zhì)中的Cyt C 蛋白表達(dá)呈相反趨勢，且細(xì)胞中Caspase9 的活性及cleaved-Caspase3的表達(dá)量顯著增加。提示線粒體凋亡途徑的發(fā)生效應(yīng)通常導(dǎo)致Cyt C由線粒體釋放至細(xì)胞質(zhì)中，伴隨下游Caspase 家族部分成員的活化，PAM 確實(shí)激活了線粒體凋亡信號通路。

此外，PAM 還可通過其他途徑發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤作用。例如，在以小鼠淋巴細(xì)胞為研究對象時發(fā)現(xiàn)，PAM 可活化T 淋巴細(xì)胞并同時增強(qiáng)Th1和Th2 型免疫反應(yīng)，其機(jī)制可能與其對NF-κB 信號通路的抑制作用有關(guān)［12］。在進(jìn)行小鼠結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞原位移植瘤生長相關(guān)研究時發(fā)現(xiàn)，PAM 主要通過增加MHCⅡ和IL-12 在樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的表達(dá)水平以及增加CD4+及CD8+細(xì)胞分泌IFN-γ的能力來抑制腫瘤生長［13］。在研究肺癌模型大鼠的免疫功能時發(fā)現(xiàn)，PAM 可有效降低模型組大鼠肺指數(shù)，提升其脾臟和胸腺指數(shù)以及外周血中白細(xì)胞和溶菌酶含量，其作用機(jī)制可能與其能夠增強(qiáng)肺癌模型大鼠機(jī)體免疫功能，抑制癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡有關(guān)［14］。在體外研究肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)習(xí)性時發(fā)現(xiàn)，PAM 對肝癌細(xì)胞的體外增殖和侵襲能力具有抑制作用，其可能通過影響Wnt/β-catenin 信號通路發(fā)揮作用［15］。

本研究發(fā)現(xiàn)，白術(shù)多糖可通過激活線粒體凋亡信號通路導(dǎo)致癌細(xì)胞Bcl-2 與Bax 的失衡，線粒體中Cyt C 向細(xì)胞質(zhì)釋放，下游Caspase 家族中Caspase9酶活性及cleaved-Caspase3 活性增加，進(jìn)而促進(jìn)EC細(xì)胞RL95-2 的凋亡發(fā)生。本研究初步探究了白術(shù)多糖促EC 細(xì)胞RL95-2 的凋亡機(jī)制，為白術(shù)多糖臨床治療人EC奠定了理論基礎(chǔ)。