孫文兵 邢艷瓏 涂 蓉 吳嗣澤 （海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像學(xué)教研室，?？?570102）

手術(shù)切除、消融、內(nèi)放射治療和分子靶向治療等方法的廣泛應(yīng)用提高了肝癌的治療效果，但預(yù)后仍較差，肝癌仍是全球第四大癌癥死亡原因，每年死亡人數(shù)近80 萬(wàn)［1-3］。肝癌患者五年生存率僅為5%~30%，肝外轉(zhuǎn)移是肝癌死亡的主要原因［1，4］。明確肝癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制是制定有效干預(yù)措施、提高療效的前提。腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）由多種物質(zhì)組成，如巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和細(xì)胞外間質(zhì)，與腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切［5-6］。當(dāng)巨噬細(xì)胞接受不同刺激時(shí)，可具有不同表型并分化為不同亞群，主要包括M1 型（經(jīng)典活化型）和M2 型（替代活化型）巨噬細(xì)胞。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophage，TAM）通常被認(rèn)為更接近M2型［7-8］。TME 中出現(xiàn)大量巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)時(shí)往往提示癌癥患者預(yù)后不良［9-11］；臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明TAMs 可促進(jìn)腫瘤發(fā)生和發(fā)展［12-13］。外泌體是正常細(xì)胞和腫瘤等異常細(xì)胞分泌的脂質(zhì)雙層小囊泡（直徑為30~100 nm），內(nèi)含蛋白質(zhì)、miRNA、DNA、脂質(zhì)、細(xì)胞因子等活性物質(zhì)，且Tsg101、CD63 等典型標(biāo)志物呈高表達(dá)［14-16］。外泌體的功能一般是通過其表面分子與其他細(xì)胞受體靶向結(jié)合實(shí)現(xiàn)的，通過受體-配體作用、內(nèi)吞或內(nèi)化及與靶細(xì)胞膜融合將miRNA 等成分傳遞至受體細(xì)胞胞漿內(nèi)，再與受體細(xì)胞活性成分相互作用，從而引起相應(yīng)功能改變［14，17］。相比于正常肝細(xì)胞，分離自肝癌細(xì)胞的外泌體中有3 種miRNA（miR-21、miR-151 和 miR-221）呈異常高表達(dá)［18］。課題組假設(shè)外泌體在肝癌細(xì)胞與巨噬細(xì)胞間起交通作用，通過傳遞活性生物分子（如miRNA）將巨噬細(xì)胞激活為TAMs，進(jìn)而對(duì)肝癌轉(zhuǎn)移起促進(jìn)作用。本研究主要觀察肝癌細(xì)胞與其周圍巨噬細(xì)胞的相互作用，探討肝癌轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 正常肝細(xì)胞（7702）、肝癌細(xì)胞（Huh-7）、小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞（RAW264.7）均購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 主要儀器 CS150GX2 超速離心機(jī)、HT-7700 透射電鏡（HITACHI）；T100 基因擴(kuò)增儀（Bio-Rad）；SYNERGY/H1 多功能酶標(biāo)儀（BioTek）；Nano-Drop One 分光光度儀（Thermo）；MX3005P 熒光定量分析儀（Agilent）；DM4B 正置熒光顯微鏡（Leica）；Champchemi Top610 凝膠成像化學(xué)發(fā)光一體機(jī)（北京賽備）；FV1000 共聚焦激光掃描生物顯微鏡（Olympus）。

1.1.3 主要試劑 胎牛血清（四季青）；劃痕實(shí)驗(yàn)插件、基質(zhì)膠、0.4 μm 及 8 μm 聚碳酸酯膜Transwell（Corning）；UR52301 外泌體蛋白檢測(cè)試劑盒、UR52303 外泌體熒光標(biāo)記染料 PKH67（Umibio）；人TGF-β 及IL-10 ELISA 試劑盒（翼飛雪）；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000（Thermo）；miRNA 模擬物（廣州銳博）；RNA 提取試劑盒（Foregene）；MonScriptTMRTⅢ一體化混合dsDNase 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR 試劑盒（Monad Biotech）；GeneAmp RNA PCR Kit 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Applied Biosystems）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 7702、Huh-7、RAW264.7細(xì)胞復(fù)蘇后采用含10%胎牛血清及1%三抗的高糖DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2中培養(yǎng)。當(dāng)生長(zhǎng)至80%~90%密度時(shí)，采用0.25%EDTA 胰蛋白酶消化或直接用移液器將細(xì)胞沖下，1 000 r/min 離心5 min 傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 肝癌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的共培養(yǎng) 采用0.4 μm聚碳酸酯膜細(xì)胞培養(yǎng)小室共培養(yǎng)7702、Huh-7和 RAW264.7 細(xì)胞，將約 1 ml 重懸的 Huh-7 或 7702細(xì)胞置于上室（5×104個(gè)），2 ml重懸的RAW264.7 細(xì)胞置于下室（5×103個(gè)），共同培養(yǎng)24 h后顯微鏡下觀察并分別收集離心，-80 ℃凍存用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 外泌體提取 依次采用T25、T75 至T175 培養(yǎng)瓶培養(yǎng)Huh-7 及RAW264.7 細(xì)胞，80%~90%密度時(shí)1×PBS 清洗3 次，加入無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，超速離心法進(jìn)行外泌體提?。?5］。100 μl/份重懸，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 透射電子顯微鏡（TEM） 新鮮制備的外泌體（2 μl）用20 ml PBS稀釋，取30 μl滴加于200目方華膜銅網(wǎng)，靜置2 min 后用濾紙從側(cè)面吸取多余浮液，加入10 μl 0.5%磷鎢酸溶液（pH=6.8），室溫下復(fù)染5 min，濾紙吸取浮液后常溫晾干，透射電鏡觀測(cè)，獲取不同放大比例圖像。

1.2.5 Western blot 按照超速離心法從細(xì)胞條件培養(yǎng)基中提取外泌體，細(xì)胞刮刮下貼壁細(xì)胞，裂解，-80 ℃保存?zhèn)溆?。采用外泌體蛋白檢測(cè)試劑盒按照說明書對(duì)細(xì)胞及其分泌的外泌體進(jìn)行CD63 和TSG101蛋白檢測(cè)。

1.2.6 共聚焦顯微鏡觀察 采用綠色熒光標(biāo)記的染料PKH67 按照說明書標(biāo)記Huh-7 細(xì)胞來源外泌體：采用 Diluent C 稀釋配制濃度為 100 μmol/L 的染料工作液；加入外泌體及 PBS 重懸，100 000 g、4 ℃超速離心70 min。去除上清，重懸染色后的外泌體加至巨噬細(xì)胞培養(yǎng)皿，37 ℃孵育12 h，多聚甲醛固定，DAPI染色細(xì)胞核，激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.7 ELISA 離心移除細(xì)胞碎片后收集上清，按梯度濃度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品至300、200、100、50、25 ng/L，加入待測(cè)樣品及樣品稀釋液10、40 μl 混勻，溫育40 min，已稀釋至1×洗滌液洗滌約30 s，重復(fù)5遍，滴加酶標(biāo)試劑50 μl，空白孔不加，再次重復(fù)溫育及洗滌步驟，依次加入顯色劑 A、B 各 50 μl 孵育 15 min，50 μl/孔滴加終止液，約 10 min 后檢測(cè) 450 nm 處OD值。

1.2.8 劃痕愈合試驗(yàn)觀察肝癌細(xì)胞Huh-7 遷移分別培養(yǎng)Huh-7 細(xì)胞、RAW264.7 細(xì)胞及與Huh-7細(xì)胞共培養(yǎng)的 RAW264.7 細(xì)胞（TAMs），劃痕實(shí)驗(yàn)插件消毒后置于6 孔板，Huh-7 細(xì)胞消化離心，1×106個(gè)/ml分別加入每個(gè)插件200 μl，分別加入PBS（NC）、RAW264.7 外泌體（RAW264.7-Ex）、TAM 外泌體（TAM-Ex）37 ℃孵育24 h，TAM 來源于前述與Huh-7 細(xì)胞共培養(yǎng)后的RAW264.7 細(xì)胞，外泌體濃度為 10 μg/ml，取掉插件，無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)，分別于 0 h、24 h 顯微鏡下取圖，Image J 計(jì)算劃痕面積減少百分比，Graphpad Prism 8.0制圖及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.9 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 采用24 孔8 μm Transwell小室進(jìn)行細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：基質(zhì)膠稀釋后室鋪于小室上室孵育過夜，分別在小室上室加入Huh-7 細(xì)胞及PBS（NC）、Huh-7 細(xì) 胞 及 RAW264.7 外 泌 體（RAW264.7-Ex）、Huh-7細(xì)胞及TAM外泌體（TAM-Ex）（2×104個(gè)/200 μl），TAM 來源于前述與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)的RAW264.7 細(xì)胞，外泌體濃度為10 μg/ml，下室加入800 μl 10%胎牛血清完全培養(yǎng)基孵育24 h，棉簽擦去上層細(xì)胞，4%多聚甲醛固定，0.01%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察，取圖，Image J 進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，Graphpad Prism 8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.10 qRT-PCR 細(xì)胞消化離心后采用RNA 提取試劑盒按照說明提取收集RNA 溶液后采用分光光度計(jì)進(jìn)行濃度測(cè)定，按照50 μl標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行配平。采用MonScriptTMRT Ⅲ一體化混合試劑盒或GeneAmp RNA PCR 試劑盒按照說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，采用MonAmpTMChemoHS qPCR Mix 試劑盒按照說明書進(jìn)行擴(kuò)增，以GAPDH 或U6 為內(nèi)參計(jì)算目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄水平，2-ΔΔCt法量化相對(duì)基因表達(dá)，引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequences of qRT-PCR

1.2.11 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 RAW264.7細(xì)胞采用不含三抗和血清的培養(yǎng)基清洗2 次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml，500 μl/孔加入6 孔板孵育12 h。miRNA模擬物與脂質(zhì)體及培養(yǎng)基混勻靜置20 min。將上述混合物加入細(xì)胞中，搖勻，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Graphpad Prism 8.0 軟件分析制圖，數(shù)據(jù)以或中位數(shù)（IQR范圍）表示。兩組比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05（雙尾）為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后導(dǎo)致巨噬細(xì)胞M2 樣改變 為判斷肝癌細(xì)胞是否能作用于其微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞，分別采用7702 與RAW264.7 細(xì)胞共培養(yǎng)（NC 組）、Huh-7 與 RAW264.7 細(xì)胞共培養(yǎng)（HR 組）24 h，顯微鏡下可見與7702 細(xì)胞共培養(yǎng)的RAW264.7 細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，大部分呈類圓形，而與Huh-7 共培養(yǎng)的RAW264.7 細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，主要呈多角形（圖1A）。Huh-7 組巨噬細(xì)胞M2 型標(biāo)志物CD206 及 Arg-1 水平顯著高于 7702 組（圖 1B），IL-10、TGF-β蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組（圖1C）。表明肝癌細(xì)胞可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化為TAMs。

圖1 與Huh-7細(xì)胞共培養(yǎng)后RAW264.7細(xì)胞呈M2樣改變Fig.1 M2-like macrophages were found after co-culture with Huh-7 cells of RAW264.7 cells

2.2 外泌體鑒定及追蹤 為了解肝癌細(xì)胞是否通過外泌體極化巨噬細(xì)胞，本研究提取肝癌細(xì)胞外泌體并進(jìn)行表征，透射電鏡顯示Huh-7 細(xì)胞分泌的外泌體切面圖呈圓盤狀，直徑50~100 nm（圖2A）；Western blot 顯示，外泌體典型生物標(biāo)志物TSG101、CD63 均呈陽(yáng)性（圖2B），證實(shí)提取的球體為外泌體。采用綠色熒光標(biāo)記的染料PKH67 標(biāo)記Huh-7 細(xì)胞外泌體與RAW264.7 細(xì)胞進(jìn)行共孵育顯示，外泌體進(jìn)入巨噬細(xì)胞胞漿（圖2C）。表明肝癌細(xì)胞可能通過外泌體通訊極化巨噬細(xì)胞。

圖2 外泌體鑒定及追蹤Fig.2 Identification and tracking of exosomes

2.3 肝癌細(xì)胞外泌體中miRNA 介導(dǎo)巨噬細(xì)胞激活 qRT-PCR 及 ELISA 結(jié)果顯示，Huh7-Ex 組巨噬細(xì)胞M2型標(biāo)志物CD206、Arg-1 mRNA表達(dá)及IL-10、TGF-β 蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組（圖3A、B）。證明肝癌細(xì)胞通過外泌體向巨噬細(xì)胞傳遞某種生物信息物質(zhì)導(dǎo)致其功能轉(zhuǎn)變。分別檢測(cè)Huh7-Ex 與7702-Ex 中 miR-21、miR-151 和 miR-221 表達(dá)，結(jié)果顯示來源于Huh-7 外泌體的miRNA 水平均高于來源于 7702 的外泌體（圖 3C）。上述 3 種 miRNA 模擬物及陰性對(duì)照miRNA 轉(zhuǎn)染RAW264.7 細(xì)胞后檢測(cè)其 M2 型標(biāo)志物，僅有 miR-151 促進(jìn) CD206 及 Arg-1表達(dá)（圖3D）。因此推斷肝癌細(xì)胞高表達(dá)miR-151，通過外泌體內(nèi)化被轉(zhuǎn)運(yùn)至巨噬細(xì)胞，使后者得到不同表型，介導(dǎo)TAMs激活。

圖3 肝癌細(xì)胞外泌體miRNA介導(dǎo)TAMs活化Fig.3 Exosomal miRNA derived from HCC cells mediates TAMs activation

2.4 TAMs 促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移及侵襲 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相對(duì)于NC 組，添加了RAW264.7 外泌體組細(xì)胞遷移及侵襲能力未見明顯變化，而添加了TAMs 外泌體組遷移及侵襲能力明顯提高（圖4）。表明TAMs 可促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移及侵襲。

圖4 TAMs促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移及侵襲Fig.4 TAMs promote migration and invasion of HCC cells

3 討論

TME 是一種由細(xì)胞間通訊調(diào)控的動(dòng)態(tài)系統(tǒng)，與腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［19-22］。作為TME中的主要基質(zhì)細(xì)胞，巨噬細(xì)胞可塑性極強(qiáng)，不同刺激作用下出現(xiàn)不同表型，包括M1 型（抑制腫瘤）和M2 型（促進(jìn)腫瘤）［23］。TAMs 通常被認(rèn)為是 CD206、Arg-1、IL-10、TGF-β 呈高表達(dá)的 M2 型巨噬細(xì)胞［7-8］。本研究采用肝癌細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)體系模擬了腫瘤及其微環(huán)境，結(jié)果顯示與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞呈多角形，qRT-PCR 及ELISA 檢測(cè)上述M2 型標(biāo)志物表達(dá)均顯著提高，說明肝癌細(xì)胞能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞成為TAMs。

外泌體是一種富含多種生物信息成分的物質(zhì)，是腫瘤導(dǎo)致系統(tǒng)性地改變的一種重要載體［14］。miRNA是由18~25個(gè)核苷酸組成的、進(jìn)化保守的、具有調(diào)控功能的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA 分子，通過對(duì)靶mRNA 剪切或抑制靶mRNA 翻譯調(diào)控基因表達(dá)，從而對(duì)靶基因?qū)嵤┺D(zhuǎn)錄后水平調(diào)控［24］。外泌體中包裹大量miRNA，miRNA 可通過外泌體在細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)并在功能上影響靶細(xì)胞［25-27］。研究表明肝癌細(xì)胞通過外泌體傳遞miRNA至TME中的細(xì)胞，改變其表型及功能，如肝癌細(xì)胞可通過外泌體let-7i-5p 與其周圍微環(huán)境中未轉(zhuǎn)化的肝細(xì)胞交流誘導(dǎo)肝細(xì)胞為肝癌相關(guān)細(xì)胞［28］；肝癌細(xì)胞分泌的miR-103 可通過外泌體傳遞到內(nèi)皮細(xì)胞，降低血管內(nèi)皮鈣黏蛋白（VE-Cad）等蛋白表達(dá)削弱內(nèi)皮連接完整性，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移［29］；肝癌細(xì)胞外泌體進(jìn)入成纖維細(xì)胞后通過miR-1247-3p 將成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞［30］。本研究顯示，miR-151 在肝癌細(xì)胞外泌體中異常高表達(dá)，并能將巨噬細(xì)胞極化為TAMs。miR-15l位于染色體8q24.3區(qū)域，在包括肝癌在內(nèi)的多種腫瘤中高表達(dá)，包含2個(gè)成熟序列：miR-151-5p和miR-151-3p，但兩者具有不同功能。其中miR-151-5p可直接靶向作用于Rho GTPase 通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子（RhoGDIA），抑制其mRNA及蛋白表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移能力，在肝癌轉(zhuǎn)移中起促進(jìn)作用［31-32］。miR-151-3p 有2 種作用形式：腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞衍生的外泌體miR-151-3p 靶向細(xì)胞黏附分子CHL1，通過調(diào)控TGF-β通路進(jìn)而增強(qiáng)骨肉瘤細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化及侵襲能力［33］；LIU 等［34］研究則顯示 miR-151-3p 在巨噬細(xì)胞中可靶向STAT3，并抑制IL-6 生成。因此，miR-151 的作用機(jī)制較復(fù)雜，其是否還有其他功能有待進(jìn)一步研究。以上結(jié)果表明肝癌進(jìn)展與轉(zhuǎn)移是多方面因素的綜合作用，miR-151 既可直接增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞遷移及侵襲能力，也能通過極化巨噬細(xì)胞間接促進(jìn)腫瘤惡性表型。miR-151 如何作用于巨噬細(xì)胞靶點(diǎn)及相應(yīng)信號(hào)通路而導(dǎo)致其M2 極化將是課題組進(jìn)一步研究重點(diǎn)。

TAMs 外泌體被證實(shí)積極參與癌癥轉(zhuǎn)移進(jìn)展過程。LAN 等［20］研究顯示，TAMs 通過將外泌體傳遞至結(jié)腸癌細(xì)胞增強(qiáng)其侵襲能力；TAMs 通過外泌體向肝癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)整合素（αMβ2），增強(qiáng)其轉(zhuǎn)移潛能［35］。本研究結(jié)果與上述研究一致，TAMs 來源外泌體顯著提升了肝癌細(xì)胞遷移及侵襲能力。

綜上所述，肝癌細(xì)胞通過外泌體傳遞miR-151將巨噬細(xì)胞極化為具有M2 表型的TAMs，TAMs 反過來又促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移及侵襲，增加腫瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。課題組從腫瘤細(xì)胞與巨噬細(xì)胞的相互作用角度進(jìn)一步分析了肝癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制，將為有效防控肝癌轉(zhuǎn)移和提出更優(yōu)治療策略提供參考。