穩(wěn)定ANAMMOX工藝污泥顆?；拔⑸锒鄻有苑治?/h1>
2022-08-30 02:43:22劉人源章乘峰
環(huán)境科技 2022年4期
劉人源, 涂 智, 陳 晨, 彭 陽, 章乘峰, 陳 宏,
（1.廣東自遠(yuǎn)環(huán)保股份有限公司，廣東 梅州 514700；2.長(zhǎng)沙理工大學(xué)水利與環(huán)境工程學(xué)院，洞庭湖水環(huán)境治理與水生態(tài)修復(fù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410114；3.長(zhǎng)沙民政職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；4.江西環(huán)境工程職業(yè)學(xué)院，江西 贛州 341002）
0 引言
厭氧氨氧化是在厭氧或缺氧條件下， 微生物以NO3-或NO2-為電子受體， 以NH4+為電子供體， 將2種氮素轉(zhuǎn)化為N2的生物反應(yīng)過程[1-3]。相比傳統(tǒng)生物脫氮，其無需外加碳源、節(jié)省曝氣和堿度消耗、剩余污泥產(chǎn)量和溫室氣體排放量小[4-7]。然而，ANAMMOX細(xì)菌對(duì)環(huán)境條件變化極為敏感，生長(zhǎng)速度慢[8]，不利于其工程化應(yīng)用[9]。 顆粒污泥不僅沉降性能好，可抗沖擊負(fù)荷，還可有效持留生物量，從而保證其良好的脫氮性能。 因此，ANAMMOX 污泥的顆?；捌渥责B(yǎng)脫氮性能的提升逐漸成為研究和應(yīng)用的熱點(diǎn)[10-12]。 國(guó)內(nèi)外研究者已經(jīng)進(jìn)行了大量研究[13-15]， 但缺乏穩(wěn)定ANAMMOX 工藝污泥顆?；^程中自養(yǎng)脫氮性能變化規(guī)律及其功能微生物演替的數(shù)據(jù)。
通過調(diào)控進(jìn)水氮濃度和水力停留時(shí)間， 對(duì)穩(wěn)定ANAMMOX 工藝運(yùn)行下反應(yīng)器脫氮性能、 污泥粒徑、微生物多樣性及豐度變化情況進(jìn)行研究，從而為工程中ANAMMOX 顆粒污泥的培養(yǎng)及強(qiáng)化提供數(shù)據(jù)支持。
1 材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)裝置及運(yùn)行
實(shí)驗(yàn)裝置示意見圖1。 由圖1 可以看出，反應(yīng)器由有機(jī)玻璃制成， 主反應(yīng)區(qū)內(nèi)徑為10 cm， 高為80 cm，三相分離器內(nèi)徑為13.93 cm，高為30 cm，總?cè)莘e為10.25 L，有效容積為6.25 L。 反應(yīng)器外包裹鋁箔海綿材料以避光；設(shè)有循環(huán)水浴恒溫槽，保持反應(yīng)器內(nèi)主體溫度為35±1 ℃。 原水和回流混合液一同進(jìn)入主反應(yīng)區(qū)，通過三相分離器實(shí)現(xiàn)泥水分離，出水流入沉淀池。初始水力停留時(shí)間（HRT）設(shè)定為12 h。
圖1 厭氧氨氧化顆粒污泥UASB 反應(yīng)器示意
1.2 實(shí)驗(yàn)用水及接種污泥
實(shí)驗(yàn)進(jìn)水為模擬廢水，以NH4+-N 和NO2--N 為氮源，分別由NH4HCO3和NaNO2按需提供，NH4+-N和NO2--N 的質(zhì)量濃度比值控制在1.00 ～1.32 之間，起始TN 質(zhì)量濃度為100 mg/L；由NaHCO3提供無機(jī)碳源， 同時(shí)調(diào)節(jié)進(jìn)水pH 值在7.8 ～8.5 之間，NaHCO3質(zhì)量濃度為400 mg/L。 其他組分為：CaCl2，KH2PO4，MgSO4·7H2O，EDTA-2Na，F(xiàn)eSO4·7H2O 質(zhì)量濃度分別為25，50，50，3，6.67 mg/L， 微量元素濃縮液的體積分?jǐn)?shù)為0.125 mL/L， 其成分為：NaWO4·2H2O 和NaMo4·2H2O 質(zhì)量濃度分別為0.63 和0.275 mg/L。 所用藥品均為分析純。
接種污泥取自實(shí)驗(yàn)室上流式厭氧污泥床反應(yīng)器UASB-4L 中，該厭氧氨氧化污泥總體積約為1.5 L，顏色為棕黃色，約占反應(yīng)器有效容積的24%，反應(yīng)器運(yùn)行各階段操作條件見表1。
表1 反應(yīng)器運(yùn)行各階段設(shè)計(jì)工況條件
1.3 測(cè)試項(xiàng)目與方法
每日采集水樣、監(jiān)測(cè)反應(yīng)器水溫、進(jìn)出水pH 值和產(chǎn)氣量變化， 所有水樣測(cè)定前均先經(jīng)過0.45 μm濾紙過濾。其中，pH 值采用玻璃電極法（PHSJ-3F 型pH 計(jì)，上海精密儀器儀表有限公司）測(cè)定；溫度采用電子水溫計(jì)測(cè)定； 產(chǎn)氣量采用濕式氣體流量計(jì)（LMF-1， 北京金志業(yè)儀器設(shè)備有限公司） 測(cè)定；NH4+-N，NO2--N 和NO3--N 濃度參照《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》第4 版所推薦的標(biāo)準(zhǔn)分析方法測(cè)定。
反應(yīng)器啟動(dòng)后于第1 天、第78 天、第125 天和第170 天分別取污泥樣品，記為AM1，AM2，AM3 和AM4。 再分別用PBS 溶液沖洗2 ～3 次，于離心管中靜置30 min 后棄去上層清液于-20 ℃冰箱中待用。
1.4 微生物群落組成及豐度測(cè)定方法
1.4.1 DNA 提取
根據(jù)FastDNASPIN 試劑盒（MPBiomedicals,Solon,OH,USA） 說明書進(jìn)行總DNA 抽提；DNA 濃度和純度采用NanoDrop2000 檢測(cè)；DNA 提取質(zhì)量采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
1.4.2 定量PCR 擴(kuò)增和Illumina 高通量測(cè)序
在細(xì)菌16SrRNA 基因V4 區(qū)， 采用通用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增及測(cè)序程序依據(jù)閆冰等[3]敘述方法。
1.4.3 數(shù)據(jù)處理與分析
采用美吉生物平臺(tái)對(duì)樣品中的微生物進(jìn)行高通量測(cè)序結(jié)果分析。
2 結(jié)果與討論
2.1 ANAMMOX 顆粒污泥反應(yīng)器的脫氮性能
ANAMMOX 顆粒污泥反應(yīng)器快速啟動(dòng)并運(yùn)行170 d， 通過調(diào)節(jié)進(jìn)水基質(zhì)濃度和HRT 來逐步提升進(jìn)水氮負(fù)荷（NLR），階段10 系統(tǒng)實(shí)際進(jìn)水NLR 最高達(dá)到了4.05 kg/(m3·d)（以（NH4++NO2-）計(jì)），該階段運(yùn)行穩(wěn)定后，NH4+-N，NO2--N 和TN 平均去除率分別為88.87%，93.09%和84.36%，反應(yīng)器平均氮去除負(fù)荷（NRR）達(dá)到3.41 kg/(m3·d)。 反應(yīng)器運(yùn)行各階段NH4+-N，NO2--N，NO3--N 進(jìn)、出水濃度及TN 去除率和氮去除負(fù)荷變化情況見圖2。 由圖2 可以看出，階段1， 保持HRT 為12 h， 進(jìn)水TN 質(zhì)量濃度為210 mg/L。 經(jīng)過31 d 的運(yùn)行，反應(yīng)器脫氮性能穩(wěn)步提升，系統(tǒng)運(yùn)行穩(wěn)定后NH4+-N，NO2--N 和TN 平均去除率分別達(dá)到95.71%，95.65%和88.60%， 第31 天出水NH4+-N 和NO2--N 質(zhì)量濃度分別為4.26 和4.79 mg/L，NRR 達(dá)到0.38 kg/（m3·d）。 階段2 ～階段10，通過調(diào)控進(jìn)水TN 濃度和HRT 以提升進(jìn)水NLR，主要分為“縮短HRT 同時(shí)降低進(jìn)水TN、 縮短HRT 且保持進(jìn)水TN 不變、增加進(jìn)水TN 且保持HRT 不變”3 種調(diào)控方式。整個(gè)過程反應(yīng)器表現(xiàn)出良好的脫氮性能，在提升NLR 時(shí)，去除率有短暫的下降，但很快即可恢復(fù)到較高的去除率。系統(tǒng)的NRR 隨著反應(yīng)器的運(yùn)行穩(wěn)步提升， 在HRT 變?yōu)? h 時(shí)，NRR 也有短暫的降低，而后又穩(wěn)定提升，最終穩(wěn)定保持在3.41 kg/(m3·d)左右，這與杜帥等[2]在厭氧氨氧化系統(tǒng)的快速啟動(dòng)研究結(jié)論相似。 此時(shí)，ANAMMOX 顆粒污泥反應(yīng)器脫氮性能良好且穩(wěn)定。
圖2 厭氧氨氧化顆粒污泥培養(yǎng)過程反應(yīng)器脫氮性能
2.2 基質(zhì)及產(chǎn)物化學(xué)計(jì)量關(guān)系變化
在ANAMMOX 顆粒污泥反應(yīng)器啟動(dòng)及運(yùn)行過程中，考察了NO2--N 去除量（△NO2--N）與NH4+-N去除量（△NH4+-N）,NO3--N 生成量（△NO3--N）與（△NH4+-N）的平均化學(xué)計(jì)量關(guān)系比的變化。 化學(xué)計(jì)量關(guān)系隨時(shí)間變化情況見圖3。 由圖3 可以看出，階段1，（△NO2--N）/（△NH4+-N）值低于理論值（1.146），（△NO3--N）/（△NH4+-N） 值前期低于理論值（0.161）[16-17]， 之后上升接近理論值， 說明此時(shí)的ANAMMOX 菌受到基質(zhì)沖擊，厭氧氨氧化反應(yīng)不穩(wěn)定，可能有氨氧化菌（AOB）參與反應(yīng)，將部分NH4+-N氧化為NO2--N， 同時(shí)可能存在短暫的菌體自溶現(xiàn)象， 致使體系內(nèi)反硝化細(xì)菌活動(dòng)， 使生成的部分NO3--N 被還原，導(dǎo)致（△NO2--N）/（△NH4+-N）值和（△NO3--N）/（△NH4+-N）值降低[18]。 階段2 ～階段8，（△NO2--N）/（△NH4+-N）值有所提升并接近理論值，（△NO3--N）/（△NH4+-N）值也在理論值附近，說明此時(shí)反應(yīng)器中厭氧氨氧化為主導(dǎo)脫氮途徑。 階段9 ～階段10，（△NO2--N）/（△NH4+-N）值和（△NO3--N）/（△NH4+-N） 值均高于理論值， 說明隨著負(fù)荷的提升，ANAMMOX 菌活性受到抑制， 而在長(zhǎng)期進(jìn)水過程中，容易存在復(fù)氧的情況，系統(tǒng)中少量的亞硝酸鹽氧化菌（NOB）將部分NO2--N 氧化為NO3--N。
圖3 化學(xué)計(jì)量關(guān)系隨時(shí)間變化情況
2.3 污泥EPS 含量和粒徑變化
微生物分泌的EPS 有助于促進(jìn)顆粒污泥的形成，提升系統(tǒng)微生物群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。ANAMMOX顆粒污泥粒徑的大小是污泥顆?；潭鹊闹匾甘緟?shù)，顆?；潭雀摺⒘酱蟮奈勰?，具有良好的沉降性能和抗沖擊負(fù)荷能力， 可實(shí)現(xiàn)生物量的有效保留[18]。 研究在HRT 分別為12 ，6 ，3 和2 h 時(shí)測(cè)定了污泥中EPS 含量見圖4。 由圖4 可以看出，第10 天～第165 天，EPS 含量逐漸增加，而蛋白質(zhì)是EPS 的主要成分。 蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)由64.48±3.76 mg/g 提高至127.67±2.59 mg/g。 蛋白質(zhì)與多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的比值（w（PN）/w（PS））與污泥表面電荷的疏水性直接相關(guān)，w（PN）/w（PS）值由2.78 逐漸增至4.30，提高了污泥間親和力，促進(jìn)了顆粒污泥的形成。接種污泥是取自實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的厭氧氨氧化污泥，顏色呈棕黃色，顆粒粒徑在0.3 ～4 mm 范圍內(nèi)。經(jīng)過長(zhǎng)期連續(xù)運(yùn)行，第165 天再次取出污泥， 此時(shí)顆粒污泥粒徑在5 ～12 mm 范圍內(nèi)， 且粒徑大于8 mm 的顆粒污泥占比較大， 說明通過提升NLR 可有效刺激ANAMMOX菌分泌胞外聚合物（EPS），EPS 是實(shí)現(xiàn)污泥團(tuán)聚和顆?；闹匾蛩豙18]。
圖4 污泥中EPS 含量變化
2.4 ANAMMOX 顆粒污泥反應(yīng)器微生物多樣性分析
2.4.1 微生物多樣性及豐富度分析
通過美吉生物云平臺(tái)對(duì)樣品中的微生物進(jìn)行高通量測(cè)序結(jié)果分析， 微生物群落豐度和多樣性見表2。 由表2 可以看出， 樣品AM1，AM2，AM3 和AM4的檢測(cè)覆蓋率均在99.6%以上，近似為1，可認(rèn)為該測(cè)序結(jié)果囊括了所有物種，具有代表性[2]。
表2 微生物群落豐度和多樣性
Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)、Ace 指數(shù)和Chao指數(shù)可反映ANAMMOX 顆粒污泥反應(yīng)器長(zhǎng)期運(yùn)行過程微生物群落多樣性特征。 Shannon 指數(shù)與Simpson 指數(shù)相似， 可用于估算樣本中微生物多樣性。 Shannon 指數(shù)值越大，說明群落多樣性越高，而Simpson 指數(shù)值越大，說明群落多樣性越低。 檢測(cè)樣品AM1，AM2，AM3 和AM4 的Shannon 指數(shù)值和Simpson 指數(shù)值與杜帥等[2]的研究結(jié)果相似，而與姜瀅等[12]在不同培養(yǎng)條件厭氧氨氧化顆粒污泥性質(zhì)及微生物群落結(jié)構(gòu)差異的研究結(jié)果相比，指數(shù)值較小，說明隨著反應(yīng)器的運(yùn)行， 系統(tǒng)內(nèi)的微生物多樣性在減少。 Ace 指數(shù)和Chao 指數(shù)均由CHAO A[19]提出，Ace 指數(shù)用來估計(jì)群落中OTU 數(shù)目，是生態(tài)學(xué)中估計(jì)物種總數(shù)的常用指數(shù)之一，Chao 指數(shù)是用chao1算法估計(jì)樣本中所含OTU 數(shù)目的指數(shù)。 Ace 指數(shù)值和Chao 指數(shù)值越大，則說明該樣品包含的物種數(shù)越多。4 個(gè)微生物樣品的檢測(cè)Ace 指數(shù)值和Chao 指數(shù)值與杜帥等[2]的研究結(jié)果相近，而與劉福長(zhǎng)等[20]的研究結(jié)果差值較小，這與之前的分析相符合，微生物群落結(jié)構(gòu)及豐富度呈下降趨勢(shì)。
2.4.2 門水平物種相對(duì)豐度分析
樣品門水平的微生物群落多樣性見圖5。 將微生物檢測(cè)相對(duì)豐度大于1%的菌群作為主要分析對(duì)象[21]。由圖5 可以看出，ANAMMOX 顆粒污泥反應(yīng)器優(yōu)勢(shì)菌門主要以綠彎菌門（Chloroflexi）、 變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、裝甲菌門（Armatimonadetes）和 浮霉菌門（Planctomycetes）為主。 反應(yīng)器在氮負(fù)荷提升過程中經(jīng)過長(zhǎng)期運(yùn)行， 浮霉菌門的相對(duì)豐度有很大提升，由最初的6.65%增至18.94%。 ANAMMOX 菌所屬的浮霉菌門相對(duì)豐度提高， 且反應(yīng)器脫氮性能逐步提升， 說明實(shí)現(xiàn)了厭氧氨氧化反應(yīng)的長(zhǎng)期穩(wěn)定維持。 Chloroflexi 的相對(duì)豐度一直保持在較高水平（25.43%～35.93%）， 它的存在將促進(jìn)細(xì)胞聚集，有利于顆粒污泥的形成。 Bacteroidetes 的相對(duì)豐度由18.78%降至2.96%，明顯減少，與曹雁等[22]的研究結(jié)果相似。
圖5 門水平物種相對(duì)豐度分布
2.4.3 屬水平物種相對(duì)豐度分析
屬水平物種相對(duì)豐度分布見圖6。 由圖6 可以看出， 樣品 AM1，AM2，AM3 和 AM4 中存在Candidatus_Kuenenia 和Candidatus_Brocadia 2 種ANAMMOX 菌。 其中，Candidatus_Kuenenia 的相對(duì)豐度占比由 3.60% 上升至 18.6% ， 而Candidatus_Brocadia 的相對(duì)豐度隨著反應(yīng)器的運(yùn)行，由2.2%逐漸減至0。 結(jié)果表明，反應(yīng)器啟動(dòng)初期的浮霉菌門微生物結(jié)構(gòu)與脫氮效能提升后差別較大， 可能是隨著反應(yīng)器的長(zhǎng)期運(yùn)行，ANAMMOX 污泥顆?；訌?qiáng)，Candidatus_Kuenenia 更容易聚集，而Candidatus_Brocadia 更適合在絮狀污泥中生存[23]。
圖6 屬水平物種相對(duì)豐度分布
除了浮霉菌門，變形菌門同樣具有脫氮功能，且以Denitratisoma 和Limnobacter 為主要功能微生物屬。 如樣品AM1 所示， 反應(yīng)器啟動(dòng)初期，Denitratisoma 和Limnobacter 的相對(duì)豐度占比分別為1.84%和10.74%。 經(jīng)過長(zhǎng)期連續(xù)性運(yùn)行，Denitratisoma 的比例有所增加，最終約占9.94%，這可能是反硝化菌利用了反應(yīng)器中經(jīng)細(xì)胞代謝或微生物死亡后的有機(jī)物來維持自身生長(zhǎng)代謝， 以完成反硝化過程，從而進(jìn)一步提高系統(tǒng)脫氮效率[12]。 有研究表明，Limnobacter 可削弱外界環(huán)境變化對(duì)ANAMMOX 菌的沖擊[3]，其在樣品AM1，AM2 和AM3中占比均在10%以上。
3 結(jié)論
（1）系統(tǒng)進(jìn)水氮負(fù)荷由0.42 kg/（m3·d）提升至3.72 kg/(m3·d)，NH4+-N，NO2--N 和TN 去除率最高分別達(dá)到89.37%，91.85%和83.35%， 氮去除負(fù)荷由0.29 kg/(m3·d)提升至3.51 kg/(m3·d)。 氮負(fù)荷提升可有效刺激ANAMMOX 菌分泌胞外聚合物EPS，有利于污泥團(tuán)聚，同時(shí)縮短HRT 后較大的水力剪切力可促進(jìn)污泥顆?；?，從而提升厭氧氨氧化脫氮性能。
（2）經(jīng)過長(zhǎng)期運(yùn)行，反應(yīng)器中Planctomycetes 的相對(duì)豐度有很大提升， 由最初的6.65%增至18.94%。 Chloroflexi 的相對(duì)豐度一直保持在較高水平（25.43%～35.93%），有利于細(xì)胞聚集，在顆粒污泥的形成中起骨架作用。
（3） 樣品 AM1，AM2，AM3 和 AM4中存在Candidatus_Kuenenia 和 Candidatus_Brocadia 2 種ANAMMOX 菌， 但隨著ANAMMOX 污泥顆?；潭炔粩嗉訌?qiáng)， 由于Candidatus_Kuenenia 更容易聚集，其豐度逐漸增加，而Candidatus_Brocadia 逐漸消失。
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1 材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)裝置及運(yùn)行
實(shí)驗(yàn)裝置示意見圖1。 由圖1 可以看出，反應(yīng)器由有機(jī)玻璃制成， 主反應(yīng)區(qū)內(nèi)徑為10 cm， 高為80 cm，三相分離器內(nèi)徑為13.93 cm，高為30 cm，總?cè)莘e為10.25 L，有效容積為6.25 L。 反應(yīng)器外包裹鋁箔海綿材料以避光；設(shè)有循環(huán)水浴恒溫槽，保持反應(yīng)器內(nèi)主體溫度為35±1 ℃。 原水和回流混合液一同進(jìn)入主反應(yīng)區(qū)，通過三相分離器實(shí)現(xiàn)泥水分離，出水流入沉淀池。初始水力停留時(shí)間（HRT）設(shè)定為12 h。
圖1 厭氧氨氧化顆粒污泥UASB 反應(yīng)器示意
1.2 實(shí)驗(yàn)用水及接種污泥
實(shí)驗(yàn)進(jìn)水為模擬廢水，以NH4+-N 和NO2--N 為氮源，分別由NH4HCO3和NaNO2按需提供，NH4+-N和NO2--N 的質(zhì)量濃度比值控制在1.00 ～1.32 之間，起始TN 質(zhì)量濃度為100 mg/L；由NaHCO3提供無機(jī)碳源， 同時(shí)調(diào)節(jié)進(jìn)水pH 值在7.8 ～8.5 之間，NaHCO3質(zhì)量濃度為400 mg/L。 其他組分為：CaCl2，KH2PO4，MgSO4·7H2O，EDTA-2Na，F(xiàn)eSO4·7H2O 質(zhì)量濃度分別為25，50，50，3，6.67 mg/L， 微量元素濃縮液的體積分?jǐn)?shù)為0.125 mL/L， 其成分為：NaWO4·2H2O 和NaMo4·2H2O 質(zhì)量濃度分別為0.63 和0.275 mg/L。 所用藥品均為分析純。
接種污泥取自實(shí)驗(yàn)室上流式厭氧污泥床反應(yīng)器UASB-4L 中，該厭氧氨氧化污泥總體積約為1.5 L，顏色為棕黃色，約占反應(yīng)器有效容積的24%，反應(yīng)器運(yùn)行各階段操作條件見表1。
表1 反應(yīng)器運(yùn)行各階段設(shè)計(jì)工況條件
1.3 測(cè)試項(xiàng)目與方法
每日采集水樣、監(jiān)測(cè)反應(yīng)器水溫、進(jìn)出水pH 值和產(chǎn)氣量變化， 所有水樣測(cè)定前均先經(jīng)過0.45 μm濾紙過濾。其中，pH 值采用玻璃電極法（PHSJ-3F 型pH 計(jì)，上海精密儀器儀表有限公司）測(cè)定；溫度采用電子水溫計(jì)測(cè)定； 產(chǎn)氣量采用濕式氣體流量計(jì)（LMF-1， 北京金志業(yè)儀器設(shè)備有限公司） 測(cè)定；NH4+-N，NO2--N 和NO3--N 濃度參照《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》第4 版所推薦的標(biāo)準(zhǔn)分析方法測(cè)定。
反應(yīng)器啟動(dòng)后于第1 天、第78 天、第125 天和第170 天分別取污泥樣品，記為AM1，AM2，AM3 和AM4。 再分別用PBS 溶液沖洗2 ～3 次，于離心管中靜置30 min 后棄去上層清液于-20 ℃冰箱中待用。
1.4 微生物群落組成及豐度測(cè)定方法
1.4.1 DNA 提取
根據(jù)FastDNASPIN 試劑盒（MPBiomedicals,Solon,OH,USA） 說明書進(jìn)行總DNA 抽提；DNA 濃度和純度采用NanoDrop2000 檢測(cè)；DNA 提取質(zhì)量采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
1.4.2 定量PCR 擴(kuò)增和Illumina 高通量測(cè)序
在細(xì)菌16SrRNA 基因V4 區(qū)， 采用通用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增及測(cè)序程序依據(jù)閆冰等[3]敘述方法。
1.4.3 數(shù)據(jù)處理與分析
采用美吉生物平臺(tái)對(duì)樣品中的微生物進(jìn)行高通量測(cè)序結(jié)果分析。
2 結(jié)果與討論
2.1 ANAMMOX 顆粒污泥反應(yīng)器的脫氮性能
ANAMMOX 顆粒污泥反應(yīng)器快速啟動(dòng)并運(yùn)行170 d， 通過調(diào)節(jié)進(jìn)水基質(zhì)濃度和HRT 來逐步提升進(jìn)水氮負(fù)荷（NLR），階段10 系統(tǒng)實(shí)際進(jìn)水NLR 最高達(dá)到了4.05 kg/(m3·d)（以（NH4++NO2-）計(jì)），該階段運(yùn)行穩(wěn)定后，NH4+-N，NO2--N 和TN 平均去除率分別為88.87%，93.09%和84.36%，反應(yīng)器平均氮去除負(fù)荷（NRR）達(dá)到3.41 kg/(m3·d)。 反應(yīng)器運(yùn)行各階段NH4+-N，NO2--N，NO3--N 進(jìn)、出水濃度及TN 去除率和氮去除負(fù)荷變化情況見圖2。 由圖2 可以看出，階段1， 保持HRT 為12 h， 進(jìn)水TN 質(zhì)量濃度為210 mg/L。 經(jīng)過31 d 的運(yùn)行，反應(yīng)器脫氮性能穩(wěn)步提升，系統(tǒng)運(yùn)行穩(wěn)定后NH4+-N，NO2--N 和TN 平均去除率分別達(dá)到95.71%，95.65%和88.60%， 第31 天出水NH4+-N 和NO2--N 質(zhì)量濃度分別為4.26 和4.79 mg/L，NRR 達(dá)到0.38 kg/（m3·d）。 階段2 ～階段10，通過調(diào)控進(jìn)水TN 濃度和HRT 以提升進(jìn)水NLR，主要分為“縮短HRT 同時(shí)降低進(jìn)水TN、 縮短HRT 且保持進(jìn)水TN 不變、增加進(jìn)水TN 且保持HRT 不變”3 種調(diào)控方式。整個(gè)過程反應(yīng)器表現(xiàn)出良好的脫氮性能，在提升NLR 時(shí)，去除率有短暫的下降，但很快即可恢復(fù)到較高的去除率。系統(tǒng)的NRR 隨著反應(yīng)器的運(yùn)行穩(wěn)步提升， 在HRT 變?yōu)? h 時(shí)，NRR 也有短暫的降低，而后又穩(wěn)定提升，最終穩(wěn)定保持在3.41 kg/(m3·d)左右，這與杜帥等[2]在厭氧氨氧化系統(tǒng)的快速啟動(dòng)研究結(jié)論相似。 此時(shí)，ANAMMOX 顆粒污泥反應(yīng)器脫氮性能良好且穩(wěn)定。
圖2 厭氧氨氧化顆粒污泥培養(yǎng)過程反應(yīng)器脫氮性能
2.2 基質(zhì)及產(chǎn)物化學(xué)計(jì)量關(guān)系變化
在ANAMMOX 顆粒污泥反應(yīng)器啟動(dòng)及運(yùn)行過程中，考察了NO2--N 去除量（△NO2--N）與NH4+-N去除量（△NH4+-N）,NO3--N 生成量（△NO3--N）與（△NH4+-N）的平均化學(xué)計(jì)量關(guān)系比的變化。 化學(xué)計(jì)量關(guān)系隨時(shí)間變化情況見圖3。 由圖3 可以看出，階段1，（△NO2--N）/（△NH4+-N）值低于理論值（1.146），（△NO3--N）/（△NH4+-N） 值前期低于理論值（0.161）[16-17]， 之后上升接近理論值， 說明此時(shí)的ANAMMOX 菌受到基質(zhì)沖擊，厭氧氨氧化反應(yīng)不穩(wěn)定，可能有氨氧化菌（AOB）參與反應(yīng)，將部分NH4+-N氧化為NO2--N， 同時(shí)可能存在短暫的菌體自溶現(xiàn)象， 致使體系內(nèi)反硝化細(xì)菌活動(dòng)， 使生成的部分NO3--N 被還原，導(dǎo)致（△NO2--N）/（△NH4+-N）值和（△NO3--N）/（△NH4+-N）值降低[18]。 階段2 ～階段8，（△NO2--N）/（△NH4+-N）值有所提升并接近理論值，（△NO3--N）/（△NH4+-N）值也在理論值附近，說明此時(shí)反應(yīng)器中厭氧氨氧化為主導(dǎo)脫氮途徑。 階段9 ～階段10，（△NO2--N）/（△NH4+-N）值和（△NO3--N）/（△NH4+-N） 值均高于理論值， 說明隨著負(fù)荷的提升，ANAMMOX 菌活性受到抑制， 而在長(zhǎng)期進(jìn)水過程中，容易存在復(fù)氧的情況，系統(tǒng)中少量的亞硝酸鹽氧化菌（NOB）將部分NO2--N 氧化為NO3--N。
圖3 化學(xué)計(jì)量關(guān)系隨時(shí)間變化情況
2.3 污泥EPS 含量和粒徑變化
微生物分泌的EPS 有助于促進(jìn)顆粒污泥的形成，提升系統(tǒng)微生物群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。ANAMMOX顆粒污泥粒徑的大小是污泥顆?；潭鹊闹匾甘緟?shù)，顆?；潭雀摺⒘酱蟮奈勰?，具有良好的沉降性能和抗沖擊負(fù)荷能力， 可實(shí)現(xiàn)生物量的有效保留[18]。 研究在HRT 分別為12 ，6 ，3 和2 h 時(shí)測(cè)定了污泥中EPS 含量見圖4。 由圖4 可以看出，第10 天～第165 天，EPS 含量逐漸增加，而蛋白質(zhì)是EPS 的主要成分。 蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)由64.48±3.76 mg/g 提高至127.67±2.59 mg/g。 蛋白質(zhì)與多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的比值（w（PN）/w（PS））與污泥表面電荷的疏水性直接相關(guān)，w（PN）/w（PS）值由2.78 逐漸增至4.30，提高了污泥間親和力，促進(jìn)了顆粒污泥的形成。接種污泥是取自實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的厭氧氨氧化污泥，顏色呈棕黃色，顆粒粒徑在0.3 ～4 mm 范圍內(nèi)。經(jīng)過長(zhǎng)期連續(xù)運(yùn)行，第165 天再次取出污泥， 此時(shí)顆粒污泥粒徑在5 ～12 mm 范圍內(nèi)， 且粒徑大于8 mm 的顆粒污泥占比較大， 說明通過提升NLR 可有效刺激ANAMMOX菌分泌胞外聚合物（EPS），EPS 是實(shí)現(xiàn)污泥團(tuán)聚和顆?；闹匾蛩豙18]。
圖4 污泥中EPS 含量變化
2.4 ANAMMOX 顆粒污泥反應(yīng)器微生物多樣性分析
2.4.1 微生物多樣性及豐富度分析
通過美吉生物云平臺(tái)對(duì)樣品中的微生物進(jìn)行高通量測(cè)序結(jié)果分析， 微生物群落豐度和多樣性見表2。 由表2 可以看出， 樣品AM1，AM2，AM3 和AM4的檢測(cè)覆蓋率均在99.6%以上，近似為1，可認(rèn)為該測(cè)序結(jié)果囊括了所有物種，具有代表性[2]。
表2 微生物群落豐度和多樣性
Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)、Ace 指數(shù)和Chao指數(shù)可反映ANAMMOX 顆粒污泥反應(yīng)器長(zhǎng)期運(yùn)行過程微生物群落多樣性特征。 Shannon 指數(shù)與Simpson 指數(shù)相似， 可用于估算樣本中微生物多樣性。 Shannon 指數(shù)值越大，說明群落多樣性越高，而Simpson 指數(shù)值越大，說明群落多樣性越低。 檢測(cè)樣品AM1，AM2，AM3 和AM4 的Shannon 指數(shù)值和Simpson 指數(shù)值與杜帥等[2]的研究結(jié)果相似，而與姜瀅等[12]在不同培養(yǎng)條件厭氧氨氧化顆粒污泥性質(zhì)及微生物群落結(jié)構(gòu)差異的研究結(jié)果相比，指數(shù)值較小，說明隨著反應(yīng)器的運(yùn)行， 系統(tǒng)內(nèi)的微生物多樣性在減少。 Ace 指數(shù)和Chao 指數(shù)均由CHAO A[19]提出，Ace 指數(shù)用來估計(jì)群落中OTU 數(shù)目，是生態(tài)學(xué)中估計(jì)物種總數(shù)的常用指數(shù)之一，Chao 指數(shù)是用chao1算法估計(jì)樣本中所含OTU 數(shù)目的指數(shù)。 Ace 指數(shù)值和Chao 指數(shù)值越大，則說明該樣品包含的物種數(shù)越多。4 個(gè)微生物樣品的檢測(cè)Ace 指數(shù)值和Chao 指數(shù)值與杜帥等[2]的研究結(jié)果相近，而與劉福長(zhǎng)等[20]的研究結(jié)果差值較小，這與之前的分析相符合，微生物群落結(jié)構(gòu)及豐富度呈下降趨勢(shì)。
2.4.2 門水平物種相對(duì)豐度分析
樣品門水平的微生物群落多樣性見圖5。 將微生物檢測(cè)相對(duì)豐度大于1%的菌群作為主要分析對(duì)象[21]。由圖5 可以看出，ANAMMOX 顆粒污泥反應(yīng)器優(yōu)勢(shì)菌門主要以綠彎菌門（Chloroflexi）、 變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、裝甲菌門（Armatimonadetes）和 浮霉菌門（Planctomycetes）為主。 反應(yīng)器在氮負(fù)荷提升過程中經(jīng)過長(zhǎng)期運(yùn)行， 浮霉菌門的相對(duì)豐度有很大提升，由最初的6.65%增至18.94%。 ANAMMOX 菌所屬的浮霉菌門相對(duì)豐度提高， 且反應(yīng)器脫氮性能逐步提升， 說明實(shí)現(xiàn)了厭氧氨氧化反應(yīng)的長(zhǎng)期穩(wěn)定維持。 Chloroflexi 的相對(duì)豐度一直保持在較高水平（25.43%～35.93%）， 它的存在將促進(jìn)細(xì)胞聚集，有利于顆粒污泥的形成。 Bacteroidetes 的相對(duì)豐度由18.78%降至2.96%，明顯減少，與曹雁等[22]的研究結(jié)果相似。
圖5 門水平物種相對(duì)豐度分布
2.4.3 屬水平物種相對(duì)豐度分析
屬水平物種相對(duì)豐度分布見圖6。 由圖6 可以看出， 樣品 AM1，AM2，AM3 和 AM4 中存在Candidatus_Kuenenia 和Candidatus_Brocadia 2 種ANAMMOX 菌。 其中，Candidatus_Kuenenia 的相對(duì)豐度占比由 3.60% 上升至 18.6% ， 而Candidatus_Brocadia 的相對(duì)豐度隨著反應(yīng)器的運(yùn)行，由2.2%逐漸減至0。 結(jié)果表明，反應(yīng)器啟動(dòng)初期的浮霉菌門微生物結(jié)構(gòu)與脫氮效能提升后差別較大， 可能是隨著反應(yīng)器的長(zhǎng)期運(yùn)行，ANAMMOX 污泥顆?；訌?qiáng)，Candidatus_Kuenenia 更容易聚集，而Candidatus_Brocadia 更適合在絮狀污泥中生存[23]。
圖6 屬水平物種相對(duì)豐度分布
除了浮霉菌門，變形菌門同樣具有脫氮功能，且以Denitratisoma 和Limnobacter 為主要功能微生物屬。 如樣品AM1 所示， 反應(yīng)器啟動(dòng)初期，Denitratisoma 和Limnobacter 的相對(duì)豐度占比分別為1.84%和10.74%。 經(jīng)過長(zhǎng)期連續(xù)性運(yùn)行，Denitratisoma 的比例有所增加，最終約占9.94%，這可能是反硝化菌利用了反應(yīng)器中經(jīng)細(xì)胞代謝或微生物死亡后的有機(jī)物來維持自身生長(zhǎng)代謝， 以完成反硝化過程，從而進(jìn)一步提高系統(tǒng)脫氮效率[12]。 有研究表明，Limnobacter 可削弱外界環(huán)境變化對(duì)ANAMMOX 菌的沖擊[3]，其在樣品AM1，AM2 和AM3中占比均在10%以上。
3 結(jié)論
（1）系統(tǒng)進(jìn)水氮負(fù)荷由0.42 kg/（m3·d）提升至3.72 kg/(m3·d)，NH4+-N，NO2--N 和TN 去除率最高分別達(dá)到89.37%，91.85%和83.35%， 氮去除負(fù)荷由0.29 kg/(m3·d)提升至3.51 kg/(m3·d)。 氮負(fù)荷提升可有效刺激ANAMMOX 菌分泌胞外聚合物EPS，有利于污泥團(tuán)聚，同時(shí)縮短HRT 后較大的水力剪切力可促進(jìn)污泥顆?；?，從而提升厭氧氨氧化脫氮性能。
（2）經(jīng)過長(zhǎng)期運(yùn)行，反應(yīng)器中Planctomycetes 的相對(duì)豐度有很大提升， 由最初的6.65%增至18.94%。 Chloroflexi 的相對(duì)豐度一直保持在較高水平（25.43%～35.93%），有利于細(xì)胞聚集，在顆粒污泥的形成中起骨架作用。
（3） 樣品 AM1，AM2，AM3 和 AM4中存在Candidatus_Kuenenia 和 Candidatus_Brocadia 2 種ANAMMOX 菌， 但隨著ANAMMOX 污泥顆?；潭炔粩嗉訌?qiáng)， 由于Candidatus_Kuenenia 更容易聚集，其豐度逐漸增加，而Candidatus_Brocadia 逐漸消失。
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