趙志恒 ，張胤弢 ，李璨 ，李蕾 ，徐家淳

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院腦病針灸中心，天津 300250；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，天津 301617）

脊髓損傷（SCI）是由墜落、交通事故及暴力損傷等因素導(dǎo)致一種破壞性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。SCI具有高致死率和高致殘率的特點，可造成脊髓功能暫時或永久性的缺損，表現(xiàn)為損傷平面以下運動、感覺或自主功能的喪失[1-2]。盡管已有大量對于SCI的基礎(chǔ)研究和臨床治療研究，但西醫(yī)對此缺乏有效的治療措施。

SCI屬于中醫(yī)“痿證”“痹證”“體惰”的范疇，臨床研究已證實傳統(tǒng)針刺療法治療該病獲效顯著[3-4]。而火針療法屬于針刺療法的一種，具有獨特的“溫通”效應(yīng)，可有效治療痹證、痿證。研究表明，火針療法可改善SCI后相關(guān)癥狀[5]，但火針“溫通”作用的起效靶點及作用機(jī)制仍待挖掘。

熱休克蛋白(HSP)是在高溫、機(jī)械損傷、炎癥等各種應(yīng)激性刺激下產(chǎn)生的具有多種生物學(xué)保護(hù)作用的內(nèi)源性應(yīng)激蛋白，這可能與火針“溫通”效應(yīng)的作用靶點有關(guān)。HSP可通過抑制神經(jīng)元凋亡，在SCI后繼發(fā)性損傷中起著重要的保護(hù)作用。因此，本研究擬在紅外測溫的基礎(chǔ)上，觀察火針療法對HSP60的影響，探索火針療法是否具有減輕SCI后神經(jīng)元凋亡的作用，為明確火針療法“溫通”效應(yīng)改善脊髓損傷的作用靶點提供部分實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF級雌性SD大鼠120只，體質(zhì)量240～260 g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，合格證號：SCXK（京）2019-0010；大鼠均飼養(yǎng)于南開醫(yī)院實驗動物中心（12 h光照-黑暗交替，室溫22℃，相對濕度50%）。采用隨機(jī)數(shù)字表法將只大鼠隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組、模型組、毫針組、艾灸組、火針組，每組分為1、3、7、14 d共4個時點（參考Lee等的研究[6]），每組每個時點6只大鼠。造模前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，食水自由。

本研究動物實驗方案經(jīng)過天津市南開醫(yī)院實驗動物倫理委員會審核（NKYY-DWL-2020-166），符合動物保護(hù)、動物福利和倫理原則，死亡動物釆取隨機(jī)原則補齊數(shù)量。

1.2 主要試劑與儀器 電動顱腦脊髓損傷撞擊儀（安徽耀坤 ZL-008），小動物麻醉機(jī)（R540IP），InfiRay紅外測溫手機(jī)熱像儀T2L，科研實驗用異氟烷（R510-22-16），Anti-HSP60，4%多聚甲醛（天津易生源），賀氏細(xì)火針（0.3 mm），艾絨，免疫組化檢測試劑盒（SP-0023，北京博奧森）。

2 方法

2.1 動物造模 采用小動物麻醉機(jī)異氟烷氣體麻醉大鼠后，采用改良的Allen’s法制備SCI模型[7]，以大鼠尾巴痙攣性擺動、雙下肢及身體回縮抽動、呈弛緩性癱瘓為造模成功。模型組、毫針組、艾灸組、火針組均進(jìn)行造模處理，假手術(shù)組只做胸（T）9～10椎板切除術(shù)。造模成功后每天擠壓排尿3次，直至反射性膀胱排空建立。

2.2 干預(yù)方法 造模成功后，對各組大鼠進(jìn)行相應(yīng)干預(yù)。選穴：T7、T8、T11和 T12棘突下及 T9、T10棘突下左右旁開0.5 cm處夾脊穴，共8穴。

毫針組：選用杏林牌一次性針（0.3 mm×25 mm），采用常規(guī)針刺法施于穴位，進(jìn)針深度為3～5 mm，常規(guī)留針30 min，每24 h針刺1次。

艾灸組：將大鼠固定后，在相應(yīng)穴位用麥粒灸（約5 mg艾絨/壯）灸5壯，每24 h施灸一次。

火針組：選用細(xì)火針（0.3 mm×25 mm），75%醫(yī)用酒精棉球充分消毒針具和針刺部位，術(shù)者手持賀氏細(xì)火針，在酒精燈外焰處沿針體—針尖的順序燒紅，然后快速點刺腧穴，進(jìn)針深度為3～5 mm，每24 h針刺1次。

假手術(shù)組和模型組大鼠不進(jìn)行治療性干預(yù)，在相同時間給予相同強(qiáng)度的抓取、固定，相應(yīng)時點檢測。

2.3 檢測指標(biāo)

2.3.1 行為學(xué)評分 采用Basso Beattie Bresnahan（BBB）行為功能評分[8]，觀察火針對脊髓損傷模型大鼠神經(jīng)功能缺損恢復(fù)程度的影響。

2.3.2 紅外測溫成像 采用InfiRay紅外測溫手機(jī)熱像儀T2L對各組大鼠基礎(chǔ)體溫、干預(yù)即刻及干預(yù)后不同時點進(jìn)行紅外測溫，測溫環(huán)境：溫度22℃，濕度50%。其中，假手術(shù)組和模型組因體溫波動不明顯，僅觀察30 min，而毫針組、艾灸組和火針組大鼠均延長測溫時點，測溫至90 min。

2.3.3 免疫組化檢測HSP60表達(dá) 各組大鼠（每組12 只）在相應(yīng)時點（1、3、7、14 d）斷頭處死后，提取損傷節(jié)段脊髓組織，參照免疫組化檢測試劑盒（SP-0023，北京博奧森）說明書進(jìn)行免疫組化染色，鏡下觀察陽性細(xì)胞數(shù)，比較各組脊髓損傷部位HSP60的表達(dá)。

2.3.4 TUNEL染色檢測神經(jīng)元凋亡 各組大鼠（每組 12只）在相應(yīng)時點（1、3、7和 14 d）斷頭處死后，提取損傷節(jié)段脊髓組織，參照試劑盒進(jìn)行TUNEL染色，光鏡下觀察神經(jīng)元凋亡情況。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，根據(jù)正態(tài)性和方差齊性檢驗結(jié)果，組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 行為學(xué)結(jié)果 在相應(yīng)時間點對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分，結(jié)果顯示假手術(shù)組大鼠在各個時間點均無神經(jīng)功能缺損癥狀；模型組大鼠在各個時間點神經(jīng)功能評分均明顯低于假手術(shù)組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與模型組相應(yīng)時點相比，毫針組在7 d、艾灸組在7、14 d，火針組在3、7和14 d評分均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與毫針組相比，火針組14 d時評分明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與艾灸組相比，火針組在7 d和14 d評分明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

表1 各組大鼠不同時間點BBB評分（±s）Tab.1 BBB scores of rats in each group at different time points（±s） 分

注：與假手術(shù)組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05；與毫針組相比，△P<0.05；與艾灸組相比，▲P<0.05。

組別 動物數(shù) 時間節(jié)點1 d 3 d 7 d 14 d假手術(shù)組 6 21.00±0.00 21.00±0.00 21.00±0.00 21.00±0.00模型組 6 0.67±0.82* 1.67±1.03* 3.67±1.96* 7.50±1.38*毫針組 6 1.50±1.22 2.33±0.82 6.67±2.25# 8.67±1.37艾灸組 6 1.17±0.41 2.67±1.03 5.50±2.07# 9.83±2.48#火針組 6 1.00±0.89 3.83±1.72# 7.16±0.98#▲ 13.00±3.58#△▲

3.2 紅外測溫結(jié)果 紅外測溫結(jié)果顯示，各組大鼠基礎(chǔ)體溫較一致，在39℃左右。各組大鼠基礎(chǔ)體溫較高，考慮與固定時大鼠掙扎活動有關(guān)。假手術(shù)組與模型組大鼠在測溫過程中溫度波動較小，因此測溫至固定后30 min。見表2、圖1。

圖1 紅外測溫成像下各組大鼠基礎(chǔ)體溫和0～30 min脊髓損傷局部溫度變化Fig.1 Infrared thermometry changes in local temperature of SCI rats in each group at basal body temperature and 0～30 min

毫針組與火針組大鼠在針刺即刻體溫出現(xiàn)明顯降低，考慮與針刺后應(yīng)激有關(guān)，艾灸組在艾灸即刻溫度上升，考慮與艾灸輻射的熱量有關(guān)。艾灸5min至30 min大鼠脊髓損傷局部體溫波動不明顯，艾灸停止后，即40min時，艾灸組大鼠溫度明顯降低，50min時恢復(fù)至基礎(chǔ)體溫左右，此后溫度波動不明顯。

毫針組與火針組體溫波動呈現(xiàn)相似的趨勢，針刺即刻時體溫降低，5 min時溫度回升。毫針組在針刺干預(yù)期間（30 min）體溫一直低于基礎(chǔ)體溫，考慮與針刺應(yīng)激相關(guān)，40 min時，停止干預(yù)后毫針組體溫呈現(xiàn)上升趨勢，波動在基礎(chǔ)體溫上下，維持到90min?；疳樈M在火針干預(yù)5 min后溫度呈緩慢上升趨勢，升高0.5℃左右，且升溫過程持續(xù)至90 min，見表2、3，圖 2、3。

圖2 紅外測溫成像下各組大鼠40～90 min脊髓損傷局部溫度變化Fig.2 Infrared thermometry changes in local temperature of SCI rats of 3 groups at 40～90 min

圖3 各組干預(yù)后不同時間點損傷部位溫度Fig.3 Temperature of the injury siteafter intervention in each group at different time points

表2 各組大鼠基礎(chǔ)體溫和0～30 min脊髓損傷局部溫度變化（±s）Tab.2 Changes in local temperature of SCI rats in each group at basal body temperature and 0～30 min（±s） ℃

表2 各組大鼠基礎(chǔ)體溫和0～30 min脊髓損傷局部溫度變化（±s）Tab.2 Changes in local temperature of SCI rats in each group at basal body temperature and 0～30 min（±s） ℃

組別 動物數(shù) 0 min 5 min 10 min 20 min 30 min假手術(shù)組 12 39.14±0.89 39.47±0.82 39.45±0.60 39.38±0.93 39.63±1.35 39.08±0.90模型組 11 38.93±0.64 38.98±0.88 38.69±0.69 39.16±0.87 39.10±0.50 38.95±0.41毫針組 13 38.81±0.95 37.59±1.62 38.24±1.93 38.22±2.19 37.84±2.20 37.96±2.22艾灸組 13 39.18±0.62 39.58±1.22 39.14±1.36 39.15±0.68 38.91±0.65 38.71±0.85火針組 12 39.19±0.92 38.53±1.09 38.35±1.27 38.52±1.41 38.73±1.29 38.53±1.21基礎(chǔ)體溫 時間節(jié)點

表3 3組大鼠40～90 min脊髓損傷局部溫度變化（±s）Tab.3 Changes in local temperature of SCI rats of 3 groups at 40～90 min（±s） ℃

表3 3組大鼠40～90 min脊髓損傷局部溫度變化（±s）Tab.3 Changes in local temperature of SCI rats of 3 groups at 40～90 min（±s） ℃

時間節(jié)點40 min 50 min 60 min 70 min 80 min 90 min毫針組 13 39.08±1.57 38.83±1.32 38.96±1.83 39.23±0.85 38.04±2.98 39.70±0.81艾灸組 13 36.84±8.28 38.69±0.99 38.80±1.17 38.91±1.41 39.39±0.79 38.72±1.39火針組 12 38.58±1.24 39.03±1.78 38.54±1.50 38.96±1.03 39.08±1.44 39.40±0.66組別 動物數(shù)

3.3 HSP60免疫組化結(jié)果 免疫組化染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組在各個時點HSP60的陽性表達(dá)相對穩(wěn)定；而模型組在1 d時HSP60的陽性表達(dá)低于假手術(shù)組；與模型組各個時點相比，毫針組、艾灸組的HSP60陽性表達(dá)均增高；與毫針組和艾灸組相比，火針組HSP60陽性表達(dá)升高，且在7 d和14 d時升高最明顯，見圖4。

圖4 各組HSP60免疫組化染色結(jié)果Fig.4 Immunohistochemical staining results of HSP60 in each group

3.4 神經(jīng)元凋亡情況 TUNEL染色顯示假手術(shù)組在各個時點均無或存在少量神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況；模型組在1 d時凋亡細(xì)胞明顯增多，3、7和14 d時有所減輕；1 d時，與模型組相比，毫針組、艾灸組和火針組神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況與模型組相同，可見大量褐色細(xì)胞；3 d時毫針組、艾灸組和火針組神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況少于模型組，持續(xù)至7和14 d，其中火針組在14 d時僅可見少量神經(jīng)細(xì)胞凋亡，見圖5。表明毫針、艾灸和火針療法均可有效減輕脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況，其中火針療法作用較為明顯。

圖5 各組大鼠不同時點神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況（TUNEL染色）Fig.5 Apoptosis of nerve cells points in rats in each groupat different times（TUNEL staining）

4 討論

《黃帝內(nèi)經(jīng)》云：“若有所墮墜，四肢懈惰不收，名曰體惰”，故SCI多歸屬于中醫(yī)“痿證”“體惰”范疇。SCI的損傷部位及程度的不同可導(dǎo)致不同程度的神經(jīng)功能缺損，表現(xiàn)為部分感覺或運動功能喪失、甚至受傷部位下方的完全癱瘓。不僅給患者帶來巨大痛苦，而且給社會帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。SCI的病理生理學(xué)進(jìn)展被分為原發(fā)性和繼發(fā)性損傷：原發(fā)性損傷通常由初始機(jī)械變化引起，并在損傷后立即發(fā)生，這是不可逆的；而繼發(fā)性損傷是可逆的，被認(rèn)為對SCI后的神經(jīng)功能恢復(fù)有更顯著的影響。

本病病位在督脈，督脈為“陽脈之?！保枤庹摺熬珓t養(yǎng)神，柔則養(yǎng)筋”，督脈受損則不能濡養(yǎng)四肢肌肉而表現(xiàn)為肢體癱瘓、痿弱失用，治當(dāng)以溫通助陽?；疳槸煼ㄊ菍⑻刂频尼樉呓?jīng)加熱燒紅后刺入人體腧穴以治療疾病的方法，具有溫通陽氣之功效，首屆國醫(yī)大師賀普仁教授倡導(dǎo)火針療法的使用，認(rèn)為其具有“溫通”的效應(yīng)兼有“溫?zé)帷焙汀搬槾獭钡碾p重功效，火針的治病機(jī)制在溫?zé)?。廣泛應(yīng)用于骨科、神經(jīng)科等常見病種，且具有其優(yōu)勢病種，脊髓損傷即是其中之一[9]。

本課題組圍繞火針治療SCI的機(jī)制進(jìn)行了一系列研究，發(fā)現(xiàn)火針療法可促進(jìn)SCI后神經(jīng)元再生，有效改善模型大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀[10]，但其起效靶點仍待進(jìn)一步深入挖掘。課題組認(rèn)為，火針針刺后強(qiáng)烈的針感和持續(xù)的熱刺激對于機(jī)體來說可作為一種應(yīng)激原，可能會在一定程度上激活熱休克蛋白（HSP）家族相關(guān)蛋白，提高機(jī)體抵抗疾病能力。

HSP是生物細(xì)胞在各種應(yīng)激性刺激（如高溫、炎癥、缺血缺氧、DNA損傷等）作用下產(chǎn)生的一組具有多種生物學(xué)保護(hù)作用的內(nèi)源性應(yīng)激蛋白，可增強(qiáng)機(jī)體對多種應(yīng)激原的耐受能力，是應(yīng)激反應(yīng)中機(jī)體在分子水平上的保護(hù)機(jī)制[11]。已有研究發(fā)現(xiàn)，無論是針刺的機(jī)械刺激[12]還是艾灸的溫?zé)岽碳13-14]均可在一定程度上誘導(dǎo)HSP家族的合成，提高機(jī)體抵抗疾病能力。HSP在SCI后繼發(fā)性損傷中起著重要的保護(hù)作用，已被證實是脊髓損傷后產(chǎn)生的一種重要的內(nèi)源性保護(hù)因子[15-16]，可通過不同途徑發(fā)揮抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡、抑制神經(jīng)炎癥、減少自由基毒性的作用，有助于減輕SCI后繼發(fā)性損傷[17-18]。

本研究發(fā)現(xiàn)，艾灸組在艾灸即刻溫度上升，考慮與艾灸輻射的熱量有關(guān)。艾灸5 min至30 min大鼠脊髓損傷局部體溫波動不明顯，艾灸停止后40min時，艾灸組大鼠溫度明顯降低，50 min時恢復(fù)至基礎(chǔ)體溫左右，此后溫度波動不明顯。而火針療法針刺后，脊髓損傷局部溫度首先呈現(xiàn)下降的趨勢，毫針組亦呈現(xiàn)出相同的趨勢，即針刺即刻時體溫降低，5min時溫度回升。這可能與針刺的“機(jī)械”刺激引起機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)?；疳樀牟僮鞣椒椤八俅碳渤觥?，但在干預(yù)5min后，脊髓損傷局部溫度呈緩慢上升趨勢，升高0.5℃左右且升溫過程持續(xù)至干預(yù)90 min，與艾灸組表現(xiàn)不同，這可能是火針的“溫通”效應(yīng)的獨特表現(xiàn)。

同時本研究發(fā)現(xiàn)火針療法干預(yù)SCI大鼠后，在7 d和14 d時BBB評分明顯升高，且HSP60的陽性表達(dá)明顯升高，這種升高趨勢在7 d和14 d時最明顯。而TUNEL染色結(jié)果顯示持續(xù)至7 d和14 d時神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況明顯少于模型組，其中火針組在14 d時僅可見少量神經(jīng)細(xì)胞凋亡，這表明毫針、艾灸和火針療法均可有效減輕脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況，其中火針療法作用較為明顯。上述結(jié)果表明火針療法的“溫通”效應(yīng)可能以HSP60為起效靶點，減輕神經(jīng)元凋亡，發(fā)揮改善SCI后神經(jīng)功能缺損的作用。