范闊海，張敏愛，胡燕姣，劉藝，王慧榮，于秀菊*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 實驗動物管理中心，山西 晉中 030801；2.太原海關(guān)技術(shù)中心，山西 太原 030000；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西 晉中 030801）

活化T 細胞c1 核因子（nuclear factor of activated T-cells，NFATc1）是NFAT 家族成員之一，主要參與調(diào)控細胞的增殖、分化、凋亡、炎癥反應(yīng)、血管生成和腫瘤的發(fā)生發(fā)展［1-2］，近年來的研究證實，NFATc1 表達于哺乳動物多種組織中［3］，并且發(fā)現(xiàn)其在免疫系統(tǒng)和被皮系統(tǒng)中也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。 相關(guān)研究表明：紫外線會降低NFATc1 的磷酸化水平，導(dǎo)致基質(zhì)金屬蛋白酶活性增加、膠原蛋白降解，從而引發(fā)皺紋的形成。Hwang 等研究證明，蕁麻、羽衣草和消皮素C 等藥物可以通過調(diào)控NFATc1 的轉(zhuǎn)錄水平從而降低紫外線對皮膚造成的傷害［4-6］。Hariri 等在對Axenfeld Rieger 綜合征患者進行基因分析和表型變化的研究中發(fā)現(xiàn)，Nfatc1基因的突變會導(dǎo)致毛囊細胞的 退 化 和 汗 腺 的 缺 失［7］。 Horsley 等 制 備 的NFATc1 缺失型小鼠表現(xiàn)為毛發(fā)的過度生長，并對該現(xiàn)象的分子機制進行研究發(fā)現(xiàn)NFATc1 具有維持毛囊干細胞保持靜止?fàn)顟B(tài)的生物學(xué)功能，NFATc1 的缺失導(dǎo)致毛囊干細胞被激活，毛囊始終處于生長時期，從而引發(fā)毛發(fā)生長過剩［8］。

毛囊作為皮膚中重要的附屬結(jié)構(gòu)，對于人和動物都具有重要的意義。其生長呈現(xiàn)周期性的變化過程，大致分為3 個時期：毛囊生長期（Anagen）、退 化 期（Catagen）和 相 對 靜 止 期（Telogen）［9］。各種動物的毛囊生長周期的時間長短不同，例如：小鼠的毛囊生長周期約為28 d［10］。毛囊的周期變化受到Hox 基因、角蛋白（Keratins）、βcatenin 等一系列的基因和蛋白的調(diào)控。近年來研究發(fā)現(xiàn)，毛囊的周期性變化與毛囊干細胞的激活與否有著密切的關(guān)系。截至目前，已經(jīng)證明的毛囊干細胞標(biāo)記物有多種，主要包括CD34，還有Lhx2、Sox9、Tcf3、Nfatc1等轉(zhuǎn)錄因子［11-12］。前面的研究表明NFATc1 與毛囊干細胞具有密切的關(guān)系，但在小鼠自然毛囊生長周期性中的作用如何尚不清楚。本研究通過免疫組織化學(xué)，熒光定量PCR 和Western blotting 技術(shù)對NFATc1 在小鼠毛囊生長周期中的組織定位、mRNA 和蛋白表達量進行分析，探尋NFATc1 在小鼠毛囊周期性生長過程中發(fā)揮的作用。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

20 只2 月齡的ICR 小鼠（屬于Swiss 小鼠，由美國癌癥研究所（Institute of Cancer Research）的3個首字母命名，是國際通用的封閉群小鼠，具有繁殖力高、適應(yīng)性強和實驗重復(fù)性較好的特點），雌雄各半，體重（20±2）g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。飼養(yǎng)條件為：溫度（23±1）℃，濕度為45%左右，自由采食和飲水。交配確定受孕后將雌鼠單獨飼喂，選擇同一天生產(chǎn)的5 窩小鼠，于出生后的第15 天（處于毛囊生長期），第19 天（處于毛囊退化期）和第21 天（處于毛囊相對靜止期），每窩取1 只小鼠，麻醉后取其背部皮膚，將其皮膚組織置于Bouins 固定液中固定24 h，70%～100%的梯度酒精脫水，1∶1 酒精與二甲苯處理后，二甲苯透明后浸蠟包埋，制成厚度為5 μm 的石蠟切片，用于免疫組織化學(xué)分析；將其部分皮膚組織置于液氮中保存，按照Trizol 法和組織總蛋白抽提試劑盒的方法分別提取小鼠皮膚的總RNA 和總蛋白，用于熒光定量PCR 和Western blotting 檢測。兔抗NFATc1 多克隆抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；β-actin 多克隆抗體和HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 購自北京康為世紀生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR 試劑盒購自寶生物（大連）工程有限公司，組織蛋白抽提試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)分析

制備好的石蠟組織切片，二甲苯脫蠟，70%～100%的梯度酒精復(fù)水至蒸餾水；3%過氧化氫用于去除內(nèi)源性的過氧化物酶，PBS 洗3 次，每次5 min；5%非免疫性牛血清作為封閉液，37 ℃孵育30 min；去除封閉液后滴加1∶100 兔抗NFATc1 多克隆抗體，室溫孵育30 min，4 ℃過夜孵育，室溫孵育30 min；PBS 洗3 次，每次5 min，滴加HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG，37 ℃孵育30 min，PBS 洗滌3 次，每次5 min；滴加DAB 顯色劑顯色3 至5 min，PBS洗3 次，每次5 min；蘇木精輕度復(fù)染，70%～100%的梯度酒精脫水后二甲苯透明，中性樹膠封片。非免疫牛血清代替一抗作為陰性對照。

通過Image-Pro Plus 6.0 軟件對NFATc1 蛋白在小鼠皮膚組織中的免疫組織化學(xué)結(jié)果進行光密度的測定，每個時期的3 只小鼠皮膚組織切片中分別取5 個視野，獲得陽性細胞的光密度值。所得數(shù)據(jù)用SPSS 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。分析結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SE）來表示。

1.2.2 熒光定量PCR 分析

電泳檢測提取的小鼠皮膚總RNA 的完整性，ND-1000 超微量核酸蛋白測定儀測定其濃度并將各個樣本的濃度調(diào)至同一濃度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒提供的方法完成cDNA 的合成。

根據(jù)NCBI 小鼠Nfatc1的基因序列，借助Primer5.0 軟件，設(shè)計用于熒光定量PCR 檢測的特異性引物，并由上海生工生物工程有限公司進行合成。引物序列為：Forward primer：5’-CCCGTCACATTCTGGTCC-3’，Reverse primer：5’-GCTGCCTTCCGTCTCATAG-3’。以合成cDNA 為模板，以特異性引物進行熒光定量PCR 分析，反應(yīng)在八連管中進行。反應(yīng)體系為：TB Green Fast qPCR Mix（2×）12.5 μL、Forward primer 1 μL、Reverse primer 1 μL、cDNA 2 μL、ROX Reference Dye II（50×）0.5 μL、加dH2O 至25 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃5 s，60 ℃10 s，40個循環(huán)。每個樣本、Nfatc1基因、β-actin基因3 個重復(fù)。由熔解曲線判斷PCR 的特異性，根據(jù)熒光曲線獲得CT值，利用2-△△CT分析定量的結(jié)果。

1.2.3 Western blotting 檢測

BCA 法測定提取的小鼠皮膚總蛋白的濃度，并將各個樣品的蛋白濃度歸至同一濃度。每個樣品總蛋白上樣量為200 μg，在8%的SDS-PAGE進行電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF 膜。PVDF 膜于5%脫脂蛋白粉封閉液中孵育1h，孵育一抗（1∶1000 兔抗NFATc1 多克隆抗體；1∶500 兔抗β-actin 多克隆抗體），室溫放置30 min，4 ℃孵育過夜，室溫放置1 h。TBST 洗膜3 次，每次5 min，孵育二抗（1∶10 000，HRP-山羊抗兔IgG），37 ℃孵育1 h。TBST洗膜4 次，每次10 min。運用ECL 試劑盒進行曝光之后對其信號條帶掃描。使用Image J 軟件對小鼠毛囊不同生長時期的皮膚組織中NFATc1 和β-actin 蛋白的灰度值進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 NFATc1 在小鼠毛囊生長周期中的定位

NFATc1 的免疫組化陽性反應(yīng)物主要分布于毛囊的膨大部、根鞘、皮脂腺和表皮，在毛囊生長的3 個時期均有表達，但在不同的毛囊生長時期表達量存在差異。在毛囊的生長期，毛纖維生長茂盛，整個毛囊的長度不斷增長達到最長，毛囊乳頭直徑顯著大于根鞘部直徑，在毛囊的根鞘部、皮脂腺和表皮可見NFATc1 的陽性反應(yīng)物（圖1A）；毛囊進入退化期，毛囊乳頭萎縮成杵形的圓狀結(jié)構(gòu)，整個毛囊的長度明顯變短，這個時期，在毛囊的膨大部、皮脂腺和表皮存在NFATc1 較強的陽性表達物（圖1B）；在短暫的退化期（小鼠3 d 左右）后毛囊進入相對靜止期（圖1C）：毛芽生長，膨大部的干細胞不斷分化成內(nèi)根鞘和毛干向上推移，接近“杵形毛”，杵形毛最終脫落，從而新毛占據(jù)舊毛穴。在毛囊的相對靜止期，NFATc1 的陽性物主要是在毛囊的膨大部。對照組中均未見陽性反應(yīng)（圖1D～圖1F）。NFATc1 在毛囊生長期、退化期和相對靜止期的平均光密度值分別是0.17±0.012 0、0.48±0.014 7 和0.23±0.001 8。

圖1 NFATc1 在小鼠生長周期中的免疫組織化學(xué)染色Fig.1 Immunohistochemistry of NFATc1 in the hair follicle cycle in mice

2.2 NFATc1 在小鼠毛囊生長周期中的基因表達差異分析

熒光定量PCR 的擴增曲線符合標(biāo)準(zhǔn)的“S”形曲線，Nfatc1和β-actin基因的擴增曲線平行性較好，拐點清楚，基線平而無上揚情況。熔解曲線集中有2 個峰，表明Nfatc1和β-actin沒有產(chǎn)生引物二聚體，產(chǎn)物單一。Nfatc1基因在毛囊生長期、退化期和相對靜止期的mRNA 表達量變化分析結(jié)果顯示（圖2）：Nfatc1在毛囊生長期的mRNA 表達量最低；在毛囊退化期的mRNA 表達量顯著高于毛囊生長期和相對靜止期，是毛囊生長期的3.34 倍；毛囊相對靜止期，Nfatc1的mRNA 表達量有所下降，是生長期的2.3 倍。

與毛囊生長期比較，**P＜0.01，下同Compared with Anagen，**P＜0.01，The same below

2.3 NFATc1 在小鼠毛囊生長周期中的蛋白量差異分析

在小鼠毛囊的生長期、退化期和相對靜止期皮膚組織中各期小鼠皮膚中均存在與NFATc1 多克隆抗體結(jié)合的蛋白條帶，蛋白條帶的大小約為120 kDa，通過Image J 軟件對蛋白灰度值進行分析得出，NFATc1 在小鼠毛囊生長的3 個時期的表達量存在差異，其蛋白在毛囊退化期的表達量顯著高于毛囊生長期和相對靜止期（圖3）。

圖3 NFATc1 在小鼠生長周期中的蛋白表達水平分析Fig.3 NFATc1 protein expression levels in in the hair follicle cycle in mice.

3 討論

毛發(fā)對于人和動物都具有重要的作用。毛囊是毛發(fā)數(shù)量和生長所依賴的基本組織結(jié)構(gòu)單元［13］。毛囊作為皮膚中的特有器官，毛囊發(fā)育形成后，其上半部分在出生后是恒定不變的，稱之為“永久部”；而毛囊的下半部分處于循環(huán)變化之中，稱之為“循環(huán)部”。根據(jù)毛囊生長過程中的結(jié)構(gòu)特征將其大致分為：毛囊生長期、毛囊退化期和毛囊相對靜止期［14］。毛囊的周期性變化呈現(xiàn)為毛纖維的生長和脫落。本研究結(jié)果顯示：小鼠處于生長期的毛囊形態(tài)為毛乳頭增大，干細胞被激活，毛根鞘分化增殖，毛干不斷增長；進入退化期的小鼠毛囊，毛乳頭萎縮，該時期干細胞處于靜止?fàn)顟B(tài)，根鞘增殖停止，小鼠毛囊退化期為3 天左右；在短暫的退化期后小鼠毛囊進入相對靜止期，在該階段毛發(fā)容易脫落，毛囊干細胞被活化，毛囊乳頭不斷增大，根鞘生長旺盛，新的毛發(fā)不斷向上生長將舊的毛發(fā)頂至脫落，占據(jù)舊毛穴［15-16］，毛囊進入了下一個毛囊生長周期。毛囊生長周期包括增殖、分化、遷移以及凋亡等一系列過程，并受多種生長因子、細胞因子、激素、神經(jīng)肽和藥物的影響和調(diào)控［17］。近年來研究證實：毛囊的再生依賴于毛囊干細胞在毛發(fā)周期的相對靜止期向生長期過渡過程中的激活［18］，這個過程受到內(nèi)在和環(huán)境因素的嚴格控制。毛囊干細胞位于毛囊的膨大部（Bulge），它可分化產(chǎn)生毛基質(zhì)的祖細胞，進而分化向上推移，形成毛囊的內(nèi)根鞘和毛干。隨著基質(zhì)細胞的分化，膨大部的毛囊干細胞在毛囊生長期處于一個短暫的對稱自我更新階段，最后在退化期再次回到靜止?fàn)顟B(tài)［19］。Hu 等報道，源于毛乳頭的Wnt 信號和BMP 信號與毛囊的生長有關(guān)，Wnt/β-catenin 信號通路通過激活毛囊干細胞從而在毛生長過程中發(fā)揮重要的促進作用，BMP 信號通路抑制毛囊干細胞的激活，而TGF-β2 信號可以拮抗BMP 促進毛囊的再生。這兩個信號通路均通過β-catenin、TCF、LEF1 轉(zhuǎn)錄因子進而調(diào)控相關(guān)靶基因的表達來激活或抑制毛囊干細胞的激活［20］。

Blanpain 等在研究中觀察到轉(zhuǎn)錄因子Nfatc1在毛囊的基底細胞和膨大部的表達存在顯著的差異。Yamamoto 等發(fā)現(xiàn)，器官移植過程中使用免疫抑制藥物環(huán)孢霉素A（CSA）后，機體表現(xiàn)為毛發(fā)生長加快，并在進一步研究該現(xiàn)象的機制中證實，CSA 抑制了鈣依賴磷酸酶的表達，該酶的減少導(dǎo)致Nfatc1 的表達量降低，從而毛發(fā)表現(xiàn)為生長加快的現(xiàn)象［21］。大量研究表明，Nfatc1 表達量的降低或是基因缺失，會導(dǎo)致毛發(fā)的過度生長。Gafter-Gvili 根據(jù)實驗結(jié)果提出“NFAT 蛋白在毛囊周期中的退化階段發(fā)揮著重要的作用”［22］。本實驗對NFATc1 蛋白在小鼠毛囊生長周期中的定位進行了研究，結(jié)果顯示NFATc1 蛋白主要定位于毛囊的膨大部，在根鞘、皮脂腺和表皮也有表達，且NFATc1 蛋白在毛囊退化期的膨大部呈強陽性表達，NFATc1 蛋白的陽性反應(yīng)定位于毛囊干細胞的定殖部位吻合，由此得出：NFATc1 蛋白在毛囊干細胞維持靜止?fàn)顟B(tài)中發(fā)揮著重要的作用。Horsley 等在敲除NFATc1 小鼠模型研究中也發(fā)現(xiàn)NFATc1 具有維持毛囊干細胞保持靜止?fàn)顟B(tài)的生物學(xué)功能，NFATc1 的缺失會導(dǎo)致毛囊干細胞被激活，毛囊始終處于生長時期，從而表現(xiàn)毛發(fā)生長過剩［8］。進一步對NFATc1 在小鼠毛囊生長周期中的基因和蛋白表達量進行分析，熒光定量PCR和western blotting 的結(jié)果顯示，NFATc1 在毛囊退化期的mRNA 表達量和蛋白表達量最高，且顯著高于在毛囊生長期和相對靜止期的表達量。

4 結(jié)論

本研究對NFATc1 在小鼠毛囊生長周期中的組織定位和基因蛋白表達量差異進行分析，結(jié)果證明，NFATc1 的表達量與毛囊干細胞的活性呈負相關(guān)，該因子具有抑制小鼠毛囊干細胞的激活的作用，在小鼠毛囊的周期性生長過程中發(fā)揮著重要的作用，為全面揭示毛發(fā)周期性生長的分子調(diào)控機制提供了理論支持。